銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復配劑對小菜蛾及十字花科作物幼苗的生理影響

蔣蜜涵,廖靈潔,廖 陽,黃卓穎,王麗倩,于凌一丹,閆榮玲

1湖南科技學院化學與生物工程學院;2湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室;3湖南省銀杏工程技術中心,永州 425199;4內蒙古大學生命科學學院,呼和浩特 010021

小菜蛾(Plutellaxylostella)作為全球頻發鱗翅目農業害蟲,主要取食甘藍、花菜、蘿卜等十字花科植物葉片,對其有效防控具有顯著經濟與社會價值[1]。植物源生物農藥不易產生抗藥性、對食物鏈破壞小、不隨食物鏈富集等優點使其在農業病蟲害防治中優勢獨特[2,3]。銀杏外種皮(Ginkgobilobasarcotesta,Gbs)和垂序商陸葉(Phytolaccaamericanaleaf,Pal) 作為兩種獲取容易、成本低廉的植物資源,其提取物已被證明具有良好小菜蛾的滅殺活性與防控效應,且特定比例下二者復配劑的效果優于各自單方,從而表現出顯著開發潛力[4,5]。生物農藥尤其是復配型生物農藥是多種活性組分的混合物,其滅殺活性往往是多成分協同作用的結果,因此作用機制較化學農藥更復雜[6,7]。其中,破壞農業害蟲腸壁組織、改變神經遞質合成量、引發神經遞質受體功能失常或神經損傷、干擾胞內物質代謝、阻斷機體解毒反應等多種途徑,是生物農藥實現農業害蟲有效滅殺的常見機制[8-11]。銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復配劑已被證明可有效滅殺小菜蛾,但其作用機制還不明了。另一方面,植物源生物農藥噴施到植物莖葉等部位后,其中一部分進入植物體內,可能誘發植物發生不同程度生理響應,并表現到生長發育及生理指標上。不同植物源生物農藥由于所含活性成分不同,誘發的生理響應可能差顯著甚至截然相反[12,13]。十字花科植物是小菜蛾的主要為害對象,噴施銀杏外種皮和垂序商陸葉提取物的復配劑對其進行小菜蛾防治時,復配劑會引發十字花科植物產生怎樣的生理響應還不明確。基于此,本研究關注了小菜蛾在銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復配劑作用下,其腸道組織結構,以及體內與神經毒性、化學解毒與抗氧化等機能密切相關的標志性酶活性變化,以期初步探明復配劑對小菜蛾消化、神經和解毒等生理機能的影響,并以十字花科代表性植物蘿卜幼苗為研究對象,協同關注了復配劑處理對植株幼苗生長與生理產生的影響,從而為復配劑在農業生產中的科學施用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏外種皮(11月采自永州桐子坳)與垂序商陸葉(9月采自湖南科技學院校園附近空地,去柄)經清洗瀝干后,60 ℃烘至恒重,兩種植物材料經化學與生物工程學院黃國文博士鑒定為銀杏科銀杏屬的銀杏外種皮和銀杏商陸科商陸屬的垂序商陸葉;小菜蛾蟲卵購于河南濟源白云實業有限公司,孵化后挑選3齡幼蟲用于試驗;蘿卜種子(興寧市慶豐盈科種子有限公司);營養土購自沈陽花諾生物科技有限公司。

1.2 儀器試劑

光合速率儀(LI-6800,北京力高泰公司);紫外可見光分光光度計(SP-756P,上海光譜儀器有限公司);二硫雙硝基苯甲酸(合肥巴斯夫生物科技有限公司,AR,批號:BSF201125);碘化硫代乙酰膽堿(合肥巴斯夫生物科技有限公司,AR,批號:BSF201119);丙酮(衡陽市凱信化工試劑股份有限公司,AR,批號:20180820)、磷酸氫二鈉(天津大茂化學試劑廠,AR,批號:20200901);磷酸氫二鉀(天津大茂化學試劑廠,AR,批號:20200901);過氧化氫(天津福晨化學試劑廠,AR,批號:20190520);EDTA(天津市致遠化學試劑有限公司,AR,批號:20200501);SDS(天津大茂化學試劑廠,AR,批號:20201101);核黃素(上海展云化工有限公司,AR,批號:B2108119);愈創木酚(天津福晨化學試劑廠,AR,批號:20210812);考馬斯亮藍(天津福晨化學試劑廠,AR,批號:20200807);毒扁豆堿(上海源葉生物科技有限公司,純度>98%,批號:P09D6Y6464);α-醋酸萘酯(上海源葉生物科技有限公司,純度95%,批號:A22J9X62572);堅固藍B鹽(上海源葉生物科技有限公司,純度95%,批號:M25J10L90 478)

