紫錐菊近三倍體的非整倍體離體擴繁能力分析

李慶玲，黎幸蓮，戴 倩，楊躍生*

（1.云浮市南藥研究院，廣東 云浮 527300；2.華南農業大學 生命科學學院，廣東 廣州 510642）

紫錐菊(Echinacea purpureaL. )為菊科(Asteraceae)紫錐菊屬(EchinaceaL.)植物，原產于北美，因具有抗菌、消炎、提升人體免疫力等藥用功效而備受市場青睞。同時，紫錐菊又因花色鮮艷，花期長，而廣泛用于園藝植物觀賞和切花生產。與觀賞紫錐菊育種［1］相比，藥用成分含量高的藥用紫錐菊品種的培育相對滯后，且藥用成分含量在紫錐菊新品種審定中是非常重要的指標。倍性育種是一種重要的生物技術育種方法，相對于低倍體，多倍體具有營養器官巨大化和次生代謝產物含量更高等優點。多倍體尤其是三倍體在有性繁殖過程中非常容易產生非整倍體后代［2-3］。非整倍體由于特定染色體的附加或減少會使得位于該染色體上的基因劑量增加或減少，相對于二倍體和四倍體，性狀變化具有多樣性；同時，非整倍體具有重要的遺傳學價值，如探究基因與染色體的關系，確定基因所屬的連鎖群或染色體臂等。與動物相比，植物對非整倍體具有更強的忍耐力［4］，如香豌豆(Lathyrus sativusL.)［5］、蘋果屬(Malus)［6］和菊科植物［7］等的非整倍體均可以健壯生長并作為遺傳研究材料或者種質資源在育種上應用，這使得植物的繁殖方式更加多樣化，通過大量培育具有不同染色體數目和構成的非整倍體材料以達到繁育的目標。

云浮市南藥研究院/華南農業大學楊躍生研究員課題組從2003年開始從事紫錐菊倍性育種研究，相繼成功培育出單倍體［8］、四倍體［9］、三倍體、六倍體［10］、和八倍體［11］等植株。相對于二倍體，四倍體表現出更粗壯的植株長勢和更高的藥用物質含量［12-13］。紫錐菊多倍體，尤其是三倍體與二倍體自然雜交授粉產生大量非整倍體后代，Li等［3］在比對二、三倍體雜交后代的21個非整倍體株系時發現，13個株系的全株菊苣酸含量高于二、三倍體親本，其中有5個株系的全株菊苣酸含量接近二、三倍體親本的2倍以上；有14個非整倍體株系的全株綠原酸含量高于二、三倍體親本，其中有1個株系的全株綠原酸含量接近二、三倍體親本的5倍。紫錐菊四倍體也被報道過含有更高的菊苣酸和綠原酸含量［12-14］，但還沒有達到非整倍體的增長幅度。

因非整倍體育性降低，不能正常進行有性生殖，必須通過無性擴繁的方式進行繁殖。本課題組在二、四倍體雜交過程中發現了接近三倍體的非整倍體株系，通過對其中4個非整倍體株系（染色體數目分別為31、32、32和34條，分別命名為CN31、CN32-1、CN32-2、CN34）系統性地開展離體擴繁能力研究，以期為后續選育和批量繁殖優良非整倍體株系提供參考。

1 材料與方法

1.1 外植體制備及接種方式

1.1.1 不定芽誘導 切取無菌克隆苗的葉片、葉柄和根作為外植體。葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小方塊，葉柄和根均切成0.7 cm的長度。外植體接種時，以葉片的上表面接觸培養基，葉柄和根外植體則隨機平放在培養基上并稍加按壓使其與培養基緊密接觸。每個培養瓶接種7個外植體，每個處理設6次重復。

1.1.2 不定芽生根 將高約2 cm，生長狀態正常，至少有2片展開葉的不定芽接種至生根培養基上，30 d后觀察并統計根系形成情況。

1.2 培養基配制

在培養基中添加了試驗劑量的激素、非激素等成分后，另外添加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂、0.1 g/L肌醇，用透氣性好的塑料瓶分裝，每個培養瓶分裝約40 mL；所有培養基pH值調至6.0，于121 ℃、100 kPa濕熱滅菌15 min。

