盾葉薯蕷響應低磷脅迫的生理代謝及基因表達特征分析

王慶婷,耿曉桐,李雅靜,張 娟,劉慶普,龔海燕,雷敬衛,謝彩俠*

1河南中醫藥大學 河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心,鄭州 450046;2信陽農林學院,信陽 464000;3上海中醫藥大學,上海 201203

磷作為植物生長發育所必需的大量元素之一,參與了植物的光合作用、能量轉化、信號轉導,以及酶活性等的調節,可以提高植物對環境的適應性[1]。植物獲取磷素的主要來源為土壤,但由于土壤中的磷轉移性差,極易被固定,因此其生物有效性低[2]。施用磷肥雖能夠緩解有效磷的缺失,但易與土壤中的鐵、鋁、鈣等離子或土壤顆粒結合而難以被植物攝取。此外,過度施用磷肥不僅會加劇磷礦的衰竭,還會造成周圍水體富營養化的環境污染問題[3-5]。因此研究植物低磷脅迫下的響應機制,篩選并培育耐低磷品種迫在眉睫。低磷脅迫下,植物會通過表型性狀和生理代謝的調節來響應低磷信號,以改變磷的存在形態,提高植物對磷的吸收率。植物根系通過分泌酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)提高根際土壤的酸性磷酸酶活性,實現對土壤中難溶性有機磷的活化利用[6]。ACP是一種能水解單磷酸酯鍵釋放無機磷的水解酶類,一般ACP活性的增高被視為植物響應低磷脅迫的重要機制之一[7]。另外,植物的根系發育情況[8-10]及抗氧化系統[11-13]也會產生變化來響應低磷脅迫。

在漫長的生長發育過程中,植物自成一套抗低磷的機制。低磷脅迫下,植物會通過改變一系列基因表達水平來調控自身生理生化過程,從而盡快適應低磷環境延長生存時間。轉錄組測序技術(RNA-Seq)可以研究組織在特定條件下的基因轉錄情況、定位并注釋基因,是研究植物生理過程分子機理的有效手段[14]。目前RNA-Seq被廣泛應用于植物響應外界脅迫的分子機制研究[15,16],極大推動了植物抗逆分子機制的研究進展。因此利用RNA-Seq研究植物的耐低磷分子機制,對尋找植物響應低磷脅迫的代謝通路進而篩選出響應低磷脅迫的潛在關鍵基因具有重要意義。

盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬植物,俗稱黃姜、火頭根。盾葉薯蕷為我國特有品種,是世界上薯蕷皂素含量最高的植物。盾葉薯蕷是提取薯蕷皂素重要的藥源植物,同時也是合成甾體類激素藥物的重要原料[17]。除此之外盾葉薯蕷還是治療心腦血管疾病的臨床用藥[18],這極大促進了盾葉薯蕷相關產業的發展。前期研究發現,長期種植盾葉薯蕷后會降低土壤有效磷含量,造成低磷脅迫,導致盾葉薯蕷植株生長發育受阻,影響其甾體皂苷類成分的合成。目前關于低磷脅迫對盾葉薯蕷生長及甾體皂苷代謝的影響還未見報道,因此,本文根據前期實驗結果,選取河南南陽產盾葉薯蕷為研究對象,以無機磷分級含量、根系發育情況、根際基質酸性磷酸酶(soil acid phosphatase,S-ACP)活性、植物過氧化物酶(peroxidase,POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、各部位甾體皂苷類成分含量等為評價指標考察低磷脅迫下盾葉薯蕷的生理變化及甾體皂苷類成分的代謝特征,并利用轉錄組測序技術對關鍵時期盾葉薯蕷不同組織部位的基因表達特征進行分析,為進一步研究盾葉薯蕷應答低磷脅迫的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);2000ES型蒸發光散射檢測器(奧特奇公司);1510型全波長酶標儀(賽默飛世爾科技公司);SX2-18-12型馬弗爐(蘇州江東精密儀器有限公司);LA-90型根系掃描儀(蘇州信華特檢測技術有限公司);10～100 μL和100～1 000 μL移液槍(艾本德國際貿易有限公司)。

