基于網絡藥理學和體外細胞實驗驗證探討乳香治療急性腎損傷的作用機制

白 娟,張 琰,洪術霞,史金平,徐麗婷,王 芳

西安國際醫學中心醫院藥學部,西安 710100

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是指多種病因和發病機制引起的突發和持續性腎功能下降,是臨床上常見的危重癥之一,具有較高的發病率、復發率和死亡率。據統計,全球每年約有1 300萬例患者發病,由于治療藥物及策略的缺乏,致使每年約有170萬例患者死亡,并且85%患者在發展中國家[1]。AKI的預防和治療過程中,穩定血壓和提高有效循環血容量非常重要[2],因此,尋找預防和治療AKI的藥物,對挽救該疾病患者生命具有非常重要的意義。中藥具有多成分、多靶點的特點,在防治AKI方面取得了較大的進展[3]。

乳香(olibanum)來源于橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物B.bhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂。性溫,味辛、苦,具有“活血定痛,消腫生肌”的功效,乳香活血止痛功效的主要成分為乳香酸化合物[4]。現代研究表明,乳香具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化等活性[5],基于其作用特點,進一步研究乳香對AKI的作用機制。

本研究通過網絡藥理學對乳香的活性成分進行篩選,構建藥物-活性成分-疾病-靶點網絡,在此基礎上運用體外細胞實驗進行驗證,并闡明乳香防治AKI的作用機制,為其開發為抗急性腎損傷藥物提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 乳香相關成分及靶點預測

通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)數據庫,以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的屬性值篩選出活性成分。結合相關文獻研究[6-8],將與研究主題相關的化合物,仍納入活性成分中。將活性成分輸入Pubchem數據庫,找到Canonical SMILES,再利用SwissTargetPrediction進行靶點預測,輸入成分的Canonical SMILES形式,物種選擇為Homo sapiens,將其中probability >0.1的活性成分的靶基因進行篩選收集。

1.2 急性腎損傷疾病靶點篩選

以“acute kidney injury” “AKI”為關鍵詞,分別通過OMIM數據庫(http://www.omim.org)、DisGeNet數據庫(http://www.disgenet.org/home/)、DRUGBANK數據庫(https://www.DrugBank.ca/)及GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)篩選出疾病相關靶點。

1.3 共有靶點篩選

將篩選后的乳香活性成分靶點和急性腎損傷疾病靶點,統一利用Uniprot數據庫 (https://www.uniprot.org)進行統一規范。通過VENNY 2.1網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖,取得化合物-疾病交集,映射篩選出共同靶點。

1.4 乳香與急性腎損傷共有靶點PPI網絡構建

利用 String數據庫(https://string-db.org),將共有靶點導入,選擇總得分>0.4和“Homo sapiens”,去除無交互作用的單一蛋白,其余均為默認設置,利用Cytoscape 3.7.2軟件將共有靶點PPI網絡可視化,分析篩選出核心靶點。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

使用DAVID數據庫(http://www.david.niaid.nih.gov)將篩選出的乳香與急性腎損傷共有靶點錄入,設置P<0.05,分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析,結果以條形圖或氣泡圖形式呈現,根據核心通路富集程度探究乳香治療AKI的可能作用機制。

1.6 分子對接驗證

將乳香的主要活性成分和靶點進行分子對接驗證。活性成分和靶點使用Pymol和AutoDockTools進行修飾。結合能可用于評價化合物與目標物的結合程度。結合能小于-5 kJ/mol,表明目標物與組分結合效果較好[9]。

1.7 體外細胞實驗方法

1.7.1 實驗材料

α-乳香酸(貨號:20130517,純度≥95%,寶雞辰光生物科技有限公司);DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/鏈霉素溶液(貨號分別為:SH30021、J200033、SH30396、SV30010,Hyclone);CCK-8、IL-1βELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒(貨號分別為:C0037、PI328、PT516,碧云天生物技術有限公司);Hoechst33258(貨號:H1398,Thermo);人腎小管上皮細胞(HK-2),為本實驗室傳代培養獲得;細胞使用DMEM培養液培養。

1.7.2 體外I/R模型制備

取復蘇后第3～4代人近曲腎小管上皮細胞(HK-2),調整細胞終濃度為l×106個/mL,種入6孔培養板,在37 ℃、95% O2、5% CO2環境中培養24 h,當HK-2細胞達到80%匯合時,用Hank′s平衡鹽溶液(含有1.3 mmol/L Ca和0.8 mmol/L Mg)代替培養基。在初步實驗中,我們消耗ATP和葡萄糖,分別用400 μmol/L 抗霉素A(復合物III線粒體電子傳遞抑制劑)和10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖(L-葡萄糖的非代謝異構體)培養4 h,模擬HK-2細胞體外缺血,然后在完全生長培養基中恢復到正常條件(5% CO2和95% O2)24 h以用于復氧和再灌注[10-12]。

