2株煙草病害拮抗細菌的分離鑒定和發酵條件優化研究

施春蘭，曾舒泉，王志江，謝永輝，詹莜國，黃永迪，吳國星，高 熹，秦得強*

（1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司 昆明市公司，云南 昆明 650051）

0 前言

煙草是我國的主要經濟作物之一，在我國各地廣泛種植，栽培效益高。煙草既可以作為工業原料，又具有一定的醫療作用，如麻醉、鎮痛等。煙草赤星病、黑脛病、根腐病、靶斑病等是煙草生產上的常見病害，其中煙草黑脛病是由煙草疫霉菌侵染引起的一種毀滅性病害，發病嚴重時發病率高達80%；據不完全統計，我國每年由煙草黑脛病造成的損失高達1億元。這些病害一旦發生都會對煙草的產量和質量造成較大的影響［1-4］。生物防治由于具有高效、無污染、無殘留、選擇性高等特點，在煙草病害的防治中發揮了重要作用。生防芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、短小芽孢桿菌(B.pumilis)、多粘芽孢桿菌(B. polymyxa)和蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)等［5］。

盧燦華等［6］以烘烤期煙葉柄部霉病的病原菌為指示菌，進行拮抗菌的篩選，得到了5株有較強抑菌活性的菌株，其中芽孢桿菌(Bacillusspp.)Z002和05-1205菌株對該病的防效都高于70%。李小杰等［7］從健康煙田煙株根際土壤中分離篩選到1株多粘芽孢桿菌LB-9，發現該菌株對煙草疫霉菌的抑制活性達到了60.6%且比較穩定。楊德政等［8］從煙草赤星病發病嚴重的田塊取根際土壤進行生防菌的分離、篩選，得到了1株貝萊斯芽孢桿菌Y6，通過試驗證明其對煙草赤星病具有抑制作用。孫曉宇等［9］研究發現，枯草芽孢桿菌對煙草根腐病菌的菌絲生長和孢子形成都有一定的抑制作用。陳丹陽等［10］從四川省攀枝花健康煙田煙株根際土壤分離得到了貝萊斯芽孢桿菌CDY-6，經過初篩試驗與復篩試驗，發現該菌株對煙草靶斑病菌有顯著的拮抗作用。

土壤一直是生防菌的寶庫，其生防菌不僅種類多，而且活性好，煙草病害的拮抗菌大多數來自土壤［3］。本課題組從土壤中分離并篩選得到了2株對煙草黑脛病、赤星病、靶斑病、根腐病均具有較好抑制作用的拮抗細菌Gj7和Gj9。本研究通過形態特征觀察、生理生化特征測定以及16S rDNA分析，進一步探討了這2株拮抗菌的分類地位，并優化了其發酵條件，旨在為這2個菌株的后續研究及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣及菌株 本試驗在云南農業大學植物保護學院生物化學實驗室進行。2株細菌從健康煙草植株根際土壤中分離得到，土壤采集地為云南省峨山縣小街鎮，菌株編號為Gj7和Gj9，現保存于云南農業大學農藥學實驗室。

1.1.2 供試培養基 營養瓊脂培養基(NA)：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯培養基(PSA)：馬鈴薯20 g/L，蔗糖2 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌30 min。蛋白胨酵母蔗糖培養基(YSP)：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。牛肉膏酵母葡萄糖培養基(NYBD)：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。細菌基礎培養基(CM)：葡萄糖5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨酵母培養基(LB)：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min［11］。

1.2 生防菌的分離

參考尹福強等［12］的方法（略作改動）。稱取待測土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，于振蕩器上振蕩20 min后，對土壤懸液進行梯度稀釋，分別配制成10-5、10-6、10-7稀釋梯度的土壤溶液。再分別取100 μL土壤稀釋液至LB培養皿中進行涂布，并于28 ℃恒溫培養24 h。待形成細菌單菌落后，用接種環分別挑取少許不同的單菌落于新制備的LB培養皿上，進行劃線培養并逐步純化，直至無雜菌產生。