1.2 試劑

乙腈(安徽天地高純溶劑有限公司;純度:HPLC≥99.9%;生產批號:AS1122-801-22075302);三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷(成都克洛瑪生物科技有限公司;純度≥98%;生產批號:CHB17051、CHB170718);薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷(成都曼思特生物科技有限公司;純度≥98%;生產批號分別為:MUST-17090203、MUST-17100901、MUST-17110504);甲苯(煙臺市雙雙化工有限公司;純度≥99.5%;生產批號:20101201);酒石酸銻鉀(武漢克米克生物醫藥技術有限公司;純度≥99%;生產批號:11071-15-1);碳酸氫鈉(天津市永大化學試劑有限公司;純度≥99.5%;生產批號:20210506)苯酚(天津市瑞金特化學品有限公司;純度≥99%;生產批號分別為:HG/T4367-2012);抗壞血酸(天津市恒興化學試劑制造有限公司;純度≥99.7%;生產批號:GB/T 15347-1994);土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性檢測試劑盒(索萊寶生化試劑盒事業部);甲硫氨酸(上海源葉生物科技有限公司;純度≥99%;生產批號:J15J8R39920);氮藍四唑(山東西亞化學工業有限公司;純度≥98%;生產批號:ST362);核黃素(北京奧博星生物技術有限責任公司;純度98%～102%;生產批號:20141008);愈創木酚(天津市光復精細化工研究所;純度≥99%;生產批號:B1227012);MiniBEST試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 樣品

1.3.1 植物材料培養與處理

以珍珠巖、蛭石(3∶1)作為培養基質,進行盆栽試驗。試驗設計為正常供磷(N)、中度低磷脅迫(H)、重度低磷脅迫(Z)3個處理,每個處理設置重復30次。正常供磷組以霍格蘭完全營養液進行澆灌,中度低磷脅迫組與重度低磷脅迫組分別澆灌中度缺磷營養液(完全營養液中一半的磷含量)與重度缺磷營養液(剔除磷組分的完全營養液,剔除的K用KCl進行補充)。選取大小一致已有芽點的種根,栽種于不同磷處理的盆栽基質中,統一管理。分別在苗齡30 d的脅迫初期(5月30日,標記為5)、苗齡60 d的脅迫中期(6月30日,標記為6)、苗齡90 d的脅迫后期(7月30日,標記為7)進行采樣,每次采樣10株。

1.3.2 樣品采集

采集盾葉薯蕷新生根莖(R)、地上莖(S)、老根(O)、須根(FR)與葉片(L)后,清洗,用吸水紙吸干后快速用錫箔紙包裝,置于液氮中,用于抗氧化酶(SOD、POD)活性實驗;采集盾葉薯蕷根際基質(RM),自然風干后混勻,置干燥器中保存,用于全磷、速效磷、磷酸鋁鹽(aluminophosphate,AL-P),磷酸鐵鹽(phosphoric acid iron salt,Fe-P)、磷酸鈣鹽(calcium phosphate,Ca-P)含量和土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性測定;另采集單株樣品,測定其根系發育特征。剩余各處理各部位樣品,凈制切制后置烘箱中45 ℃烘干,粉碎,過4號藥典篩,置干燥器中保存,用于盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量測定,各樣品以“部位-采樣日期-處理方式”的方式命名,如名稱為S-5-Z的樣品代表5月30日采集的重度低磷脅迫處理組的地上莖。

1.4 根際基質中各級磷含量測定

根際基質全磷的測定方法參照國家標準《土壤全磷測定法》中的氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法;采用0.5 mol/L NaHCO3法測定速效磷含量[19];無機磷(Al-P、Fe-P、Ca-P)測定方法參照Huang等[20]分級磷測定方法;根際基質的磷含量利用統計學方法對其進行分析。

1.5 根際基質中酸性磷酸酶(S-ACP)活性測定

稱取風干混勻的根際基質0.1 g,加入0.05 mL甲苯溶液,輕搖15 min,加0.4 mL試劑1搖勻后,置于37 ℃恒溫培養箱,開始計時,催化反應24 h;到時間后迅速加入1 mL試劑2充分混勻,終止催化反應。10 000 r/min室溫離心10 min,取上清液10 μL,加入20 μL試劑3、4 μL試劑4,充分混勻,顯色后再加166 μL蒸餾水,混勻后于室溫下靜置30 min,在660 nm處測定吸光度;空白管與標準管分別以10 μL蒸餾水和10 μL 0.5 μmol/mL苯酚標準液替換提取液測定吸光值。以37 ℃下中每克土壤每天釋放1 μmol酚為一個酶活力單位,根際基質的ACP活性結果利用統計學方法對其進行分析。計算公式如下:

ACP(U/g)=

0.725×(OD測定-OD空白)÷(OD標準-OD空白)÷W

式中,W為根際基質的質量。

1.6 盾葉薯蕷根系發育測定

利用根系掃描儀對不同處理不同時期下盾葉薯蕷的須根進行掃描,得到總根長、總投影面積與總表面積,并利用統計學方法對其進行分析。

1.7 盾葉薯蕷不同部位抗氧化酶(SOD、POD)活性測定

SOD活性采用氮藍四唑光化還原法測定,POD活性采用愈創木酚法測定,實驗方法參考Li[21]實驗指導中的測定方法,并利用統計學方法對其進行分析。

1.8 盾葉薯蕷不同部位甾體皂苷類成分含量測定

1.8.1 色譜條件

Athena C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;流動相為乙腈(A)∶水(B)梯度洗脫(0～5 min,15%A→25%A;5～6 min,25%→20%A;6～12 min,20%→30%A;12～14 min,30%→34%A;14～15 min,34%→37%A;15～20 min,37%→38.6%A;20～25 min,38.6%→60%A;25～30 min,60%→70%A;30～40 min,70%→100%A);進樣量5 μL。蒸發光散射檢測器(ELSD)參數:氣體流量2.5 L/min,漂移管溫度115 ℃,增益值為2。盾葉薯蕷甾體皂苷類成分對照品(A)與供試品(B)的HPLC圖見圖1。

圖1 盾葉薯蕷甾體皂苷類成分對照品(A)和供試品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and test substance (B) of steroidal saponins in D.zingiberensis注:1.原薯蕷皂苷;2.偽原薯蕷皂苷;3.盾葉新苷;4.三角葉薯蕷皂苷;5.薯蕷皂苷。Note:1.Protodioscin;2.Pseudoprotodioscin;3.Zingiberensis newsaponin;4.Deltonin;5.Dioscin.

1.8.2 對照品溶液和供試品溶液的制備

對照品溶液的制備:分別精密稱定一定量的原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷對照品樣品置于10 mL容量瓶中,用甲醇(色譜純)溶解并定容制成濃度分別為0.676、0.39、0.75、0.425、0.378 mg/mL的對照品儲備液,經0.22 μm微孔濾膜濾過,即得對照品溶液。

供試品溶液的制備:精密稱取盾葉薯蕷樣品0.5 g置于具塞錐形瓶中,加入90%乙醇30 mL,85 ℃加熱回流2 h,冷卻至室溫,用90%乙醇補足失重,濾紙過濾,取續濾液20 mL置于蒸發皿中,揮干,用甲醇(色譜純)溶解并定容至5 mL容量瓶,經0.22 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

1.8.3 方法學考察

1.8.3.1 線性關系

將5個對照品分別稀釋后按照“1.8.1”項下色譜條件測定其峰面積,以峰面積為縱坐標,對照品質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線(見表1)。5種皂苷類成分在各質量濃度范圍內均呈現良好的線性關系。

表1 5種皂苷類成分的標準曲線及線性范圍

1.8.3.2 重復性、穩定性及精密度試驗

精密取同一樣品,按“1.8.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,分別進行重復性、穩定性及精密度實驗,結果表明各試驗的RSD均符合要求,因此該儀器的精密度和方法重復性良好,樣品在24 h內穩定性良好。

1.8.3.3 加樣回收率試驗

精密取同一樣品6份,每份0.25 g,分別精密加入適量原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷混合對照品溶液適量,按“1.8.2”項下方法制備。按“1.8.1”項下色譜條件進樣,測定原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的含量,計算平均加樣回收率與RSD,結果表明原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的平均加樣回收率分別為98.38%、99.32%、97.68%、102.33%、100.41%,RSD分別為2.38%、2.41%、2.40%、2.69%、1.77%,說明該方法可以準確測定盾葉薯蕷中5種甾體皂苷類成分的含量。

1.8.4 樣品測定

按上述建立的方法測定盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量,每個樣品重復3次,測定結果取其平均值,并利用統計學方法對其進行分析。