1.7.3 實驗分組與細胞增殖實驗

實驗分為對照組(Con)、模型組(Mod)、α-BA低劑量組(α-BA-L,10 μmol/L)、α-BA中劑量組(α-BA-M,20 μmol/L)、α-BA高劑量組(α-BA-H,40 μmol/L)。待HK-2細胞進入指數生長期,DMEM培養液懸浮并調整濃度為5×103個細胞/孔接種到96孔板中。缺血再灌注組用上述方法處理。在模型+治療藥物組中,HK-2分別用I/R和α-BA低、中、高劑量處理24 h。然后加入10 μL CCK-8并將細胞孵育4 h,并使用酶標儀在450 nm下測量吸光度。

1.7.4 細胞凋亡檢測

將細胞以密度為每孔5×105個接種到6孔板中。接種24 h后,細胞貼壁,待細胞充滿培養瓶80%時,加入α-BA,繼續培養24 h后,造體外缺血再灌注模型,造模完成后,吸去上清,用PBS沖洗2遍,用4%多聚甲醛固定15 min,PBS沖洗2遍,每孔加入10 μmol/L Hoechst 33258染色液,染色30 min。用PBS洗2遍,加一滴抗熒光淬滅液。置于熒光顯微鏡下觀察,并隨機拍照。

1.7.5 血清IL-1β、TNF-α表達水平

ELISA法對HK-2細胞培養上清、模型組細胞、α-BA低、中、高劑量組,細胞培養上清液中的IL-1β,TNF-α進行含量測定,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7.6 實時熒光定量PCR法檢測MAPK3和PPARG的相對表達量

取對數生長期的細胞按上述分組進行處理6 h,收集細胞,按照試劑盒說明分別提取各組細胞總RNA。根據逆轉錄試劑盒說明書對提取的mRNA進行逆轉錄。其中MAPK3上游引物序列:5′-CTACACGCAGTTGCAGTACAT-3′,下游引物序列:5′-CAGCAGGATCTGGATCTCCC-3′;PPARG上游引物序列:5′-GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3′,下游引物序列:5′-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3′。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共45個循環。每組設3個復孔,重復3次,以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt計算各目的基因的相對表達量。

1.7.7 統計學處理

2 結果

2.1 網絡藥理學結果

2.1.1 乳香主要活性成分及靶點預測結果

通過TCMSP數據庫初步獲得乳香的活性成分共127個,經過OB值和DL值篩選及文獻補充后,最終獲得主要活性成分共10個(見表1)。活性成分導入SwissTargetPrediction數據庫中進行靶點預測,去除重復值后共得到化學成分相應靶點223個。在Cytoscape中建立了一個具有79個節點和210個邊緣的可視化網絡圖,如圖1所示。

圖1 乳香“化合物-靶點”的可視化網絡圖Fig.1 Visualization network diagram of “compound-target” for olibanum注:淺藍色為乳香;桃粉色為基因靶點。Note:Light blue is olibanum;Peach pink is the gene target.

表1 乳香活性成分

2.1.2 急性腎損傷相關靶點的獲取

檢索OMIM、Disgenet、DrugBank、GeneCards數據庫,獲得急性腎損傷疾病靶點,篩選并去除重復值后得到疾病相應靶點1 245個。

2.1.3 交集靶點韋恩圖繪制

將乳香活性成分靶點與AKI疾病相關靶點取交集得到共有靶點72個,繪制交集靶點基因的韋恩圖(見圖2)。

圖2 乳香-急性腎損傷交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram for the intersection targets of olibanum-AKI

2.1.4 PPI蛋白互作網絡分析

將交集靶點導入String數據庫,獲得PPI蛋白互作網絡信息,利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制靶蛋白PPI網絡(見圖3)。圖中共有71個節點,479條邊緣。根據度值和緊密度進行排序,前5位分別為MAPK3、PPARG、PTGS2、HIF1α和ESR1(見表2),其中degree值越大,圖形越大,顏色越深(紅);combine scores越大,顏色越淺(藍),線條越粗。

圖3 乳香對急性腎損傷作用靶點的PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram of the targets of the action of olibanum on AKI

