經鼻吸入復方精油提神醒腦的藥效、作用機制及初步安全性研究

劉小金,劉日群,鄭 琴,楊 明,胡鵬翼,李字棋,肖淑華

江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室,南昌 330004

現代社會,繁重的工作和生活壓力致使人們白天犯困、易疲勞的現象越發嚴重,警覺度和認知功能下降是該癥狀的主要表現,短期服用興奮劑類藥物如咖啡因、莫達非尼等可緩解疲勞困倦,提高警覺性[1]。但長期攝入咖啡因會引起抑郁、易怒、心律失常、焦慮、失眠等不良癥狀;此外,咖啡因的利尿作用也可導致運動間脫水,體溫調節能力下降[2]、心率加快和心臟負擔[3];而莫達非尼會引起頭痛、惡心和血壓升高等不良反應,也有潛在的成癮性與依賴性[4]。因此研究開發效果好、不良反應少的提神醒腦產品顯得尤為迫切。

芳香療法作為近年來興起的一種補充替代療法,是一種回歸自然類似于整體治療的方法。芳香療法中所用的芳香物質或精油已有研究報道具有提神醒腦效果,如迷迭香精油、蘇合香精油、薄荷精油、石菖蒲精油、冰片和檸檬精油等[5]。本文基于芳香療法理論為指導,選擇芳香開竅的薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等植物精油進行組方,經鼻吸入研究自制復方精油對小鼠自主活動及睡眠的影響,評價其提神醒腦的藥效。采用酶聯免疫法(ELISA)、Western blot技術檢測興奮性神經遞質谷氨酸、多巴胺及其受體研究作用機制,并采用GC-MS分析復方精油化學成分,以期分析精油中可能產生興奮作用的成分。另一方面,精油雖然具有較好的療效,但有臨床研究報道精油可能會引起不良反應[6],為確保臨床用藥安全,本文還研究自制復方精油經鼻吸入對小鼠進行初步安全性研究,以期為其安全使用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明小鼠(KM,SPF),雄性,體重為20±2 g,購買于江西中醫藥大學動物科技中心,動物生產許可證號:SYXK(贛)2022-0002,本實驗經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,審批號:JZLLSC20210043。動物飼養于江西中醫藥大學動物科技中心屏障級實驗室內,晝夜12 h交替,恒溫(22±2)℃,相對濕度40%～70%,動物統一適應性喂養1周。

1.2 藥品及試劑

復方精油,江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室提供,批號20220322,主要成分為薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等;咖啡因(批號PS11544,北京譜析科技有限公司);酒精消毒劑(南昌利康制藥機械有限公司);PBS緩沖液(Solarbio);多巴胺酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號H170-1-2,Andygene);谷氨酸酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號H168-1-2,Andygene);多巴胺受體D1R抗體(批號ab279713,Abcam)。

1.3 方法

1.3.1 復方精油對小鼠提神醒腦的作用研究

1.3.1.1 實驗動物分組和給藥

40只昆明雄性小鼠,隨機分成5組,每組8只。實驗由對照組、咖啡因組和復方精油低(2×10-7mL/cm3)、中(5×10-7mL/cm3)、高劑量(8×10-7mL/cm3)組,為增加精油霧化效率,采用蒸餾水對復方精油進行適當稀釋。對照組每天霧化吸入等量蒸餾水,陽性藥組灌胃咖啡因57 mg/kg,前期預實驗結果表明,復方精油霧化吸嗅給藥15 min后能顯著提高小鼠自主活動能力,本研究選擇復方精油霧化吸入15 min,實驗時間每日8∶00～16∶00,1次/d。精油給藥劑量=霧化器復方精油加入體積(mL)/動物香薰室空間體積(cm3)。

1.3.1.2 復方精油對小鼠自主活動的影響

連續給藥3 d,每天各給藥組霧化吸入15 min,休息15 min后進行曠場實驗。有研究表明,小鼠灌胃咖啡因后,在30～60 min 能達到最高血藥濃度,小鼠灌胃咖啡因30 min 后活動能力顯著增強[7],選擇咖啡因組灌胃30 min后進行曠場實驗。小鼠適應環境3 min,檢測5 min內行為學參數:運動距離(cm)、平均速度(cm/s)、休息時間占比(%)。