1.3 研究方法

1.3.1 復配劑制備

烘至恒重的銀杏外種皮與垂序商陸葉置粉碎機打成粉末后80目過篩。分別稱取200 g銀杏外種皮與垂序商陸葉粉末,加入95%乙醇1 500 mL,400 W微波持續處理60 s,抽濾、減壓濃縮至稠膏狀后40 ℃烘至恒重。根據課題組前期研究確定的兩種提取物半致死濃度(銀杏外種皮提取物2.95 mg/mL,垂序商陸葉提取物6.09 mg/mL),以及二者最佳復配比例(銀杏外種皮∶垂序商陸葉1∶11,體積比),95%乙醇溶解配制成各自半致死濃度后按最佳復配比混合制得濃度為3.21 mg/mL的復配劑[4]。

1.3.2 小菜蛾培養及給藥處理

選用實驗室營養土栽培白菜幼苗鮮嫩葉片,復配劑浸泡10 s后取出揮干,放入墊有濕潤濾紙培養皿中;挑選形態大小基本一致且饑餓處理2 h后的3齡小菜蛾幼蟲置培養皿中飼喂,每皿30頭,每12 h清理培養皿更換新鮮葉片,所有葉片均作提取物復配劑液浸泡處理;以隨行試劑95%乙醇作為空白對照,對照組及處理組各同步重復培養10皿。

1.3.3 小菜蛾繭重及破繭羽化率統計

因前期研究已確定復配劑的小菜蛾滅殺活性,本研究僅動態觀察和計數復配劑處理下小菜蛾死亡蟲數,重點關注和比較了對照組與處理組小菜蛾蛹重及蛹的破繭率,不進行校正死亡率的計算。對照組和處理組的繭隨機每10頭一組,用電子天平直接稱出各組10頭繭總重后求平均值(mg),稱后放回培養皿中觀察和計數成繭后第4、6、8、10、12、16 d的破繭出蛾數,根據公式計算破繭率:破繭羽化率=(破繭數/繭總數)×100%。

1.3.4 小菜蛾腸道解剖觀察

復配劑給藥飼喂小菜蛾幼蟲36 h后,處理組小菜蛾致死率達到較高水平,此時隨機選取對照組和處理組的若干小菜蛾幼蟲顯微鏡下解剖分離出其腸道,用磷酸鹽緩沖液反復沖洗后,觀察腸道形狀、顏色是否有顯著變化,腸壁是否出現穿孔。

1.3.5 小菜蛾乙酰膽堿酯酶與羧酸酯酶活性測試

參考已有文獻進行小菜蛾乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)與羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)活性測試[14]。小菜蛾經復配劑給藥飼喂24 h后,對照組和處理組小菜蛾幼蟲適量,分別置預冷的特定濃度磷酸緩沖液中,冰浴勻漿后4 ℃下離心10 min,取上清作待測酶液。取0.1 mL待測酶液與0.1 mL的10 mol/L碘化硫代乙酰膽堿混勻,30 ℃水浴15 min,然后加入二硫雙硝基苯甲酸終止反應并顯色,412 nm處測定OD值,計算乙酰膽堿酯酶比活力[nmol/(min·mg pro)];取0.2 mL待測酶液與1.0 mL α-醋酸萘酯(含1 ×10-5mol/L毒扁堿)混勻,30 ℃溫育15 min,再加入顯色劑(1%堅固藍B鹽和5% SDS按體積比2∶5混合而成),混勻后室溫置30 min,顏色穩定后600 nm處測OD值,計算羧酸酯酶比活力[nmol/(min· mg pro)]。試驗均重復3次取平均值。

1.3.6 小菜蛾抗氧化酶活性測定

參照已有文獻方法進行小菜蛾抗氧化酶活性測定[15,16]。小菜蛾經復配劑給藥24 h后,對照組和處理組小菜蛾幼蟲各20頭,分別加入50 mmol/L磷酸鹽緩沖液3 mL,冰浴勻漿,12 000 r/min離心20 min,上清液為待測酶液,利用考馬斯亮藍法測定過氧化氫酶酶(hydrogen peroxidease,CAT)活力與過氧化物酶(peroxidase,POD)活力。