表2 乳香-急性腎損傷匹配基因注釋及其度值和緊密度

2.1.5 GO功能富集分析

對乳香治療急性腎損傷進行GO功能分析,發現其可能的作用機制。GO富集分析分為3類:分別是生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。GO功能分析得到101個BP,主要有基因表達的正向調控、對缺氧的反應、凋亡過程、血管收縮的正向調節、炎癥反應等;34個CC,主要有整合素復合物、細胞表面、質膜、細胞質、線粒體等;72個MF,主要有酶結合、轉錄共激活因子結合、細胞黏附分子結合、內肽酶活性及MAP激酶活性等。對排名前10的GO功能分析進行展示(見圖4)。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

2.1.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析,共得到117個結果,主要涵蓋包括Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和NF-κB信號通路等,對排名前20的KEGG通路富集分析進行展示(見圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.1.7 分子對接驗證

通過模擬有效成分3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(AKBA)和α-乳香酸(α-BA)分別與AKI潛在藥物核心靶點MAPK3和PPARG對接。AKBA對MAPK3(結合能為-7.79 kJ/mol)和PPARG(結合能為-9.71 kJ/mol)具有較強的結合能力;α-BA對MAPK3(結合能為-8.4 kJ/mol)和PPARG(結合能為-8.23 kJ/mol)的對接能力均較好。分子對接驗證可為進一步研究藥物靶點提供重要的參考依據,對接結果如圖6所示。

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking diagram注:A.AKBA與MAPK3;B.AKBA與PPARG;C.α-BA與MAPK3;D.α-BA與PPARG。Note:A.AKBA and MAPK3;B.AKBA and PPARG;C.α-BA and MAPK3;D.α-BA and PPARG.

2.2 體外細胞實驗結果

2.2.1 細胞活性檢測結果

檢測結果表明,當使用α-BA低、中、高濃度時,HK-2細胞活力與對照組差異無統計學意義(見圖7A);但模型組可顯著抑制HK-2細胞的增殖,α-BA以濃度依賴性方式顯著增強其活力(見圖7B)。

圖7 α-BA對HK-2細胞增殖的影響Fig.7 Effect of α-BA on proliferation of HK-2 注:與對照組比較,*P <0.01;與模型組比較,#P <0.01,下同。 Note:Compared with control group, * P <0.01;Compared with Model group,#P <0.01,the same below.

2.2.2α-BA對腎缺血再灌注細胞凋亡的影響

利用Hoechst 33258染色結果顯示模型組顯著上調凋亡細胞的比例,而α-BA顯著降低其凋亡細胞并呈濃度依賴性(見圖8)。結果表明,α-BA有效抑制I/R誘導的腎近端腎小管細胞凋亡。

圖8 α-BA對I/R誘導HK-2凋亡的影響Fig.8 Effect of α-BA on HK-2 apoptosis induced by

2.2.3α-BA對HK-2細胞中細胞因子TNF-α和IL-1β水平的影響

與對照組比較,模型組細胞中的TNF-α和IL-1β水平顯著性升高;與模型組比較,α-BA給藥組中TNF-α和IL-1β水平降低,且其變化呈現出劑量依

賴性關系(見圖9)。

圖9 HK-2細胞中TNF-α(A)和IL-1β(B)水平Fig.9 Levels of TNF-α (A) and IL-1β (B) in HK-2

2.2.4 HK-2細胞中關鍵靶點基因RT-qPCR檢測結果

本研究選取AKI相關的主要靶點MAPK3和PPARG基因進行驗證。與對照組比較,I/R模型組MAPK3和PPARG基因mRNA明顯上調,與模型組組比較,α-BA低、中、高劑量組MAPK3和PPARG基因mRNA表達均明顯下調,差異均有統計學意義(P<0.01)(見圖10)。

圖10 α-BA對關鍵靶點基因mRNA的影響Fig.10 Effect of α-BA on the mRNA of the key target

3 討論與結論

西醫認為AKI的發生與腎臟缺血、缺氧有較大關系,目前為止臨床仍缺乏有效的治療方法和干預措施,主要通過對癥治療來改善患者疾病狀態[13]。中醫將AKI的臨床特點歸于“癃閉”“關格”“水腫”“溺毒”等范疇[14],故以清熱解毒、活血化瘀、瀉熱逐水、通腑瀉濁為治療基本法則[15]。乳香具有生肌止血、活血祛瘀,消腫止痛功效,臨床多用于治療血瘀證或痹證等[16]。因此,在急性腎損傷的早、中期加入活血化瘀藥,對患者腎功能的改善、減輕血尿等臨床表現,以及減慢疾病的進展速度等方面有著重要的防治作用[17]。