1.3.1.3 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導實驗

另取30只昆明雄性小鼠,隨機分成5組,每組6只。對照組和復方精油低、中、高劑量組小鼠均在實驗第一天末次霧化吸入15 min,休息15 min,陽性藥組灌胃咖啡因30 min后,均進行腹腔注射戊巴比妥鈉閾上值55 mg/kg[8]。觀察并記錄各組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續時間,注射給藥后,小鼠的翻正反射消失1 min,為入睡指標。從注射藥物到翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期,翻正反射消失至恢復的時間為睡眠持續時間,記錄睡眠時間的潛伏期和睡眠時間。

1.3.2 復方精油對小鼠腦和血清GLU、DA含量的影響

吸嗅3 d,曠場實驗結束后,各組小鼠摘眼球取血,后頸椎脫位處死,取出完整腦組織,PBS緩沖液清洗,濾紙吸干。血液室溫靜置1 h,3 500 r/min離心15 min,取上清液血清、腦組織暫存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說明書步驟操作檢測小鼠腦組織和血清中谷氨酸(glutamic acid,GLU)和多巴胺(dopamine,DA)含量。

1.3.3 復方精油對小鼠腦內DA受體D1R的影響

另取一批昆明小鼠按“1.3.1.2”方法重復實驗,吸嗅給藥第3 d結束后,各組小鼠迅速頸椎脫位處死,取出全腦組織,用PBS緩沖液洗去血漬,在冰面上分離前額皮層、海馬、下丘腦和其他腦組織,EP管分裝存于-80 ℃用于Western blot分析。將冷凍組織(20 mg)在20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4、0.9% NaCl、0.5% Nonidet P40、1 mmol/L EDTA、129 mmol/L乙二醇四乙酸(EDTA)、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、1 000 KIU/mL 抑肽酶和10 μg/mL亮肽)中勻漿,并在冰上孵育15 min。在12 000 r/min和4 ℃下離心10 min后,使用BCA蛋白質測定試劑測量上清液的蛋白質濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入一抗(D1R 1∶1 000),然后將膜與辣根過氧化物酶綴合的次級抗體(1∶2 000)孵育。轉移的蛋白質用增強化學發光(ECL)底物溶液孵育,并用圖像J程序(Bio-Rad,Richmond,CA,USA)可視化。通過使用Quantity One軟件(BioRad Laboratories)對相對水平進行密度量化,并根據GAPDH的條參考帶進行計算。

1.3.4 復方精油GC-MS的化學成分分析

氣相色譜條件:采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛細管柱,載氣為高純度He(99.999%),進樣量l μL,分流比50∶1,流速1 mL/min;程序升溫:初始溫度45 ℃(保持0 min),以3 ℃/min升溫至70 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至90 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至140 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以3 ℃/ min升溫至220 ℃,保持5 min;再以5 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min,進樣口溫度280 ℃,接口溫度為250 ℃。

質譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,MS四極桿溫度150 ℃;界面溫度250 ℃,溶劑延遲3.0 min,質譜掃描模式全掃描,掃描范圍(m/z)30～650。標準譜庫NIST11檢索,采用峰面積歸一化法計算各組分含量的相對百分比。

1.3.5 單次吸嗅復方精油對昆明小鼠安全性研究

因受試藥物濃度、體積和霧化效率的限制,無法測定受試藥物的半數致死量,提示其安全性較高,為進一步評價其安全性,進行最大給藥量試驗。預實驗結果顯示,當復方精油濃度達到2.07×10-4mL/cm3時,老鼠毛發濕潤較嚴重,且該濃度下部分老鼠存在呼吸不適,可能是霧氣濃度過高影響老鼠正常呼吸,即以復方精油濃度2.07×10-4mL/cm3為最大給藥濃度劑量。

昆明小鼠雌雄各半,根據體重隨機分成為雄鼠對照組(control of male mice,Con-M)、雌鼠對照組(control of female mice,Con-F)、雄鼠復方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of male mice,Dose 1-M)、雌鼠復方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of female mice,Dose 1-F)、雄鼠復方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of male mice,Dose 2-M)、雌鼠復方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of female mice,Dose 1-F),每組8只。復方精油劑量1和劑量2的濃度為1.48×10-4、2.07×10-4mL/cm3,分別為復方精油有效劑量(5×10-7mL/cm3)的296倍和414倍。對照組吸嗅等量蒸餾水,實驗開始1 d,單次吸嗅15 min(30 cm×30 cm×30 cm箱體),為確保規定時間內精油完全霧化,采用多個霧化器同時霧化。

