洋蔥離體雌核誘導與單倍體愈傷再生體系建立的研究

李威亞，潘美紅，惠林沖，陳 微，張仕林，繆美華，陳振泰，何林玉，楊海峰

（連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000）

洋蔥(Allium cepaL.)是百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)中以肉質鱗片和鱗芽構成產品器官的二年生草本植物，20世紀初傳入我國。目前中國的洋蔥種植面積與總產量均居世界第1位［1-2］。我國洋蔥栽培歷史較短，種質資源相對匱乏，育種水平與國際先進水平相比尚有很大的差距。我國洋蔥育種目前仍以常規選育為主，主要通過引種、雜交、選種等手段選育新品種，存在周期長、工作量大等問題?，F在國內生產上應用的洋蔥主要雜交種仍以引進為主，每年需要花費大量的外匯從國外進口種苗，并且一些進口品種由于適應性等問題，常給生產造成不必要的損失，對進一步擴大洋蔥的生產規模產生了不利的影響。因此選育具有自主知識產權的洋蔥雜交種，解決進口依賴問題，是我國洋蔥生產的當務之急。

洋蔥為典型的異花授粉作物，其常規的親本選育方法具有育種周期長、工作量大、育種效率低等弊端［3-5］。并且與其他植物相比，洋蔥帶有不利的隱性基因，在經過長期異交后其自交系衰退嚴重，通常只能自交2～3次。目前常采用在少量全同胞子代內混合授粉的方法培育洋蔥自交系，這種自交系由于其本身的基因具有一定的雜合度，因此，將其作為雜交親本會在一定程度上影響雜種優勢的表現，而育成1個優良的洋蔥自交系需要6～10 a。洋蔥離體雌核誘導與單倍體愈傷再生技術是直接利用離體花蕾進行誘導培養的方法，促進胚珠內的雌配子發育成單倍體植株，所培養植株的基因型和表現型是相同的，可以方便地鑒定出所需要的個體；同時結合愈傷再成苗技術，可以快速地形成單倍體純系群體，便于加倍誘導、篩選和相關研究利用，而且能夠應用于優質材料的快速繁育［6-7］。單倍體群體通過自然加倍或者人工加倍可以得到正常雙單倍體群體，采用該方法僅需2～3 a時間就可以得到穩定、純合的洋蔥株系；經品質性狀篩選，目標株系既能作為常規種使用，也可以作為親本材料配制雜交種，結合傳統育種方法可大幅提高我國洋蔥的育種效率和水平。此外，采用該技術獲得的雙單倍DH系群體由于不存在基因間顯隱性作用，還是基因多效性分析、目標基因分離、基因精細定位和克隆等研究的理想材料。

本研究以不同熟期、皮色、球型的中日照洋蔥品種為試驗材料，經不同預處理后，采用不同的培養基誘導培養洋蔥的離體花蕾，以獲得單倍體植株；通過比較不同單倍體的誘導率，進一步對洋蔥離體雌核單倍體誘導技術中的材料處理、技術操作及培養基成分進行了優化，以提高誘導出苗率。同時探究了洋蔥單倍體的組培快繁技術，以期為后續加倍誘導等研究提供材料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為連云港市農業科學院自有的5個中日照洋蔥品種，如表1所示。

表1 洋蔥雌核誘導材料

1.2 預處理及培養方法

2019年9月將試驗材料種植于連云港市農業科學院東辛試驗基地，2020年5月收獲鱗莖；將收獲的鱗莖存放在庫房，至2020年10月時再次種植。2021年5月取部分花蕾開放的花薹作試材，用塑料袋包裝后放入4 ℃冰箱，進行2 d的冷藏預處理。選取直徑為3.0～5.5 mm、未開放的花蕾，剪切（留2～3 mm的花梗），用作外植體；用紗布包裹外植體，先用自來水沖洗20 min，然后用70%酒精消毒30 s，最后用超純無菌水沖洗2次。繼續按以下2個方案對外植體進行消毒：（1）放入濃度為10%的NaClO溶液消毒7～10 min，然后用超純無菌水沖洗3次；（2）放入0.1% HgCl2溶液消毒7 min，然后用超純無菌水沖洗3次。消毒完成后，將外植體接種在含有NAA(或2,4-D)和6-BA等不同激素配比的B5培養基中，每個培養瓶接種10個花蕾。每升培養基均加100.0 g蔗糖和6.5 g瓊脂，用1% NaOH調其pH值至6.0；用240 mL規格的培養瓶分裝50 mL培養基，擰上配有透氣孔的瓶蓋后，將培養瓶放入120 ℃高壓鍋內滅菌20 min，冷卻后備用。外植體消毒及移植均按組織培養操作規范于超凈工作臺內完成。將接種的試驗材料放置于25 ℃恒溫、0～35 μmol/(m2·s)光強、16 h/d光照時間的組培室內，誘導培養5個月。