1.3 生防菌抑菌效果的測定

1.3.1 生防菌的平板對峙效果 使用已滅菌的打孔器（直徑5 mm）在已活化的煙草疫霉、根腐病、靶斑病、赤星病菌平板上分別打孔，再分別使用已滅菌的鑷子夾取1塊菌餅接種于另1個新的PSA平板的中央。采用“十字交叉法”將Gj7和Gj9分別對稱接種于PSA平板距菌餅2.5 cm處，再于28 ℃恒溫培養2～3 d，待出現抑菌效果后取出平板，計算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對照，每個處理設置3個重復［11］。

1.3.2 生防菌揮發性氣體對病原菌的抑制效果 采用對扣法［13］進行試驗。將涂有100 μL拮抗菌液的LB固體培養基與接有病原菌的PSA培養基進行對扣培養，將有病原真菌的一方朝下，涂有拮抗菌液體的一方朝上。置于28 ℃恒溫培養箱培養，待對照組菌絲長滿培養皿后取出平板，計算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對照，每個處理設置3個重復。

1.4 生防菌的鑒定

1.4.1 生防菌的形態特征觀察及生理生化特征測定 生防菌的形態特征觀察參考蘭明先等［14］的方法；生防菌的生理生化特征測定和革蘭氏染色分析參考沈萍等［15］《微生物學實驗》中的方法。

1.4.2 生防菌系統發育樹的構建 分別提取Gj7和Gj9菌株的基因組DNA，以此為模板，選擇細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R（5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′)進行PCR擴增。反應體系50 μL：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，Rnase H2O 18 μL。擴增條件為：94.8 ℃預變性2.5 min；98 ℃10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共30個循環；72 ℃延伸2 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將產物送昆明擎科生物公司測序。得到菌株的16S rRNA基因測序結果后，在數據庫中進行BLAST比對。最后，使用Clustal X1.83和MEGA 7軟件分析其系統發育進化關系，并構建進化樹［11］。

1.5 生防菌發酵條件的優化

1.5.1 種子液制備 挑取菌株Gj7和Gj9的單菌落于100 mL的LB液體培養基中，于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養24 h，得到種子液，備用。

1.5.2 最適培養基的優化 參考蘭明先等［16］的方法（有所改動），配制YSP、NYBD、NA、LB和CM培養基各100 mL，分別接入50 μL種子液，于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同培養基中細菌的OD600值，篩選出最佳培養基［17］。每組重復3次，下同。

1.5.3 最適碳源的篩選 以1.5.2篩選出的最適培養基為基礎培養基，分別以乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉作為碳源，培養基中的其他成分均保持不變。于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同碳源培養基中細菌的OD600值，篩選最佳碳源。

1.5.4 最適氮源的篩選 采用上述最適培養基，分別以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、酪氨酸、谷氨酸作為氮源，培養基中的其他成分均保持不變。于28℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同氮源培養基中細菌的OD600值，篩選最佳氮源。

1.5.5 最適接菌量的篩選 采用最適培養基，將種子液分別以0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%（體積分數）的接菌量接入培養基中。于28℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同接菌量處理細菌的OD600值，篩選最佳接菌量。

1.5.6 最適裝液量的篩選 采用最適培養基，將初始裝液量分別換為30、60、90、120、150 mL，接入種子液。于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同裝液量處理細菌的OD600值，篩選最佳裝液量。

1.5.7 最適初始pH值的篩選 采用最適培養基，分別調節其pH值為4、5、6、7、8、9、10，接入種子液，于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，然后測定不同pH值培養基中細菌的OD600值，篩選出培養基的最佳初始pH值。

1.5.8 最適轉速的篩選 采用最適培養基，分別設置搖床的轉速為120、150、180、210、240 r/min，接入種子液，在優化條件下振蕩培養24 h，然后測定培養基中細菌的OD600值，篩選出最佳轉速。

1.5.9 最適溫度的篩選 采用最適培養基，分別設置培養溫度為20、24、28、32、36、40 ℃，接入種子液，在優化條件下振蕩培養24 h，然后測定培養基中細菌的OD600值，篩選出最佳培養溫度。

1.5.10 發酵時間對細菌生長的影響 采用最適培養基，接入種子液，在上述優化條件下培養，在培養0～24 h期間每隔2 h測量1次OD600值，培養24 h后每隔12 h測量1次OD600值，繪制細菌的生長曲線，篩選出最佳培養時間。

1.6 數據分析

使用SPSS 20.0、GraphPad Prism 8.0和Excel 2010軟件對試驗數據進行處理分析和圖表制作；采用Duncan’s新復極差法檢驗不同處理間的差異顯著性。