1.9 盾葉薯蕷不同部位響應低磷脅迫關鍵時期的基因表達特征分析

1.9.1 盾葉薯蕷不同部位的轉錄組測序及組裝

選擇5月30日(脅迫初期)不同處理下盾葉薯蕷的新生根莖、地上莖、葉片進行轉錄組分析。用MiniBEST試劑盒進行柱式法提取盾葉薯蕷3個部位的總RNA,通過NanoDrop和Agilent 2100系統檢測得到的總RNA濃度和完整性,利用提取的樣品總RNA構建文庫。

采用BGISEQ-500平臺測定轉錄組樣本,由測序所得的數據稱為raw reads。raw reads去污染、去接頭后得到clean reads,使用Trinity對合格的clean reads進行組裝,然后使用Tgicl對轉錄本進行聚類去冗余得到Unigene。

1.9.2 盾葉薯蕷不同部位的基因表達量統計、差異基因篩選、GO注釋及KEGG功能分析

利用SOAP和LASTZ軟件計算各基因的表達量,用FPKM表示。參照Audic等[22]基于測序的差異基因檢測方法,根據基因的表達量(FPKM值)計算該基因在不同樣本間的差異表達倍數,篩選出樣品間的差異表達基因(DEGs)。在分析中,差異表達基因默認定義為錯誤發現率(false discovery rate,FDR)小于等于0.05且倍數差異在2倍以上的基因[23]。根據DEGs進行GO數據庫比對和KEEN代謝通路定位分析,通過幾何檢驗篩選差異最顯著富集的前20個通路。

2 結果與分析

2.1 盾葉薯蕷響應低磷脅迫的生理變化特征

2.1.1 不同處理各時期根際基質中各級磷含量和酸性磷酸酶(S-ACP)活性分析

從不同處理各時期根際基質中各級磷含量及酸性磷酸酶(S-ACP)活性的測定結果(見圖2)上可看出,隨著低磷脅迫程度的增加,盾葉薯蕷根際基質中各級磷含量呈下降趨勢。盾葉薯蕷根際基質的速效磷含量和Ca-P在低磷脅迫過程中其含量變化不大,且各處理組速效磷含量之間的差異無統計學意義;Al-P與Fe-P作為土壤中較為活潑的磷形態,在各處理組間的含量差異較大,其含量均呈階梯狀下降趨勢,根際基質中Al-P含量對低磷脅迫的響應程度大于其他磷。由盾葉薯蕷根際基質中S-ACP活性可知,脅迫初期和中期S-ACP活性均高于脅迫后期。整個脅迫過程中重度脅迫組根際基質中的S-ACP活性最高,在脅迫前期和脅迫后期其S-ACP活性與正常組之間的差異存在統計學意義。

圖2 不同處理各時期盾葉薯蕷根際基質中的全磷(A)、速效磷(B)、AL-P(C)、Fe-P(D)、Ca-P(E)含量及S-ACP(F)的活性Fig.2 Content of total phosphorus (A),available phosphorus (B),AL-P (C),Fe-P (D),Ca-P (E) and activity of S-ACP (F) in rhizosphere matrix of D.zingiberensis in different treatments and stages注:同一采樣時期內不同小寫字母表示各磷脅迫組之間差異顯著。Note:In the same sampling date,different lowercase letters indicate significant difference among phosphorus stress groups.

2.1.2 不同處理各時期盾葉薯蕷的根系發育情況

根系發育情況表明(見圖3),重度脅迫組的須根明顯稀少且呈細長狀,根莖發育遲緩;脅迫中期3個處理組間的須根發育特征差異性不明顯,根莖均可以發育,但重度脅迫組根莖萌發點數目相對較少;脅迫后期脅迫組處理下的須根變黃,而正常組的變化不明顯,且正常組的根莖萌發點較多。根系掃描結果表明(見圖4),脅迫初期重度脅迫組盾葉薯蕷的總投影面積與另外兩組之間的差異存在統計學意義。總體來看,脅迫初期3個處理之間的根系發育差異性大于脅迫中后期。

圖3 不同處理各時期盾葉薯蕷的根系發育情況Fig.3 Root development of D.zingiberensis in different treatments and stages

圖4 不同處理各時期盾葉薯蕷須根的總根長(A)、總投影面積(B)、總表面積(C)Fig.4 Total root length (A),total projected area (B) and total surface area (C) of D.zingiberensis in different treatments and stages注:同一采樣時期內不同小寫字母表示各磷脅迫組之間差異顯著。Note:In the same sampling date,different lowercase letters indicate significant difference among phosphorus stress groups.