給藥當天仔細觀察并記錄動物的中毒表現,癥狀出現和消失的時間及死亡時間。給藥當日連續觀察,其后每日1次,連續觀察14 d。觀察期間記錄小鼠的體重變化、外觀征、行為活動、呼吸,飲食,排泄物等及其他中毒表現,若有動物死亡,進行肉眼觀察和尸檢,必要時病理學檢查。觀察期結束第14 d,對各組小鼠眼眶取血并進行血常規分析和谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、肌酐和尿素氮含量檢測,取各組小鼠腦、肺、鼻黏膜、肝、腎進行組織病理學切片分析。

1.3.6 統計學處理方法

2 結果

2.1 復方精油吸嗅對小鼠自主活動能力的影響

如圖1所示,給藥1 d,與對照組比較,陽性藥組(咖啡因)和復方精油組(低、中、高劑量組)小鼠的運動總距離均顯著增加(P<0.01,P<0.01),平均速度均顯著提高(P<0.01),休息時間顯著縮短(P<0.01),表明不同劑量復方精油可以顯著提高昆明小鼠的自主活動能力,具有振奮精神的作用。給藥2 d,實驗結果與給藥1 d基本一致。給藥3 d,與對照組比較,陽性藥組小鼠的運動總距離、平均速度和休息時間均無顯著性差異(P>0.05),復方精油組(低、中、高劑量組)運動距離均顯著增加(P<0.01),平均速度顯著提高(P<0.01),休息時間顯著縮短(P<0.01)。

圖1 復方精油對昆明小鼠自主活動能力的影響Fig.1 Effect of compound essential oils on autonomic activity of Kunming mice 注:a:對照組,b:陽性藥組,c:復方精油低劑量組,d:復方精油中劑量組,e:復方精油高劑量組。與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:a:Control group,b:Positive drug group,c:Compound essential oil low dose group,d:Compound essential oil medium dose group,e:Compound essential oil high dose group.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導實驗結果

如圖2所示,與對照組比較,陽性藥組(咖啡因)和復方精油組(低、中、高劑量組)對小鼠的睡眠潛伏期無顯著性差異(P>0.05,P>0.05);陽性藥組(咖啡因)和復方精油組(低、中、高劑量組)均能顯著縮短小鼠睡眠時間(P<0.05,P<0.01),說明復方精油吸嗅具有良好的促醒作用。

圖2 戊巴比妥鈉睡眠誘導實驗結果Fig.2 Results of sleep induction experiment with pentobarbital

2.3 復方精油對小鼠腦內和血清GLU、DA含量的影響

如圖3所示,與對照組相比,復方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加腦內多巴胺水平(P<0.05),咖啡因對腦內多巴胺水平沒有顯著影響(P>0.05),陽性藥組(咖啡因)和復方精油組(低、中、高劑量)均顯著提高腦內谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05),復方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加血清多巴胺水平(P<0.05),咖啡因對血清多巴胺水平具有上升趨勢,但無統計學意義(P>0.05),陽性藥組(咖啡因)和復方精油組(中、高劑量)均顯著提高血清谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05)。DA和GLU含量的增加可能是復方精油吸嗅促進小鼠自主活動能力、提神醒腦的重要作用機制。

圖3 復方精油對昆明小鼠血、腦組織GLU、DA的影響Fig.3 Effect of compound essential oil on GLU and DA in blood and brain of Kunming

2.4 復方精油對昆明小鼠不同腦區多巴胺受體D1R表達的影響

如圖4所示,與對照組比較,復方精油組(低、中、高劑量組)顯著提高昆明小鼠不同腦區(海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織)的D1R表達(P<0.05),陽性藥組(咖啡因)對海馬、下丘腦組織中的D1R表達無顯著影響,陽性藥組(咖啡因)顯著提高前額皮層和其他腦組織的D1R表達(P<0.05)。

圖4 復方精油對昆明小鼠不同腦區多巴胺受體D1R表達的影響Fig.4 Effect of compound essential oil on the expression of dopamine receptor D1R in different brain regions of Kunming

2.5 復方精油GC-MS成分分析

GC-MS分析的復方精油主要化學成分及相對百分比見表1,總離子流圖見圖5。共鑒定并核實31種化學成分,占揮發油總成分的84.41%,其中含量最高的為L-薄荷醇(24.54%),其次為丁香酚(16.25%)、L-薄荷酮(7.78%)、冰片(7.30%)、1-石竹烯(5.29%)、1,8-桉葉素(3.40%)等。