本研究利用網絡藥理學的方法,系統地分析了乳香“多成分-多靶點-多途徑”治療AKI的物質基礎和作用機制。大量實驗證明乳香酸被認為是乳香中最具生物活性的成分。最顯著的是抗炎和抗腫瘤特性,以及許多其他藥理活性,如抗潰瘍、免疫調節、降血脂、腎保護、抗菌作用等[18]。研究結果表明,AKBA、α-BA等是治療AKI的主要活性成分。有文獻報道,α-BA可以抑制 U937巨噬細胞中LPS刺激的促炎細胞因子(TNF-α和IL-1β)的產生,證實了其在體外的抗炎特性[19]。乳香的生物活性成分五環三萜,通過5-脂氧合酶阻斷白三烯的生物合成并發揮其抗炎作用[20]。有研究表明,乳香酸通過抗氧化和抗炎作用對環磷酰胺誘導的膀胱炎大鼠發揮尿路保護作用[21]。

由PPI網絡可知MAPK3、PPARG、PTGS2、HIF1α和ESR1是乳香治療急性腎損傷的核心靶點。MAPK3屬于絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族成員。MAPK級聯激活是多種信號通路的中心,參與細胞生長、分化、凋亡等生理過程[22]。PPARG屬于核轉錄因子超家族,實驗證明PPARG缺失小鼠出現糖尿和白蛋白尿增加,隨著年齡的增長,小鼠出現腎功能不全、2 型糖尿病進一步加重[23]。據報道,PPARG激動劑通過抑制I/R損傷誘導的彌漫性腎小管壞死和急性炎癥,并降低一氧化氮血漿水平、ED-1+細胞浸潤,從而保護腎臟免受I/R損傷,PPAR激動劑在治療AKI方面顯示出相當大的前景[24]。PTGS2是花生四烯酸轉化為炎癥介質前列腺素的關鍵酶,主要分布在核膜,受炎癥因子、腫瘤生長因子等刺激后誘導其表達。研究表明,金骨蓮提取物劑量依賴性下調PTGS2/COX-2 mRNA表達,從而發揮抗炎作用[25]。HIF1α是對缺氧的適應性反應的主要調節因子,在腎缺血-再灌注誘導的AKI模型中,HIF1α在腎小管上表達明顯增多[26]。

在GO富集分析的過程中,主要涉及對缺氧的反應、凋亡過程、炎癥反應等生物過程、線粒體等分子功能以及內肽酶活性等細胞組分,提示乳香治療AKI的生物學途徑豐富且復雜。由KEGG通路富集分析可知,乳香治療AKI的信號通路與Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和NF-κB信號通路相關。其中,Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種膜蛋白受體,TLR4是引起AKI炎癥反應的重要分子,可轉錄及釋放多種細胞因子和炎癥介質,引發免疫炎癥反應[27]。有研究表明,急性腎損傷嚴重程度與血清TLR4、NF-κB水平密切相關,通過抑制TLR4-NF-κB信號通路可減輕急性腎損傷嚴重程度[28]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor TNF) 是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子,一般TNF是指巨噬細胞產生的,即TNF-α。被激活后主要發揮促進細胞生長、分化、凋亡及誘發炎癥等重要作用[29]。AKI激活TLR4-NF-κB信號通路后,誘導促炎因子TNF-α釋放。故加強對TLR4、NF-κB及TNF-α水平的控制,以減輕急性腎損傷,促進患者預后改善。

采用分子對接法對乳香中主要有效成分作用于MAPK3和PPARG的結合能進行了測定,結果顯示AKBA和α-BA對MAPK3和PPARG都有良好的結合能力。

最后,本研究通過細胞培養模擬腎臟I/R損傷研究α-BA的作用機制。研究結果表明α-BA對HK-2細胞無毒性作用,且呈劑量依賴性提高I/R損傷模型的細胞活力,提示具有腎臟保護作用。Hoechst 33258染色顯示I/R處理顯著上調凋亡細胞的比例,而α-BA顯著降低其凋亡細胞并呈濃度依賴性。α-BA可顯著抑制由I/R誘導的HK-2細胞產生的炎性因子。同時,實時熒光定量RT-PCR檢測表明,α-BA能夠下調AKI進程中的關鍵靶點MAPK3和PPARG基因表達,這與網絡藥理學預測的結果相一致。

本研究運用中藥網絡藥理學的方法,檢索出乳香的活性成分及潛在靶點,以及AKI的相關靶點,得到活性成分與疾病靶點交集為72個,再對這些靶點進行GO及KEGG信號通路富集分析,預測出主要的活性成分AKBA、α-BA等,主要通過調節MAPK3、PPARG、PTGS2等靶點,調控Toll樣受體、TNF和NF-κB等信號通路來減輕缺血、缺氧損傷、調控細胞凋亡,從而達到治療AKI的目的。同時,體外細胞實驗初步證實了預測的準確性和可靠性,為后續中醫藥研究及臨床推廣提供了參考依據。但其仍具有一定的局限性,有待動物實驗進一步驗證。