培養的花蕾裂開長出胚狀體后，將胚狀體接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養基中，于25 ℃恒溫、黑暗條件下進行愈傷誘導、擴繁，每20 d繼代培養1次。50 d后，將愈傷組織接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養基上進行再生芽誘導，30 d后將生成的小苗接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養基上進行生根誘導。生成完整植株后，將植株接植于無激素的MS培養基中自由生長。再生芽誘導、生根誘導和植株培養的條件均為25 ℃恒溫、0～35 μmol/(m2·s)光強、16 h/d光照時間。培養基均加30.0 g蔗糖和6.5 g瓊脂，用1% NaOH調其pH值至6.0。胚狀體及生根誘導用直徑240 mL規格的培養瓶分裝30 mL培養基，植株生長培養用250 mL錐形瓶分裝30 mL培養基，均于120 ℃高壓鍋內滅菌20 min。試材移植、繼代培養均按組織培養操作規范于超凈工作臺內完成。

1.3 倍性鑒定、煉苗及定植

再生植株生長至3葉1心后，取植株的新鮮葉片0.5 cm2，置于10 cm直徑的培養皿內，加入1.0 mL Kiwifruit Buffer裂解液，隨后快速用刀片切碎葉片，靜置萃取60 s；將樣品用30 μm孔徑的小濾網過濾至1.5 mL離心管，放置于4 ℃冰箱冷藏5 min。取出樣品離心5 min，倒去上清液，分別加入60 μL預冷的PI染色液和600 μL解離液，于4 ℃黑暗條件下染色15 min。然后采用Beckman Colour流式細胞儀進行測定，以正常二倍體植株為對照，由儀器直接繪制出DNA曲線圖，其縱坐標代表細胞數量，縱坐標峰值的高低反映細胞比例的不同。縱坐標峰值對應的熒光強度X-Mean（橫坐標）與細胞DNA含量成正比，所以可以根據各樣本X-Mean值的比例關系判斷倍性，例如，將對照的二倍體峰調整在橫坐標200位置，則四倍體峰會出現在400位置，三倍體峰會出現在300位置，而峰值仍出現在200位置的則為二倍體。

在倍性檢測完成后，將準備的基質分裝入營養缽，將鑒定篩選的單倍體植株移栽至營養缽中，放置于玻璃溫室馴化生長15 d，然后將4～5葉1心的幼苗移栽至大田，觀察單倍體植株在大田的開花結籽情況，以進一步驗證其倍性。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對離體花蕾培養污染率的影響

從表2可以看出：5個洋蔥品種花蕾外植體經0.1% HgCl2溶液消毒后，在培養后第30天，其污染率為32.3%～48.3%，明顯低于經10% NaClO溶液消毒后的污染率，說明前者的消毒效果明顯優于后者，重金屬汞離子的滲透性較好，可以穿透花蕾萼片等進行深層次消毒。

表2 NaClO和HgCl2溶液對不同洋蔥品種花蕾的消毒效果（培養30 d時）

將未開放的花蕾移植于培養瓶，于組培室培養，第3天開始觀察到污染現象（圖1、圖2）；在培養后7～15 d污染發生最多，在此期間的污染主要是由外植體消毒不徹底或試驗操作不當引起的；此后的污染數慢慢變少，在30 d之后較少出現污染。

圖1 霉菌污染

2.2 離體花蕾的誘導培養發育過程

將離體花蕾接種在含不同配比激素（NAA或2,4-D+6-BA）的B5誘導培養基中培養，從第2天開始有部分花蕾開放。由于培養瓶內氣體環境穩定，花藥和花粉很難接觸到柱頭，第5天花藥開始萎蔫消失。后續花蕾逐漸膨大飽滿，個別花蕾出現脫分化現象或基部出現愈傷組織。培養60 d后花蕾開始萎縮轉黃，個別裂開而長出胚狀體，在培養70～100 d期間胚狀體出現最多，后續逐漸減少（圖3）。

圖2 細菌污染

2.3 不同激素組成對胚狀體誘導效果的影響

含不同配比激素的B5培養基對洋蔥離體花蕾的誘導效果如表3、表4所示。含不同配比激素NAA+6-BA的B5培養基對離體花蕾的誘導成功率（出胚率）明顯低于含不同配比2,4-D+6-BA的，說明2,4-D與6-BA搭配較適合于洋蔥離體雌核胚狀體的誘導。

表3 B5培養基中2,4-D和6-BA濃度對洋蔥離體雌核胚狀體誘導的影響

連蔥11號、連蔥9號、連蔥15號、3號這4個洋蔥品種在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養基中誘導率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為1.5 mg/L的B5培養基中誘導率次之。連蔥17號在2,4-D和6-BA濃度均為1.5 mg/L的B5培養基中誘導率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養基中誘導率次之。說明在B5培養基中2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥離體花蕾雌核胚狀體的誘導發育，1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA的激素配比次之。