1.3 培養條件

不定芽誘導、不定芽生根試驗均在（25±2）℃的恒溫培養室中進行，正常光照時間約12 h/d，光強約2000 lx。

1.4 數據統計

紫錐菊在不定芽誘導過程中會產生玻璃化不定芽，這類不定芽不能正常生根，且隨著時間的延長會逐漸褐化死亡，為無效芽。因此，本研究在不定芽誘導過程中只統計每個外植體誘導的有效不定芽數，每個培養瓶取平均值。試驗數據采用SPSS 17.0數據處理系統和Excel 2010軟件進行統計分析，采用Duncan’s法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 激素對紫錐菊非整倍體有效不定芽誘導的影響

2.1.1 BA BA是一種最常用的植物細胞分裂素，對紫錐菊不定芽誘導有良好的刺激作用。4個非整倍體株系葉片、葉柄和根外植體誘導的不定芽分化情況如圖1所示。直觀上看，CN31不定芽數最多，誘導效果最好，且4個非整倍體株系葉片的誘導效果優于葉柄和根外植體的。

圖1 4個紫錐菊非整倍體株系葉片、葉柄和根外植體的不定芽誘導情況

本研究設定的BA質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L，在一定的范圍內，隨BA質量濃度遞增，4個非整倍體株系誘導的有效不定芽數遞增，不同非整倍體株系及其不同的外植體對BA的敏感度不同（表1）。當CN31的葉片在添加0.8 mg/L BA培養基中誘導時，其有效不定芽數最多，為1.96個；在添加0.4 mg/L BA培養基中的誘導效果次之，但兩者差異不顯著；葉柄和根的最適BA質量濃度為0.4 mg/L，此時有效不定芽數分別為1.38個和2.04個。CN32-1葉片外植體不定芽誘導的最適BA質量濃度為0.4 mg/L，葉柄、根的分別為0.1、0.2 mg/L；葉柄外植體的有效不定芽數高于葉片和根的。CN32-2的葉片、葉柄、根外植體的最適BA濃度分別為0.8、0.4和0.4 mg/L，不定芽誘導率整體較低。CN34的葉片和葉柄外植體在添加0.4 mg/L BA時，有效不定芽數最多，分別為1.13、1.03個；根在添加0.2 mg/L BA時有效不定芽數最多，但也只有0.53個。綜上，取0.4 mg/L BA對4個非整倍體誘導不定芽較為適宜，CN31的不定芽誘導能力優于其他3個株系的。

表1 不同BA質量濃度對紫錐菊非整倍體有效不定芽數的影響 個

2.1.2 NAA NAA是一種人工合成的植物生長素，與IAA相比能耐高溫、不易降解，因此廣泛應用于植物組織培養技術中。本研究設定的NAA質量濃度分別為0(CK)、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025和0.030 mg/L，與含0.4 mg/L BA的MS培養基配合使用。由表2可知，NAA顯著影響非整倍體紫錐菊不定芽誘導，隨NAA質量濃度的升高，紫錐菊不定芽誘導率明顯升高，到達高值后誘導率逐漸下降。CN31在添加0.015 mg/L NAA時，葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽數均達到最大值，且與其他處理差異明顯。CN32-1葉片和根外植體不定芽誘導的最佳NAA質量濃度為0.010 mg/L，而葉柄的為0.015 mg/L。CN32-2和CN34葉片外植體對NAA的耐受性較高，在添加0.025 mg/L NAA時有最多有效不定芽；葉柄和根外植體的最適NAA質量濃度均為0.020 mg/L。綜上，CN31誘導的有效不定芽數高于其他3個株系的。