1.3.7 復配劑對十字花科代表性植物蘿卜幼苗生長及生理影響

蘿卜種子萌發后72 h,選長勢一致幼苗移至營養土塑料盆,每盆約300株。移栽后第5 d下午6時進行不同濃度復配劑噴霧處理(取部分復配液分別稀釋至原濃度的2/3和1/2,得到對應的2.14 mg/mL、1.61 mg/mL濃度)。噴霧處理時,對照組噴隨行試劑,處理組噴不同濃度的復配液,對照組和各處理組溶液用量均恒定為1 L,均勻噴到幼苗葉片至濕潤。噴藥當天及噴藥后第8 d上午9時進行葉片電導率、光合速率、SOD與POD活性、MDA含量測定[17,18];并隨機選取對照組與處理組幼苗各5株,分別用直尺和分析天平測定株高(cm)和鮮重(g)后,置100 ℃烘箱殺青10 min后80 ℃烘至恒重,電子天平稱重求平均值(g)。所有指標均重復測定三次,求平均值。

1.3.8 數據處理

數據經Excel2003整理分析得到平均值及標準差,經SPSS19.0進行差異顯著性分析(t-test),經Sigmaplot10.0作圖,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 復配劑對小菜蛾蛹重、破繭率及腸壁的影響

復配劑對小菜蛾幼蟲表現出顯著滅殺活性,少量未被殺死的幼蟲繼續完成后續生長發育階段并結繭。比較對照組與處理組每10頭繭總重發現,處理組繭重37.6 mg顯著低于對照組的58.7 mg(見圖1A)。結繭后第4 d,對照組和處理組均有蟲體完成繭內發育并羽化出蛾;各組羽化率均隨時間推移逐漸增加,但對照組羽化率始終高于處理組;第10 d時,對照組和處理組羽化率分別達到96%和46%后不再增加(見圖1B)。

圖1 銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復配劑對小菜蛾蛹重(A)及破繭羽化率(B)的影響Fig.1 Effect of the extract mixture of Gbs and Pal on weight and ECLOSION rate of P.xylostella pupal

圖2顯示通過解剖分離得到的小菜蛾幼蟲腸道。經顯微鏡放大后對比,未發現處理組幼蟲腸道的形狀與顏色相對對照組發生顯著的改變,也未發現處理組組幼蟲的腸壁出現明顯腫脹、潰爛、破損及穿孔等現象。

2.2 復配劑對小菜蛾體內酶活性的影響

復配劑處理24 h后,小菜蛾幼蟲體內AchE及CarE的酶活性均出現大幅減少(t-test,P<0.05),其中前者從0.116降為0.087 nmol/(min·mg pro),后者則從1.183降至0.807 nmol/(min·mg pro)(見圖3)。

圖3 復配劑對小菜蛾乙酰膽堿酯酶(A)與羧酸酯酶(B)活性的影響Fig.3 Effects of extract mixture of Gbs and Pal on activity of AChE (A) and CarE (B) in P.xylostella

與乙酰膽堿酯酶及羧酸酯酶活性變化趨勢一致,小菜蛾幼蟲體內過氧化物酶和過氧化氫酶酶活性也急劇減少。給藥24 h后,前者從對照組的8.52 U/(g·min)降至1.23 U/(g·min),后者則從對照組的12.25 U/(g·min)降至2.24 U/(g·min)(見表1)。

表1 復配劑對小菜蛾幼蟲過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)活性的影響

2.3 復配劑對十字花科代表性作物蘿卜幼苗生長及生理的影響

復配劑對蘿卜幼苗生長有一定抑制作用(見圖4)。觀察期內對照組平均株高從5.02 cm增至13.14 cm,而1.64、2.14、3.21 mg/mL處理組分別增至12.11、11.94、11.12 cm(見表2),各處理組幼苗植株鮮重、干重均也明顯低于對照組(P<0.05,見表2),且處理組株高、干重及鮮重均隨復配劑濃度增加呈減少趨勢。

表2 提取物復配劑對十字花科代表性作物蘿卜幼苗生長的影響(ˉx ± s,n = 3)

圖4 復配劑處理8 d后蘿卜幼苗各組株高比較Fig.4 Height of radish seedlings among different groups after eight days treating with extract mixture of Gbs and Pal

如表3所示,復配劑對蘿卜幼苗抗氧化系統產生了不同程度影響。從第0 d到第8 d,除對照組幼苗葉片的電導率、MDA含量未出現顯著變化外(P>0.05),處理組SOD活性、POD活性、MDA含量、葉片電導率,及對照組的SOD活性、POD活性均不同程度增加,且處理組各指標增幅明顯大于對照組,增幅也隨復配劑濃度增加呈增加趨勢。

表3 提取物復配劑對十字花科作物蘿卜幼苗生理指標的影響(ˉx ± s,n = 3)

各組葉片光合速率隨時間的變化規律如圖5所示。對照組葉片凈光合速率隨培養天數延長逐漸增加,但噴施不同濃度復配劑的蘿卜幼苗的葉片凈光合速率在噴施后一段時期內先降后升,與對照組的差異隨時間推移逐漸縮小。復配劑濃度越小,葉片凈光合速率恢復越快,其中1.61 mg/mL組于處理后第6 d即恢復至對照組水平。

