燈盞花素通過調節PDK1表達調控結直腸癌進展的機制研究*

楊 寧，王 瑤，武明爽，郝 玲，王 雷

1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院松北腫瘤內科，黑龍江 哈爾濱 150028；

2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院腫瘤內科，黑龍江 哈爾濱 150000

結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球常見的惡性腫瘤，據統計2018 年全球新發結直腸癌180 多萬例，死亡88.1萬例［1］，世界范圍內結直腸癌癥發病率位于第三位，死亡率位于第二位。我國所處的亞洲也是結直腸癌發病率較高的地區之一。雖然外科手術、化療、靶向治療等治療手段的運用延長了患者的生存時間，但結直腸癌復發轉移以及因此帶來的癌癥相關死亡風險仍然居高不下。

作為中華民族瑰寶的祖國傳統醫藥，近年來越來越多的在臨床惡性腫瘤的治療中發揮出其天然優勢。燈盞花素是從中藥半枝蓮、燈盞花等植物的莖葉中提取的活性單體成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎性反應等特性。近年來隨著燈盞花素藥理作用相關研究的逐漸完善，其抗腫瘤特性漸漸顯露出來。多項研究相繼發現燈盞花素在乳腺癌［2］、淋巴瘤［3］、舌鱗狀細胞癌［4］、結直腸癌［5］和前列腺癌［6］等多種腫瘤中均具有抗腫瘤效應，主要表現在抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成。但對于燈盞花素在結直腸癌中的確切作用機制尚無定論。本研究通過燈盞花素對結直腸癌作用及相關機制的研究，為結直腸癌尋找新的治療靶點和方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料

HCT-116 結直腸癌細胞系（中國科學院細胞庫）。NCM460 正常結腸上皮細胞系（美國典型培養物保藏中心）。燈盞花素購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要試劑與儀器

垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司），DYY-122型電泳儀（北京六一儀表廠），PCR 儀（美國Eppendorf 公司），紫外凝膠檢測成像系統（美國CapitalBio 公司）。AO/EB 試劑盒（美國Invitrogen 公司），MTT（美國Sigma-Aldrich 公司），Hoechst 33342試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 細胞培養、傳代 HCT-116 結直腸癌細胞及NCM460 正常結腸上皮細胞在含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素及50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養，培養瓶置于37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環境的培養箱中，每兩天更換一次培養基。當細胞生長至80%～90%融合時開始進行傳代，加入0.25%的胰蛋白酶消化液2 mL，常溫消化3 min，當大部分貼壁細胞消化釋放變圓時終止消化，用吸管反復吹打形成細胞懸液，分瓶培養。

1.3.2 MTT法檢測HCT-116細胞增殖能力 設置燈盞花素處理組和對照組，選擇對數生長期的細胞接種到96 孔板（104個細胞/孔），燈盞花素處理組分別以a、b兩種給藥方式作用。a 方式：燈盞花素處理每孔分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL，空白對照組加入等量DMSO，作用48 h，倒置顯微鏡觀察。b 方式：燈盞花素處理組每孔細胞分別加入濃度為30 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL，空白對照組加入等量100 uL 的DMSO，分別作用24、48、72 h，倒置顯微鏡觀察。其后每孔加入新鮮配制的MTT 溶液（濃度為5 mg/mL）20 uL，于37 ℃培養箱中繼續孵育4 h，終止培養，懸浮細胞離心后每孔分別加入DMSO 100 uL，低速振蕩使藍色結晶物充分融解。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔在540 nm 處吸光值，記錄結果。分別以藥物濃度和細胞培養時間作為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制曲線。以上實驗需重復3次。

1.3.3 Hoechst 33342 細胞凋亡檢測 參照Invitrogen 公司Hoechst 33342 染色試劑盒說明書操作。將密度為106個細胞/mL 的HCT-116 細胞接種到96 孔板，共分4 組（3 個實驗組，1 個對照組），每組設置3 個重復孔，各實驗組分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 uL，空白組加入等量DMSO，置入37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環境的培養箱，孵育48 h。小心吸去孔內上清液，PBS 清洗1 次，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗一次，加入濃度為20 μg/mL 的Hoechst 33342 工作液100 uL，室溫15 min，吸出熒光染料，倒置熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態并拍照。在熒光顯微鏡下觀察分析：活細胞，細胞核呈均勻一致的藍色；凋亡細胞，細胞核呈亮藍色，且伴有核固縮。以上實驗需重復3次。

1.3.4 AO/EB雙染色法細胞凋亡檢測 參照Invitrogen公司AO/EB 雙染色試劑盒說明書操作。將密度為106/mL 的HCT-116 細胞，接種至96 孔板，每孔體積100 uL，共分4組（3 個實驗組，1 個對照組），每組設置3 個重復孔，各實驗組細胞分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 μL，空白組加入等量DMSO，孵育48 h。隨后各加10 μL AO/EB 工作液，室溫下作用5 min，取上述染色液一滴，滴在潔凈的載玻片上，加上蓋玻片后立即在倒置熒光顯微鏡下觀察鏡下細胞變化和凋亡小體。AO 能透過胞膜完整的細胞，嵌入胞核DNA，使之發出綠色熒光。EB 僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入胞核DNA，發橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察分析：活細胞，核染色質呈綠色；凋亡細胞，核染色質呈橘紅色，固縮狀或圓珠狀。以上實驗需重復3次。