表2 不同NAA質量濃度對紫錐菊非整倍體株系有效不定芽數的影響 個

2.1.3 DA-6 DA-6是一種高效植物生長物質，具有很高的生物活性，對多種農作物具有顯著的增產、抗逆、抗病，改善品質、催熟等功效。本研究設置6個DA-6質量濃度：0（CK）、0.02、0.04、0.08、0.16和0.32 mg/L，配合添加了0.01 mg/L NAA、0.4 mg/L BA的MS培養基使用。由表3可知，4個非整倍體株系及其不同外植體對DA-6的敏感程度不同，其中，根對DA-6最為敏感，僅在濃度很低時能促進不定芽再生；葉片的敏感度次之；葉柄則在較高DA-6濃度時才表現出促進作用。CN31葉片和根外植體在0.04 mg/L DA-6時有效不定芽數最高，而葉柄的最佳DA-6質量濃度為0.08 mg/L，平均每個外植體有效不定芽數為3.50個，高于葉片和根外植體的。CN32-1葉片和葉柄的最佳DA-6質量濃度分別為0.08和0.16 mg/L，DA-6對根無明顯的促進作用。CN32-2葉片和葉柄外植體分別在添加0.02和0.04 mg/L DA-6時，有效不定芽數最高，對葉柄的促進作用尤其明顯，添加0.02 mg/L DA-6對根外植體表現出微弱促進作用，當添加量高于0.02 mg/L時就開始抑制不定芽再生。在添加0.04 mg/L DA-6時，CN34葉片和葉柄外植體有效不定芽數最高，對葉片的促進作用更為明顯；添加0.02 mg/L DA-6對根外植體有微弱的促進作用。

表3 不同DA-6質量濃度對紫錐菊非整倍體植株有效不定芽數量的影響 個

2.2 非激素條件對紫錐菊非整倍體有效不定芽誘導的影響

2.2.1 MS大量元素 大量元素含有豐富的礦質元素，是組培實驗室或工廠使用量最大的耗材之一。為探究不同比例的MS大量元素對紫錐菊非整倍體不定芽誘導的影響，本試驗設定MS大量元素為標準比例的1/4、1/2、2倍，以標準比例為對照，4個處理分別表示為：1/4MS、1/2MS、MS和2MS。由表4可知，大量元素比例對紫錐菊不同非整倍體有效不定芽誘導的影響有差別，但最適比例是1/2MS和MS。CN31株系的3種外植體在1/2MS和MS培養基中有效不定芽數最多，CN32-1在1/2MS培養基中有效不定芽數量最高，CN32-2的葉片、葉柄在MS培養基中有效不定芽誘導效果最好，CN34在1/2MS培養基中3種外植體的有效不定芽數量均最佳。如果大量元素比例過低，外植體會因為得不到足夠的礦質營養而逐漸褐化死亡。

表4 不同MS大量元素比例對紫錐菊非整倍體有效不定芽數量的影響 個

2.2.2 土豆泥 本課題組前期研究發現在培養基中添加土豆泥可以減輕玻璃化現象，能提高有效不定芽數量。為進一步優化土豆泥的添加比例，本研究設置5個添加劑量：0（CK）、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%（質量分數），均配合添加0.01 mg/L NAA、0.4 mg/L BA的MS培養基。由表5可知，CN31本身玻璃化嚴重，在添加2.5%土豆泥時3種外植體有效不定芽數量最多，但當添加量超過2.5%時就出現顯著的抑制作用。CN31-2自身玻璃化不嚴重，在添加土豆泥后3種外植體表現不一：葉片對土豆泥不敏感，葉柄在添加5.0%土豆泥時有效不定芽數量最高，根在添加2.5%土豆泥時有效不定芽數最高。添加5.0%的土豆泥能促進CN32-2葉片和葉柄外植體的有效不定芽誘導，對根外植體的促進作用不明顯。CN34本身玻璃化不嚴重，添加2.5%的土豆泥就能促進有效不定芽誘導，添加太多反而起到抑制作用。因此，針對玻璃化嚴重的株系，在培養過程中添加適當比例的土豆泥能有效抑制玻璃化，提高有效不定芽比例；玻璃化不嚴重的株系不必添加土豆泥。