圖5 復方精油總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of compound essential oil

2.6 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠安全性研究

2.6.1 復方精油高濃度單次吸嗅小鼠外觀表征

實驗觀察,在高濃度吸嗅過程中,復方精油劑量1組和復方精油劑量2組小鼠均存在跳躍行為,吸嗅5 min左右最為明顯。吸嗅15 min后,對照組、復方精油劑量1組和復方精油劑量2組小鼠除毛發較為濕潤外,無其他明顯異常表現,呼吸和運動正常。

2.6.2 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重的影響

結果見表2,與對照組比較,復方精油高濃度單次吸嗅,觀察期14 d內,復方精油不同劑量給藥組小鼠體重無顯著性差異。

表2 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重的影響

2.6.3 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠血細胞的影響

結果見表3,與對照組比較,復方精油高濃度單次吸嗅,復方精油不同劑量給藥組對小鼠血細胞無顯著性差異。

表3 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠血細胞的影響

2.6.4 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠肝腎功能的影響

結果見表4,與對照組比較,復方精油高濃度單次吸嗅,不同給藥小鼠組谷草轉氨酶、胱抑素、谷丙轉氨酶、肌酐和尿素氮無顯著差異(P>0.05)。

表4 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠肝腎功能的影響

2.6.5 復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠腦、鼻黏膜、肺、肝、腎的影響

結果見圖6～10,與對照組正常小鼠比較,復方精油劑量1和復方精油劑量2對雄性或雌性小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝、腎等組織無明顯病理性損傷,各組織細胞核明顯,未見炎性浸潤、細胞破裂等細胞組織損傷。

圖6 腦組織HE染色病理切片(×200)Fig.6 HE stained pathological section of brain tissue (×200)注:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,下同。Note:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,the same below.

圖7 鼻黏膜HE染色病理切片(×200)Fig.7 HE staining pathological section of nasal mucosa (×200)

圖8 肺HE染色病理切片(×200)Fig.8 HE staining pathological section of lung (×200)

圖9 肝HE染色病理切片(×200)Fig.9 HE stained pathological section of liver (×200)

圖10 腎HE染色病理切片(×200)Fig.10 HE stained pathological section of kidney (×200)

3 討論與結論

自主活動是評價動物情緒興奮性的重要方法,自主活動的增加表明興奮性增強[9]。實驗動物自主活動的減少、睡眠時長的增加、睡眠潛伏期的縮短被用于評價藥物的鎮靜安神抗失眠作用,而與該表征相反的結果則被認為具有提神醒腦、促醒的功效[5]?？Х纫蚴悄壳斑\用最廣且普遍認可的精神興奮劑,具有中樞興奮和提神醒腦的作用,同時咖啡因也是多種提神功能性飲料的主要藥效成分,給藥方式的不同,藥效及起效時間存在差異,相比于吸嗅給藥,口服給藥起效較慢,本文預實驗結果表明咖啡因灌胃給藥后30 min較為興奮,自主活動能力顯著增強,戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導實驗也表明給藥30 min后睡眠總時長顯著縮短,因此本文中陽性藥組咖啡因選擇灌胃給藥后30 min進行相關指標檢測。吸嗅發揮藥效的速度較快,預實驗結果表明復方精油吸嗅15 min后自主活動能力顯著增強,因此選擇吸嗅15 min后進行相關指標檢測。有文獻選擇薄荷油吸嗅為陽性對照組,但是因復方精油中含有薄荷油,因此本文沒有選擇薄荷油作為陽性藥,而選擇公認具有提神醒腦功效的咖啡因作為陽性藥。曠場實驗結果表明,復方精油單次或多天給藥均能顯著提高小鼠自主活動能力,具體表現為提高正常小鼠運動距離和平均速度,縮短休息時間,同時,與陽性藥咖啡因比較,復方精油提高小鼠自主活動能力藥效更顯著、更持久。戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠誘導實驗結果表明,復方精油不同劑量組均能夠顯著減少昆明小鼠的睡眠時間,具有促醒的作用。分析以上結果可知,復方精油吸嗅能有效促進正常小鼠自主活動、縮短戊巴比妥鈉睡眠誘導時長,發揮持續提神醒腦的功效。