抑菌率的計算公式［11］為：抑菌率（%）=［（對照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對照平板菌落直徑］×100%。

2 結果與分析

2.1 生防菌的抑菌效果

2.1.1 平板對峙結果 由表1和圖1可以看出：Gj7和Gj9菌株對煙草黑脛病、赤星病、靶斑病以及根腐病菌均有一定的抑制效果，平板抑制效果均超過了60%；這2株菌對煙草靶斑病菌的平板抑制效果最好，抑制率分別達到了76.10%和77.30%。

圖1 2株生防菌對4種煙草病原真菌的抑制效果

表1 Gj7和Gj9菌株對煙草不同病原菌的平板對峙效果

2.1.2 生防菌的揮發性氣體對煙草病菌的抑制效果 由表2可以看出：Gj7和Gj9菌株的揮發性氣體對煙草黑脛病、赤星病、靶斑病、根腐病菌均有抑制效果，其中Gj7對4種病原菌的平板抑制率都超過了55%；Gj9對煙草黑脛病和赤星病菌的平板抑制率都超過了55%，但該菌株對煙草靶斑病和根腐病菌的平板抑制率不高。

表2 Gj7和Gj9的揮發性氣體對煙草不同病原菌的抑制效果

2.2 生防菌的鑒定結果

2.2.1 拮抗菌的形態特征觀察及生理生化特征測定 由圖2可以看出：Gj7在LB培養基培養3 d后，單菌落為圓形、乳白稍黃菌落，表面粗糙不規則，有很多隆起、褶皺，菌體為桿狀，芽孢橢圓形；Gj9單菌落為淡黃色不透明菌落，表面隆起，邊緣不規則，桿狀菌體，芽孢橢圓形；這2個菌株均為革蘭氏陽性菌，其生理生化特征測定結果如表3所示。

圖2 2個菌株的菌落形態及革蘭氏染色結果

表3 菌株Gj7和Gj9的生理生化特征測試結果

2.2.2 拮抗菌的分子鑒定結果 將Gj7和Gj9校對后的序列提交至GenBank數據庫并進行比對，比對結果表明：Gj7與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有較高的相似性，Gj9與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有較高的相似性。下載同源性較高的序列，使用ClustalX 1.83和MEGA 7軟件對這2個菌株進行進化樹的構建。根據構建的進化樹（圖3、圖4），并結合其形態特征和生理生化特征，初步鑒定菌株Gj7為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，Gj9為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。

圖3 基于16S rDNA基因序列構建的Gj9的進化樹

圖4 基于16S rDNA基因序列構建的Gj7的進化樹

2.3 發酵條件優化結果

2.3.1 培養基對細菌生長的影響 從圖5可以看出，Gj9和Gj7菌株在供試的5種培養基上均可生長，但生長情況在不同培養基間存在顯著性差異。具體來說，Gj9、Gj7均在YSP培養基上生長最快，其OD600值分別達到了2.15和2.11；Gj9和Gj7均在CM培養基上生長最慢，其OD600值分別只有0.39和0.03。因此，Gj9和Gj7菌株的最適培養基均為YSP培養基。

圖5 培養基對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.2 不同碳源對細菌生長的影響 如圖6所示：Gj9、Gj7菌株在5種碳源培養基上均可生長；蔗糖為Gj9菌株的最適發酵碳源，其OD600值達1.99；葡萄糖為Gj7菌株的最適發酵碳源，其OD600值達2.03；Gj9和Gj7在碳源為淀粉的培養基上生長均較差，其OD600值分別僅為0.86和0.95。

圖6 不同碳源對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.3 不同氮源對細菌生長的影響 如圖7所示：Gj9、Gj7菌株在NH4Cl、酵母膏、NH4NO3、酪氨酸這4種氮源培養基上均可生長；酵母膏是2個菌株的最適氮源，其OD600值分別達到了2.24和2.12；Gj9和Gj7均幾乎不能在氮源為谷氨酸的培養液中生長，其OD600值分別僅為0.004和0.022。

圖7 不同氮源對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.4 初始接菌量對細菌生長的影響 從圖8可以看出：當初始接菌量為100 μL時，Gj7的OD600值最大，為2.24，因此，100 μL為Gj7的最適初始接菌量；當初始接菌量為2000 μL時，Gj9的OD600值最大（2.11），因此，2000 μL是Gj9的最適初始接菌量。