圖5 復配劑處理對蘿卜幼苗葉片光合速率的影響Fig.5 Effects of extract mixture of Gbs and Pal on the photosynthesis rate of radish leaf

3 討論與結論

3.1 復配劑對未致死小菜蛾的毒害效應可延續至蛹期

越來越多地方特色植物資源被證明具有良好的農業害蟲滅殺活性,在植物源生物農藥領域極具開發潛力,但人們評估植物源生物農藥效果時往往僅關注短期滅殺活性[19,20]。本研究發現,Gbs和Pal提取物復配劑處理下,部分小菜蛾幼蟲未在施藥階段被殺死,繼續完成了后續生長發育歷程并結繭;然而相較對照組,繭重及繭的羽化率顯著降低,提示被攝入小菜蛾體內的復配劑毒性效應并非局限幼蟲階段這一短暫時間窗,而是橫跨小菜蛾生命歷程的各階段甚至蛹期。積雪草、構樹以及細葉桉等植物葉片提取物近年也被證明對小菜蛾化蛹率及蛹重等具有顯著抑制作用[21]。可見,植物源生物農藥可能作用小菜蛾以及其他植食性昆蟲幼蟲到成蟲的整個生命周期,從而在人們之前并不太關注的蛹、成蟲階段也發揮著一定農業害蟲防治功效。有研究發現,適當濃度銀杏外種皮提取液不僅未抑制蠶繭產量和品質,還提高了蠶繭的這兩個生產指標[22],基于此,我們初步推測本研究復配劑對小菜蛾繭重及羽化率的抑制效應主要來自垂序商陸葉片提取物,或者是兩種提取物互作的結果。

3.2 復配劑對小菜蛾幼蟲的毒害效應是多種作用機制協同的結果

植物源生物農藥所含活性成分復雜多樣,基于多種植物提取物復配而成的混合型制劑成分則更為復雜。提取物活性成分被攝入農業害蟲體內后,可能協同作用于蟲體的多靶標而非單一靶標,進而影響其消化、代謝、神經、循環等多種生理機能,從而表現出拒食、麻醉、致死等效用[23]。本研究發現,Gbs和Pal提取物復配劑處理后,小菜蛾幼蟲腸道形狀、顏色、結構較對照組均未發生明顯變化,提示復配劑未對小菜蛾消化道產生明顯破壞作用;但顯著降低了蟲體AchE與CarE的活性,AchE可催化乙酰膽堿水解而影響膽堿能神經信號傳遞及調節神經組織發育和再生,而CarE可催化脂肪羧酸酯、芳香酯、芳香胺等化合物的分解,發揮解毒酶功能而賦予蟲體殺蟲劑抗性,AchE與CarE活性降低表明復配劑中含有的皂苷、糖蛋白、酚酸、內酯等活性成分可能通過下調小菜蛾體內上述酶基因表達,或通過與AchE與CarE結合影響酶分子空間結構等途徑降低了酶活,導致小菜蛾神經信號傳遞及解毒機能減弱[24]。復配劑處理下,小菜蛾體內過氧化物酶、過氧化氫酶活性較對照組也顯著降低,提示復配劑還可能干擾了蟲體抗氧化系統,引發抗氧化系統嚴重失衡以及自由基的大量富集,從而導致細胞結構及生理機能的異常。因此,Gbs和Pal提取物復配劑對小菜蛾幼蟲的毒害效應可能并非依賴某一單一機制,而應該是多種機制協同作用的結果。

3.3 復配劑的施用會誘發被施植物的生理響應與生長發育

生物農藥噴施于農作物表面尤其葉片后,在滅殺農業害蟲的同時,還可能對被施作物的生長、發育、生理產生不同程度影響。研究發現,適當濃度銀杏外種皮提取液可促進桑樹枝條生長,及禾本科、豆科植物種子萌發與幼苗生長;細辛等植物提取物可提高茄苗抗逆性[12,22,25]。本研究發現,復配劑處理對十字花科代表作物蘿卜的幼苗葉片凈光合速率以及植株生長產生了一定程度的抑制作用,且幼苗葉片中SOD活性、POD活性、MDA含量、電導率等生理指標顯著高于對照組,這提示復配劑的噴施會誘發蘿卜等十字花科植物幼苗的應激響應,同時還會不同程度抑制葉片光合速率及植株生長發育,雖然抑制效應未隨濃度增加呈線性遞增,但也提示實際應用中達到有效防控小菜蛾前提下,應盡可能降低復配劑施用濃度,避免其對十字花科植物幼苗生長發育的不良影響。