DA和GLU是重要的興奮性神經遞質,多巴胺被認為是一種促進覺醒和興奮的物質[10],多巴胺的增加有利于維持清醒和增強興奮性,多巴胺激動劑和多巴胺再攝取抑制劑是治療發作性睡病的重要藥物類型,DA還參與運動、動機和獎勵機制的調節[11]。谷氨酸神經元是喚醒和睡眠回路中主要神經元的重要組成部分,GLU含量的增加有助于喚醒和興奮,GLU水平的高低在一定程度上反映小鼠的神經活動興奮性的強弱[11]。本研究發現,復方精油吸嗅能顯著提高小鼠血、腦內DA、GLU含量,與相關報道結果一致。據報道,大麻二酚和莫達非尼精神興奮劑可通過增加腦組織DA等神經遞質水平,促進燈開啟期間誘導大鼠覺醒[12],咖啡因、大麻及它們的組合在治療后增加大腦組織中的GLU水平,GLU水平的增加可能會激活小鼠骨髓細胞核中的組胺神經細胞,并增加其活力[13]。因此,DA、GLU含量的增加可能是復方精油促進小鼠興奮的重要原因之一。本研究發現咖啡因對DA無顯著影響,咖啡因與復方精油對GLU和DA的差異可能為機制上的差異。據報道,咖啡因的興奮作用主要通過腺苷受體拮抗、蘭尼堿受體結合激活蘭尼堿敏感型鈣通道、抑制γ-氨基丁酸(GABA)與受體結合和抑制環核苷酸磷酸二酯酶的活性等4種途徑實現。D1R是DA的重要受體之一,參與運動、獎賞和學習記憶的調節[14]。DA對運動神經元興奮性的大部分影響歸因于D1R的激活[15],因此復方精油提高小鼠自主活動可能與上調D1R蛋白水平有關。另外,DA在喚醒中起著重要作用,因此復方精油導致小鼠睡眠時間縮短的原因可能是D1R介導的喚醒機制的激活[16]。

GC-MS成分分析結果表明,L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素等成分是復方精油的主要成分。薄荷醇是薄荷精油的主要有效成分,約占薄荷精油33%～60%,薄荷醇可以有效改善認知和緩解精神疲勞,Zhang等[17]的研究表明,單獨使用薄荷醇不會影響大鼠伏隔核中DA的水平,而尼古丁和薄荷醇聯合使用與單獨使用尼古丁相比,顯著提高了DA的水平,因此復方精油中的薄荷醇與精油中的其他成分聯合應用提高小鼠腦內DA水平發揮興奮作用。丁香酚為丁香精油的主要成分,丁香酚具有強抗氧化活性,能有效緩解機體的氧化應激損傷,能有效提高機體抗氧化酶活性,丁香酚還具有學習記憶功能改善作用。L-薄荷酮在抗抑郁和抗炎方面具有相關報道[18],冰片作為開竅醒腦的常用藥,具有引藥上行和神經保護作用,1-石竹烯具有抗炎和神經保護作用,Han等[19]研制的復方精油具有緩解大鼠中樞疲勞的作用,其中精油中含有33.8%的1,8-桉葉素。因此復方精油吸嗅提神醒腦改善疲勞可能是多種成分共同作用的結果。

單次給藥急性毒理學實驗是考察藥物安全性的重要手段之一[20]。為評價精油吸嗅的安全性,我們在有效劑量的基礎上進一步提高給藥劑量,進行單次吸嗅給藥急性毒理學實驗。實驗結果表明,復方精油高濃度單次吸嗅對小鼠體重、血細胞、谷草轉氨酶、胱抑素、谷丙轉氨酶、肌酐和尿素氮無顯著性影響,同時對小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝和腎等重要組織器官無病理損傷,說明復方精油吸嗅安全性良好。

綜上所述,復方精油通過提高小鼠血、腦組織DA、GLU含量,上調小鼠海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織D1R的蛋白水平表達,發揮提高小鼠自主活動能力以及促醒的作用。復方精油的主要有效成分可能為L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素。單次給藥急性毒性實驗結果表明,復方精油吸入對昆明小鼠體重、血細胞相關指標、肝腎功能均無顯著性影響,對腦、鼻、肺、肝、腎等組織無病理性損傷,說明復方精油吸入安全性良好,可以作為提神醒腦的安全性產品使用。