圖8 初始接菌量對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.5 裝液量對細菌生長的影響 由圖9可見：在不同裝液量處理之間2個菌株的生長均存在顯著性差異；當裝液量為30 mL時，Gj9、Gj7的OD600值均最大，分別達到了2.28和2.48，因此，30 mL是這2個菌株發酵培養的最適裝液量。

圖9 裝液量對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.6 初始pH值對細菌生長的影響 如圖10所示，在不同pH值處理之間2個拮抗細菌菌株的生長均存在顯著性差異。Gj9生長的適宜pH值范圍為6～9，最適pH值為8，此時其OD600值達2.29；Gj7生長的適宜pH值范圍為6～10，最適pH值為10，此時其OD600值達2.36。

圖10 初始pH值對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.7 轉速對細菌生長的影響 如圖11所示，在不同轉速條件下細菌的生長存在顯著性差異。當轉速為240 r/min時，Gj9、Gj7菌株的生長量均達到最大，其OD600值分別達2.24和2.26，所以240 r/min是這2個菌株發酵培養的最適轉速。

圖11 不同轉速對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.8 溫度對細菌生長的影響 從圖12可以看出：Gj9、Gj7在20～40 ℃的溫度范圍內均可生長；Gj9菌株生長的最適溫度為24 ℃，在此條件下其OD600值達2.08；Gj9菌株在40 ℃下的OD600值顯著降低；Gj7菌株生長的最適溫度為36 ℃左右，在此溫度條件下其OD600值為2.15；在20 ℃下Gj7菌株的生長量顯著降低。

圖12 不同溫度對Gj9、Gj7菌株生長的影響

2.3.9 發酵時間對細菌生長的影響 如圖13所示，Gj9、Gj7菌株的生長曲線均類似于“S”形。具體而言，在培養0～4 h期間，2個菌株的生長較為緩慢，該時期為細菌生長的遲緩期；在培養4～14 h期間，Gj7菌株的生長量開始迅速增加，該時期為該菌株生長的對數增長期，在第14 h時其生長速率最高，此時OD600值為2.14；培養4～16 h期間為Gj9菌株生長的對數增長期，該菌株在16 h時達到最大生長量，此時OD600值為2.28；在培養14～22 h期間為Gj7菌株的生長穩定期，16～36 h為Gj9菌株的生長穩定期；第22 h后，Gj7菌株的生長量開始呈現下降趨勢，為生長衰亡期，而Gj9菌株的生長衰亡期在36 h以后。

圖13 發酵時間對Gj9、Gj7菌株生長的影響

3 討論與結論

芽孢桿菌具有使用安全、生長迅速等特性，可以產生耐高溫的芽孢，對逆境有較強的抵抗力，在有氧或無氧環境下均可以生長，而且可以產生諸如伊枯草菌素、細菌素和表面活性素等具有抑菌活性的次級代謝產物，在抑制病原菌生長和繁殖方面具有舉足輕重的作用。芽孢桿菌的生防機制有競爭、拮抗、溶菌、誘導植物產生抗病性和促進植物生長等［18-21］。煙草病害的拮抗菌大多數來源于土壤和植物本體，說明土壤和植物生防菌資源豐富［3］。

筆者從煙草根際土壤中分離得到了2株細菌Gj7和Gj9，這2株菌在平板對峙試驗中對煙草黑脛病、赤星病、根腐病以及靶斑病菌都有較好的抑制效果。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌中的模式菌，該類細菌可以產生包括肽類、酯肽類、氨基酸類等在內的70多種抗菌物質，通過分泌這些抗菌物質對病原真菌和細菌的細胞壁、細胞膜造成破壞，進而發揮抑制作用［22］。枯草芽孢桿菌在細菌性病害、真菌性病害以及病毒病害防治方面都可以發揮作用，例如，芽孢桿菌SH7的代謝產物以及枯草芽孢桿菌T2G6均可以防治煙草青枯病，枯草芽孢桿菌Tpb55對煙草TMV有很好的鈍化、預防治療效果［23］。何明川等［11］從美洲大蠊腸道分離得到的枯草芽孢桿菌MC4-2可用于煙草黑脛病的防治。解淀粉芽孢桿菌作為一類根際促生菌［17］，其在土壤改良以及植物生長方面可以發揮很大的作用，它通過代謝物的拮抗作用、影響致病菌的定殖以及調控植物代謝途徑等方式在植物病害防治方面也可以發揮較大的作用，對由鏈格孢菌［24］、平頭炭疽菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、腐皮鐮刀菌、甘蔗鞭孢堆黑粉菌以及稻梨孢菌等眾多病原菌引致的病害均具有一定的防治效果［25］。