表5 不同土豆泥含量對紫錐菊非整倍體有效不定芽數的影響 個

2.2.3 光暗條件 光照是影響植物生長的重要因素。將4個非整倍體株系的葉片、葉柄和根外植體接種在含0.4 mg/L BA、0.01 mg/L NAA的MS培養基中，分為2組：一組放置于完全黑暗條件下培養2周后轉置正常光照培養，另一組一直置于正常光照下培養。由表6可知，短暫的暗培養可以有效提升葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽誘導能力，但對不同非整倍體株系的提升效果不一致，對CN31的提升效果更為明顯。該結果與本課題組早期在二倍體上的研究結果一致。

表6 光照條件對紫錐菊非整倍體有效不定芽數的影響 個

2.3 NAA對紫錐菊非整倍體生根的影響

本課題組前期研究發現，在誘導紫錐菊的不定芽生根時，NAA比IBA有更好的誘導能力，本試驗設定5個NAA質量濃度：0（CK）、0.01、0.03、0.05和0.08 mg/L。由圖2可知，4個非整倍體株系在不含或含較低質量濃度NAA時，植株長勢較差，根細，次根很少。隨著NAA質量濃度的升高，地上部分隨地下部分的生長而生長，根明顯表現出紫紅色。CN31在添加0.05 mg/L NAA時，植株整體長勢較好；CN32-1的主根數在添加0.08 mg/L NAA時最多，根直徑最粗，考慮地上部分長勢，生根時選擇添加0.05 mg/L NAA；CN32-2根粗隨NAA質量濃度的升高而增加，最優的生根濃度仍為0.05 mg/L NAA；CN34在0.08 mg/L NAA時整體表現出最佳的生長狀態。

3 討論

本研究4個非整倍體株系不同外植體的有效不定芽誘導能力差異較大，整體來講，誘導率整體不高，還需要繼續改良培養基配方［15-17］，以提升繁殖能力。目前，紫錐菊的無性擴繁體系已經建立成熟［10,18］，可以滿足非整倍體繁殖的要求。無菌克隆苗的表型性狀直接決定移栽到室外環境時的成活率，本研究4個非整倍體株系的無菌苗根系發達，地上部分舒展，均可正常移栽到室外種植。Li等［3］在前期21個非整倍體株系研究發現，每一個非整倍體株系都有其特定的核型特征，即使有與親本相同的染色體類型（m、sm、st），但是每種染色體類型占據的比例卻截然不同，另外有少數非整倍體的個別染色體出現了極度縮短的變異；另外，非整倍體還可能會發生染色體缺失/復制/易位、基因組變化和基因表達紊亂等變異［19-20］，所有的這些染色體變異都會引起非整倍體的性狀多樣性［2］。紫錐菊非整倍體所有有關染色體的變異還需要通過核型分析和熒光原位雜交技術等更準確的分析方法進行驗證，以明確非整倍體具體的染色體構成［21-22］。

4 結論

BA和NAA是組織培養過程中不定芽誘導的主要決定因素。4個非整倍體株系及3種外植體對BA、NAA的敏感度不同，CN31的3種外植體的有效不定芽誘導能力優于其他3個非整倍體株系的。DA-6對4個非整倍體株系3種外植體有效不定芽誘導能力的提升作用不明顯。大量元素含有豐富的礦質元素，4個非整倍體株系的3種外植體在1/2MS或MS培養基中會誘導出較多的有效不定芽。針對玻璃化嚴重又很重要的株系，在培養過程中添加適當比例的土豆泥能有效抑制玻璃化，提高有效不定芽比例；玻璃化不嚴重的株系則不必添加土豆泥。短暫的暗培養可以有效提升葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽誘導能力，對CN31的提升效果更為明顯。4個非整倍體株系在添加0.05或0.08 mg/L NAA時的根系更發達，整體表現出最佳生長狀態。