2.4 不同品種胚狀體誘導率的差異

據表3、表4數據，3號材料相較于其他品種誘導率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養基中成功誘導出46個胚狀體，出胚率達4.6%；而連蔥17號的誘導率在5個品種中最低，在含1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA 或2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的B5培養基中出胚率只有0.5%或0.2%。在含不同配比NAA+ 6-BA的B5培養基中，只有連蔥15號和3號誘導出胚狀體，且后者的出胚率明顯高于前者的，3號材料在含1.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA的B5培養基中出胚率最高，達1.0%。以上結果說明不同基因型洋蔥離體雌核胚狀體誘導對激素種類和濃度的要求不同。

2.5 愈傷擴繁與植株再生

將胚狀體移植在含不同配比2,4-D和6-BA的MS培養基上進行愈傷擴繁和成苗誘導培養，供試培養基及其激素配比如表5所示。

表5 MS培養基中2,4-D和6-BA的濃度設置 mg/L

胚狀體在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養基上生長成正常植株，但無愈傷出現。5個品種材料在含1.5 mg/L 2,4-D+2.5 mg/L 6-BA的MS培養基上均誘導出愈傷組織，且愈傷誘導率均接近100%，說明該培養基組成較適于離體雌核胚狀體的愈傷誘導。

連蔥9號、連蔥17號和連蔥11號產生的愈傷組織在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養基上再生芽誘導成功率最高，均在75%左右。3號材料的愈傷組織在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養基上再生芽誘導成功率在30%左右，而連蔥15號在此培養基上未產生再生芽。

連蔥9號、連蔥17號、連蔥11號和3號的再生芽在只含0.5 mg/L 2,4-D的MS培養基上培養，1周內均產生了根系；這4個品種材料在未添加任何激素的MS培養基上也產生了正常根系，但所需時間較長，說明一定濃度的2,4-D能促進再生芽的根系產生（圖4）。

2.6 倍性鑒定及煉苗定植

取3葉1心的洋蔥胚狀體再生幼苗葉片，以二倍體正常植株為對照，利用流式細胞儀進行倍性檢測。如圖5所示：僅有2個3號材料的離體花蕾誘導植株群體顯現出二倍體波峰；其余材料均顯現出單倍體波峰，單倍體誘導率達97%以上。與染色體計數等傳統方法相比，流式細胞儀倍性檢測方法簡便、迅速，可應用于再生誘導植株大群體的倍性檢測。

將篩選得到的單倍體植株移栽至裝有基質的營養缽中，放置于玻璃溫室進行煉苗；待幼苗生長至4～5葉1心時將其移栽至大田。按照該煉苗、定植步驟，洋蔥單倍體植株在大田的定植存活率在90%以上。

3 討論

單倍體育種作為一種新的育種途徑，與常規選育法相比，其在較短時間內便可以選育出整齊一致的純系，在育種時間和成本上都有很大的優勢，因此日益受到研究人員與育種家們的重視。迄今，已經成功建立了多種作物的單倍體育種技術體系，并育成了相應的新品種，如辣椒、茄子、大白菜、水稻、玉米等［8-14］。本研究以建立洋蔥單倍體育種技術體系為目標，利用洋蔥的離體花蕾進行雌核單倍體的誘導，結果胚狀體的誘導成功率最高達4.6%，單倍體的誘導成功率達97%。單倍體再生植株的大田存活率達90%以上，并提高了鑒定、篩選優質材料的效率和準確性，解決了洋蔥育種周期長、選育品種性狀整齊度差等問題。

本研究的5個洋蔥品種材料在熟期、皮色等性狀特征上有較大的區別，它們的雌核誘導和愈傷、擴繁結果也有較大的差異，說明不同基因型材料對培養基和激素配比的適應性不同。今后擬進一步篩選、優化適于不同基因型材料的特定培養基，以進一步提高洋蔥單倍體育種的效率。

今后有必要進一步研究洋蔥單倍體植株形成的分子、細胞、生物學機制，建立切實可行的雙單倍加倍技術體系，完善洋蔥單倍體育種技術體系。同時，應研究不同染色體倍性對洋蔥特定表型性狀、物質合成的影響，以及單個基因不同倍性的作用機制及其表達效應，填補國內外在該研究領域的空白。

4 結論

洋蔥的離體花蕾外植體適宜采用0.1% HgCl2溶液消毒。在B5培養基中，2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥離體花蕾雌核胚狀體的誘導，出胚率最高達4.6%；在MS培養基中，1.5 mg/L 2,4-D+2.5 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥雌核胚狀體的愈傷誘導，誘導率接近100%；在不含任何激素的MS培養基中，再生芽的誘導成功率最高，達75%左右；在只含0.5 mg/L 2,4-D的MS培養基中，再生芽均能誘導出根系。

經流式細胞儀鑒定，采用以上外植體消毒、培養基和激素配比等培養條件，洋蔥離體雌核單倍體的誘導成功率達97%。洋蔥單倍體植株移栽至裝有基質的營養缽中，放置于玻璃溫室進行煉苗，在大田定植后存活率在90%以上。