1.3.5 TUNEL 染色法細胞凋亡檢測 參照Roche 公司TUNEL染色試劑盒說明書操作。HCT-116細胞爬片，貼壁后分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液，空白組加入等量DMSO，作用4 h，PBS 清洗3 次，室溫下4%多聚甲醛固定1 h，于冰上用0.1% TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉溶液通透2 min，PBS清洗2次，各孔分別加入50 μL TUNEL 反應混合溶液，在37℃濕盒中避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，隨后加入轉化劑-POD 50 μL，于37 ℃濕盒中繼續孵育30 min，PBS 清洗3 次，載玻片上滴加100 μL DAB 底物溶液，室溫孵育5～10 min，隨時進行鏡下觀察，待染色后立刻用蒸餾水終止反應，蒸餾水沖洗2 次，蘇木素復染，自來水沖洗2 min，80%～100%梯度乙醇脫水，各3 min，二甲苯透明，各5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察分析：活細胞核呈藍色；凋亡細胞核呈棕褐色，固縮狀或圓珠狀。以上實驗需重復3次。

1.3.6 Western blot 檢測PDK1 蛋白表達 濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液處理后的HCT-116細胞、空白對照組HCT-116 細胞及NCM460 正常結腸上皮細胞，分別在37 ℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度環境的培養箱，孵育48 h，收集各組細胞。經預冷的PBS 漂洗3次，每孔加入100 μL 富含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液，5 min 后在4℃條件下14 000 r/min 離心10 min，取上清，使用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質定量。經SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉膜以及含有5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液室溫封閉1 h，加入5%脫脂奶粉稀釋的兔抗PDK1 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的IgG 羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。放入顯像液中1 min顯像，暗室曝光。隨后采用LI-COR DNA 分析系統和Odyssey v1.2 軟件定量分析條帶的灰度，以灰度值作為參照，計算蛋白表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 燈盞花素對HCT-116結直腸癌細胞增殖能力的影響

分別以10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細胞，在酶聯免疫監測儀上測定各孔在540 nm 處吸光值，記錄結果。分別以藥物濃度和細胞培養時間作為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制曲線。MTT實驗結果顯示：10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組以及100 μmol/L 濃度組與空白對照組相比，各實驗組均能夠抑制HCT-116 細胞增殖，且對HCT-116 細胞增殖的抑制程度與作用藥物的濃度具有相關性，隨著藥物濃度逐漸增加，存活細胞數目逐漸減少，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1A。不同濃度的燈盞花素通過劑量—依賴方式抑制結腸癌HCT-116細胞生長。

圖1 燈盞花素對HCT-116細胞增殖的影響

以濃度為30 μmol/L 的燈盞花素溶液分別作用于HCT-116 細胞不同時間（24 h、48 h、72 h），結果顯示：24 h組、48 h 組、72 h 組與空白對照組相比，隨著藥物作用時間的逐漸增加，存活細胞數目逐漸減少，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1B。相同濃度的燈盞花素通過時間—依賴方式抑制結腸癌HCT-116細胞生長。

2.2 Hoechst 33342染色法檢測HCT-116細胞凋亡作用

采用Hoechst 33342 染色法評價不同濃度的燈盞花素對HCT-116 細胞凋亡誘導作用。分別用10、30 以及100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116細胞相同時間，結果顯示：燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細胞分別出現呈亮藍色細胞核的陽性細胞，且伴有染色質凝聚、核固縮等形態改變。并隨給藥濃度增大，陽性細胞增多，凋亡率增加。空白對照組細胞核為均勻一致的藍色，未出現上述異常表現的陽性細胞，見圖2A。

圖2 燈盞花素誘導HCT-116細胞凋亡

2.3 AO/EB雙染色法檢測HCT-116細胞凋亡作用

采用AO/EB 雙染色評價不同濃度燈盞花素對HCT-116細胞凋亡誘導作用。分別用10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細胞相同時間，結果顯示：燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細胞分別出現呈橘紅色細胞核的陽性細胞，且伴有染色質凝聚、核固縮等形態改變。并隨藥物濃度增大，陽性細胞增多，凋亡率增加。空白對照組細胞核為均勻一致的綠色，未出現上述異常表現的陽性細胞，見圖2B。

2.4 TUNEL染色法檢測HCT-116細胞凋亡作用

采用TUNEL 染色法檢測細胞凋亡，凋亡細胞為陽性細胞，鏡下顯示為細胞核呈棕色。非凋亡細胞為陰性細胞，鏡下顯示為細胞核呈藍色。結果顯示：不同濃度的燈盞花素作用后的各實驗組細胞均出現細胞核呈棕色的陽性細胞，且伴有染色質凝聚、核固縮等形態改變。隨藥物濃度增大，陽性細胞增多，凋亡率增加。空白對照組幾乎無TUNEL檢測陽性細胞，見圖2C。