2.1.3 不同處理各時期盾葉薯蕷各組織部位抗氧化酶(SOD、POD)的活性分析

不同處理不同時期盾葉薯蕷5個組織部位的SOD活性和POD活性變化結果表明(見表2),各處理之間盾葉薯蕷SOD及POD活性的變化呈現一定的規律性。盾葉薯蕷各組織部位中POD的活性對低磷脅迫的響應程度大于SOD,在整個脅迫過程中,盾葉薯蕷5個組織部位各脅迫組的POD活性整體上高于正常組,其中新生根莖表現最為明顯。差異性分析表明,在脅迫過程中盾葉薯蕷5個組織部位各組之間的SOD活性差異在統計學上未達顯著水平,新生根莖各脅迫組以及地上莖重度脅迫組的POD活性與正常組之間的差異在統計學上達顯著水平,另外,各組織部位脅迫組與正常組POD活性存在差異的表現時期不同,其中,老根主要表現在脅迫后期,須根主要表現在脅迫初期和中期,而葉片主要表現在脅迫初期和后期。

表2 不同處理各時期盾葉薯蕷5個組織部位的SOD、POD活性

2.2 不同處理各時期盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量特征分析

盾葉薯蕷新生根莖(R)、莖部(S)、老根(O)、須根(FR)、葉片(L)中5種甾體皂苷的含量測定結果表明(見圖5),甾體皂苷類成分在盾葉薯蕷植株中的分布表現出明顯的組織特異性,其中新生根莖和老根中均檢測到原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷5種皂苷,地上莖中檢測到原薯蕷皂苷和盾葉新苷2種皂苷,須根中檢測到原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷3種皂苷,葉片中檢測到偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷和三角葉薯蕷皂苷3種皂苷。另外,各組織部位對低磷脅迫的響應特征存在差異,由差異性分析結果可知脅迫初期盾葉薯蕷脅迫組老根、須根、葉片中甾體皂苷含量明顯低于正常組,而新生根莖與地上莖中皂苷含量整體高于正常組。脅迫初期盾葉薯蕷不同處理不同部位甾體皂苷類成分含量差異較大,而脅迫中后期整體差異減小,其中根莖對低磷脅迫的響應程度大于其他組織部位。

圖5 不同處理時期盾葉薯蕷不同部位5種甾體皂苷的含量Fig.5 Contents of five steroid saponins in rhizome of D.zingiberensis in different treatments and stages注:A.脅迫初期;B.脅迫中期;C.脅迫后期。Note:A.Early stage of stress;B.Middle stage of stress;C.Late stage of stress.

2.3 不同處理盾葉薯蕷脅迫初期各組織部位基因表達特征分析

低磷脅迫下盾葉薯蕷的生理代謝特征表明,脅迫初期為盾葉薯蕷響應低磷脅迫的關鍵時期。生理代謝是基因表達的最終表現形式,為了從基因水平上探討盾葉薯蕷響應低磷脅迫的機制,我們利用轉錄組測序對脅迫初期不同處理盾葉薯蕷根莖、葉片及地上莖的基因表達特征進行分析。

2.3.1 轉錄組測序與數據組裝結果分析

采用BGISEQ-500平臺對不同處理組盾葉薯蕷根莖、葉片、地上莖共9個轉錄組樣本分別測序,得到raw reads,去污染、去接頭后得到clean reads。利用Trinity對質量合格的clean reads進行組裝,9個樣本測序結果進行de novo組裝共得到101 593個Unigene,總長度為1.28×108nt,平均長度為1 256 nt,N50為1 918 nt,GC含量為43.67%。

2.3.2 轉錄組基因功能GO注釋與分布

所有Unigene結果注釋到GO數據庫的細胞組成、生物過程、分子功能三個方面,有26 090個Unigene獲得注釋,其中參與細胞組成分類的主要集中在細胞(8 069個)、膜部分(6 897個)和細胞器(3 125個);生物過程分類的主要集中在細胞過程(7 897個)、生物調節(2 635個)和代謝過程(2 072個);分子功能分類的主要集中在催化活性(12 115個)和結合蛋白(12 009個)。

2.3.3 盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達水平分析

由盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達量的箱線圖(見圖6A)可知,相同部位各處理組基因表達水平的波動較小。主成分分析(見圖6B)結果表明各處理不同部位樣品基因表達存在差異,同一部位的樣本各自聚集在一起,但同一部位不同處理的樣品離散分布。