芽孢桿菌在生長過程中能產生芽孢和多種活性物質，可以提高菌株對環境的耐受力［18］。因此通過發酵條件優化試驗探索芽孢桿菌菌株的最適生長條件非常有必要。本研究采用單因素試驗對Gj7和Gj92菌株的基本培養基和發酵條件進行了優化，得出Gj7菌株的最佳發酵培養基配方為蛋白胨1.00 g，酵母浸粉0.50 g，蔗糖2.00 g，蒸餾水100 mL；最佳發酵條件為pH值8，轉速240 r/min，裝液量60 mL，溫度24 ℃，發酵時間22 h。Gj9菌株的最佳發酵培養基配方為蛋白胨1.00 g，酵母浸粉0.50 g，葡萄糖2.00 g，蒸餾水100 mL；最佳發酵條件為pH值6，轉速240 r/min，裝液量30 mL，溫度36 ℃，發酵時間14 h。將Gj7菌株與何明川等［11］從美洲大蠊腸道分離得到的MC4-2枯草芽孢桿菌、張夢君等［26］從根際土壤中分離得到的HXP-5枯草芽孢桿菌的發酵條件進行比較，發現三者的最適溫度分別為24、32、27 ℃，2株來自土壤的枯草芽孢桿菌Gj7和HXP-5的最短溫度相近，而從腸道分離的MC4-2的最適溫度高于30 ℃；三者的最適裝液量分別為60、100、30 mL，相差不大；三者的最佳轉速分別為210、210、240 r/min，無明顯差異；三者的最適氮源均為蛋白胨和酵母浸粉；MC4-2和Gj7的最適碳源均為蔗糖；3株菌生長的最適pH值都在7～8范圍內；菌株MC4-2在培養60 h時生長量達到最大，而Gj7菌株在培養22 h時生長量達到最大。除了最適溫度、最佳發酵時間差異較大外，三者的其他最適條件差異均不明顯。將Gj9菌株與分離自堅尼草的JNC2菌株［27］、分離自土壤的LJ1菌株［28］進行比較，發現三者的最適溫度均在30～34 ℃；最適轉速均在210～240 r/min；最適pH值在5～6之間；Gj9和JNC2的最適氮源均為蛋白胨和酵母浸粉；Gj9和LJ1的最適碳源均為蔗糖；JNC2菌株在培養72 h時生長量達到最大，而LJ和Gj9菌株均在培養14 h時達到最大生長量。綜上所述，即使為同一種菌株，由于來源、生境條件等不同，其生理生化特性及最佳發酵條件也會存在差異。

拮抗細菌的代謝產物在抑制病原菌過程中能發揮重要作用。王智敏等［29］對解淀粉芽孢桿菌JK的揮發性物質進行了研究，發現其揮發性物質含有醛類、酯類、酮類等，其中己醛具有較好的抑菌作用。通過GC-MS分析，發現4-乙基苯酚、2-丙基環己酮這2種成分可能是解淀粉芽孢桿菌LJ02發揮抑菌活性最重要的氣體成分，對黑腐皮殼菌、草莓灰霉病菌、棗漿胞病等病原菌都有很好的抑制作用［30］。通過氣質聯用（GC/MS）法，Chaurasia等［31］發現由1株拮抗枯草芽孢桿菌產生的揮發性物質能導致病原真菌菌絲和孢子的畸形。

上述研究結果為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在植物病害生物防治中的應用提供了科學依據。在本研究中，2株菌對不同的煙草真菌性病菌有較好的抑制效果，其揮發性物質對煙草病原菌也有一定的抑制作用，說明兩者均具有較大的生防潛力。但對其在平板上擴散的抗菌物質與揮發性抗菌物質還有待于深入分析，以提高其應用價值。