2.5 PDK1在結腸癌細胞中的表達上調

通過Western blot 檢測結直腸癌HCT-116 細胞和正常結腸上皮NCM460 細胞中丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）蛋白表達情況，結果顯示：HCT-116 細胞中PDK1 蛋白表達相較于對照細胞顯著升高，見圖3。

圖3 Western blot檢測PDK1蛋白表達

2.6 燈盞花素抑制PDK1表達

不同濃度10、30、100 μmol/L 的燈盞花素作用于HCT-116 細胞48 h 后，通過Western blot 法檢測作用前后細胞內PDK1 表達的情況。結果顯示：與對照組相比，各實驗組細胞PDK1 蛋白表達量均減少，且蛋白表達量隨藥物濃度增加而下降；其中30 μmol/L 藥物作用實驗組和100 μmol/L 藥物作用實驗組與空白對照組相比具有顯著性差異（*P＜0.05 vs 對照組），10 μmol/L 藥物作用實驗組與空白對照組相比沒有顯著性差異，見圖4。

圖4 Western blot檢測燈盞花素作用后的HCT-116細胞PDK1蛋白表達

3 討論

結腸癌是人類第三大常見的惡性腫瘤，每年全世界有近14 900 例確診患者［7-8］。近年來，結腸癌患病率具有逐年增加的趨勢。當前，結腸癌的治療是以手術結合術后輔助化療為主的綜合性治療［9］。但是，由于結腸癌細胞對大多數化療藥物存在耐藥情況，所有這些治療方法很難控制腫瘤不出現復發或轉移等疾病進展［10］。因此亟待對治療結腸癌新的有效抗腫瘤藥物進行開發和研究。

燈盞花素是一種從中草藥半枝蓮中提取出的主要活性化合物，并已經應用了上百年［11-12］。有報道顯示，燈盞花素具有多種生物學活性，如抗氧化、抗炎、抗細菌等作用，因此被臨床用來治療冠狀動脈疾病、腦血栓形成、腦梗死和高血壓病等［13-14］。近年來，有報道顯示，燈盞花素能夠誘導結腸癌、惡性淋巴瘤和舌癌細胞凋亡，并有一定應用于臨床的潛在可能［14］。例如，燈盞花素能夠通過線粒體通路途徑抑制白血病U937 細胞生長并誘導其細胞凋亡［15］。燈盞花素能夠通過增強Caspase-6 活化從而有效的致敏藥物誘導的結腸癌細胞凋亡［14］。體內研究也同樣證明了燈盞花素在舌癌中能夠通過降低MMP-2 和MMP-9 的表達，顯著減緩腫瘤生長，抑制腫瘤新生血管生成，并導致腫瘤細胞凋亡［16-17］。

本實驗研究結果發現，燈盞花素能夠以時間—依賴和計量—依賴兩種方式顯著性抑制結腸癌HCT-116 細胞增殖，同時具有促進細胞凋亡的雙重作用。且這種抑制腫瘤細胞生長的作用甚至在較低濃度（10 μmol/L）時仍然存在。然而其確切的作用機制尚不清楚。

PDK1 由63kDa 的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）組成，作為AGC激酶家族的一員，是一種重要的蛋白激酶，同時也是AKT 上游的激活劑。PDK1 的結構主要包括兩部分：N末端的激酶結構域及C 末端的血小板—白細胞C 激酶底物同源性結構域（PH domain），通過其在細胞外的受體激活傳導如細胞內部并進行接下來的信號轉導過程［18-19］。其下游PI3K/AKT/mTOR 信號通路與結直腸癌的發生發展存在密切聯系，通路中多種生長因子與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK） 相結合后進一步激活PI3K，使二磷酸肌醇（PIP2）轉化為三磷酸肌醇（PIP3）。PIP3 與AKT 和PDK1 的PH 域結合，隨后PDKl 可通過激活AKT 蛋白的第308 位點的蘇氨酸發生磷酸化從而活化［20-21］。活化后的AKT 可進一步激活下游的一系列底物，如mTOR/p70-S6K、Bad和Bax等，進而影響并調節癌細胞的生長、存活、糖代謝以及細胞遷移和凋亡等多種生物學進程［22-24］。PDK1 是一種強效蛋白激酶，通常與癌癥中的信號級聯改變有關，如PI3K/Akt 信號和Ras/MAPK 信號［22-24］。PDK1的高表達或過度激活能夠導致PI3K/AKT 信號通路的激活，或AKT 非依賴性mTOR 信號通路的激活，進而促進癌癥進展［22-24］。

本研究結果證實了HCT-116 細胞中PDK1 呈高表達，而燈盞花素確作用后能夠使PDK1 的表達量顯著下降。綜上所述，燈盞花素是通過抑制結直腸癌細胞中PDK1 的表達發揮抑制HCT-116細胞增殖并促進細胞凋亡作用，為結直腸癌體外基礎研究提供了新的方向。