圖6 盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達量的箱線圖(A)及主成分得分圖(B)Fig.6 Boxplot (A) and principal component score chart (B) of gene expression in different parts of D.zingiberensis

2.3.4 盾葉薯蕷不同部位各處理組間差異表達基因的統計分析

由盾葉薯蕷不同部位H組與Z組(部位-Hvs部位-Z)、N組與Z組(部位-Nvs部位-Z)差異基因統計結果可知(見圖7),在L-HvsL-Z和L-NvsL-Z中分別有8 448、5 009個基因上調表達,8 589、3 103個基因下調表達;R-HvsR-Z和R-NvsR-Z中分別有11 591、11 739個基因上調表達,6 374、5 802個基因下調表達;S-HvsS-Z和S-NvsS-Z中分別有9 881、6 066個基因上調表達,6 835、13 145個基因下調表達。

圖7 盾葉薯蕷不同部位各處理組間差異表達基因的統計分析Fig.7 Statistical analysis of differentially expressed genes in different parts of D.zingiberensis and treatment groups

2.3.5 盾葉薯蕷各部位不同處理差異表達基因的KEGG代謝通路分析

2.3.5.1 根莖部位不同處理組差異表達基因的KEGG代謝通路分析

根莖部位中度脅迫組與重度脅迫組(R-HvsR-Z)、正常組與重度脅迫組(R-NvsR-Z)兩組對比所得差異基因在KEGG數據庫中注釋到132條代謝通路,對最顯著富集的前20個通路進行分析(見圖8)。兩組共同富集的代謝通路有10條,分別為淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、吲哚生物堿生物合成途徑(ko00901)、異黃酮生物合成途徑(ko00943)、精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、光合作用-天線蛋白質(ko00196)、葉酸生物合成(ko00790)、氰氨基酸(ko00460)、苯丙烷類生物合成(ko00940)、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜辣素的生物合成途徑(ko00945)。在重度脅迫組與中度脅迫組中,與谷胱甘肽代謝途徑(ko00480)相關的基因有145個;在重度脅迫組與正常組中,與糖基磷脂酰肌醇(GPI)生物合成途徑(ko00563)相關的基因有51個,與甘油磷脂代謝(ko00564)相關的基因有168個。此外,兩組均有多個差異基因富集到有機酸類物質的代謝途徑。

圖8 盾葉薯蕷根莖不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.8 KEGG Pathway enrichment bubble map of differential genes in root of D.zingiberensis in different treatment groups注:A.R-H vs R-Z;B.R-N vs R-Z。

2.3.5.2 葉片部位不同處理組差異表達基因的KEGG代謝通路分析

葉片部位中度脅迫組與重度脅迫組(L-HvsL-Z)、正常組與重度脅迫組(L-NvsL-Z)兩組對比所得差異基因在KEGG數據庫中注釋到132條代謝通路,對最顯著富集的前20個通路進行分析(見圖9)。兩組對比共同富集的代謝通路有6條,分別為磷酸戊糖途徑(ko00030),倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成(ko00909),硒復合代謝(ko00450),類黃酮生物合成(ko00941),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250),淀粉和蔗糖代謝(ko00500)。此外,在重度脅迫組與中度脅迫組中,有38個差異基因富集在倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成途徑(ko00909)中;在重度脅迫組與正常組中,分別有90、73、32個差異基因富集在磷脂酰肌醇信號系統途徑(ko04070)、肌醇磷酸代謝途徑(ko00562)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)生物合成途徑(ko00563)。

圖9 盾葉薯蕷葉片不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.9 KEGG pathway enrichment bubble map of differential genes in D.zingiberensis leaves from different treatment groups注:A.L-H vs L-Z;B.L-N vs L-Z。

2.3.5.3 地上莖部位不同處理差異表達基因的KEGG代謝通路分析

地上莖部位中度脅迫組與重度脅迫組(S-HvsS-Z)、正常組與重度脅迫組(S-NvsS-Z)兩組對比所得差異基因在KEGG數據庫中注釋到132條代謝通路,對最顯著富集的前20個通路進行分析(見圖10)。兩組對比共同富集的代謝通路有11條,分別為甘油磷脂代謝(ko00564),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250),亞油酸代謝(ko00591),精氨酸生物合成(ko00220),萜類骨架生物合成(ko00900),倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成(ko00909),氰氨基酸代謝(ko00460),基礎切除修復(ko03410),苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(ko00400),卟啉和葉綠素代謝(ko00860),氨基酸的生物合成(ko01230)。

圖10 盾葉薯蕷地上莖不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.10 KEGG Pathway enrichment bubble map of differential genes in the stems of D.zingiberensis from different treatment groups注:A.S-H vs S-Z;B.S-N vs S-Z。

3 討論與結論

植物的生長是基因與環境共同作用的結果,低磷脅迫下,植物會通過體內的信號感受器獲得土壤磷缺乏的信號,通過復雜的信號轉導,啟動體內與低磷脅迫相關的基因表達,調控植物體內的生理生化過程,最終表現出一系列應答低磷脅迫的形態和生理生化特征[24]。本實驗從盾葉薯蕷地下部分發育特征、各部位SOD、POD活性、根際基質S-ACP活性、根際基質中磷含量及形態等多個指標分析低磷脅迫不同磷濃度處理下盾葉薯蕷各部位的響應特征,研究表明,Al-P、Fe-P與速效磷等較易被利用的磷在正常組中含量均高于重度脅迫組,尤其是Al-P含量在正常組、中度脅迫組、重度脅迫組依次減少,而且,盾葉薯蕷5個組織部位各脅迫組的POD活性整體上高于正常組,3個時期重度脅迫組根際基質酸性磷酸酶的活性均明顯高于正常組,這與土壤磷缺乏時植物發生的磷饑餓響應相一致[25];另外,研究結果表明,生長發育前期盾葉薯蕷對低磷脅迫的響應較為明顯,后期隨著盾葉薯蕷對低磷脅迫環境的適應,響應則逐漸減弱,反應特征趨于一致,這在一定程度上說明盾葉薯蕷對低磷脅迫的響應及調節是一個復雜的動態過程。

代謝調節是植物適應低磷脅迫的重要機制,甾體皂苷類成分是盾葉薯蕷主要的次生代謝產物和有效成分,本研究結果表明低磷脅迫影響盾葉薯蕷中甾體皂苷的合成,而且和生理特征的表現相同,各處理下不同部位的甾體皂苷類成分差異主要表現在脅迫初期。為了進一步從基因層面探討盾葉薯蕷對低磷脅迫的響應特征,本研究對脅迫初期不同處理盾葉薯蕷根莖、葉片、地上莖部位的基因表達特征進行分析,發現從三個部位中篩選到響應低磷脅迫潛在的差異基因主要涉及有機酸、肌醇、萜類骨架的生物合成及磷酸鹽等多個代謝途徑,這與根際基質中S-ACP活性增強、肌醇參與植物的信號傳導和逆境調節等生命活動[26]、萜類物質在植物抵抗逆境脅迫發揮重要作用[27]、磷酸鹽轉運蛋白(PHT)編碼基因在調節植物生長發育、根形態建成以及調節磷素平衡方面起著重要作用[28]一致。

文獻研究[29]報道盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷元主要在葉片中合成,經糖基化生成水溶性更好的皂苷后通過莖轉移到根狀莖中儲存,說明葉片可能是皂苷類成分主要的合成部位,根莖則為儲存部位,而本研究中低磷脅迫后各處理組差異基因最顯著富集的前20個通路表明,葉片部位最顯著富集的通路包括磷酸戊糖途徑、倍半萜類和三萜類化合物、肌醇的生物合成等,而根莖部位最顯著富集的通路則為淀粉和蔗糖代謝、吲哚生物堿生物合成途徑等。研究發現[23,30]參與甾體皂苷合成的相關基因涉及到萜類化合物合成的甲羥戊酸(MVA)途徑、2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑以及膽固醇生物合成途徑,這也進一步證實了葉片可能是盾葉薯蕷中皂苷類成分主要的合成部位,那么葉片中和皂苷類成分合成相關的基因如何響應低磷脅迫,后期可利用實時熒光定量qRT-PCR技術對低磷脅迫下盾葉薯蕷葉片中篩選到的涉及萜類骨架、有機酸、肌醇的生物合成的差異基因的表達模式進行驗證,進一步確定候選基因并對其進行表征與功能分析,探討其與植物的磷饑餓響應和甾體皂苷合成之間的關聯性,為研究盾葉薯蕷耐低磷的調控機制提供依據。