云南不同產地陽春砂內生真菌多樣性分析及其活性研究

俞 靜,李宜航,尹翠云,鄧招游,唐德英,張麗霞

中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所 云南省南藥可持續利用研究重點實驗室,景洪 666100

砂仁始載于唐代《藥性論》,是中國“四大南藥之一”,其主要為姜科豆蔻屬草本植物陽春砂A.villosum的干燥成熟果實,具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效[1]。現代研究表明砂仁的特征性成分主要為揮發油和黃酮類成分,具有抗消化性潰瘍、抗胃潰瘍、抗氧化、抗炎鎮痛等藥理活性[2,3]。陽春砂廣泛分布在我國廣東、云南、廣西和福建等地,其中云南已成為我國陽春砂的最大產區[4]。

內生真菌是定殖于健康植物不同組織部位的微生物類群,其種群類型和多樣性受宿主植物種類、部位、生態環境、種植位置等不同因素的共同影響。橡膠林下和自然條件兩種生境下艾納香葉片內生真菌組成和優勢菌屬均存在顯著差異[5];甘肅、內蒙和寧夏3個產區的甘草內生真菌分離率、種屬多樣性等都具有較大差異性[6]。內生真菌和宿主植物存在復雜的共生關系,與植物的生長發育以及次生代謝產物的積累也有密切聯系。藥用植物地黃中內生真菌GG22可明顯促進地黃梓醇及毛蕊花糖苷等物質的積累[7];丹參中內生真菌U104能提高丹參酮的積累[8];人參內生真菌Chaetomiumsp.與宿主植物人參在最佳的共培養誘導條件下能顯著提高人參不定根中人參皂苷的含量[9]。內生真菌在長期的進化過程中形成了豐富的代謝系統,會產生結構新穎和活性多樣的代謝產物,也會產生與宿主植物相似或相同的物質。北桑寄生的內生真菌Nemaniasp.可產生與宿主植物相同類型的黃酮類成分[10];從黃連內生真菌Albifimbriaviridis次生代謝產物中發現了對乳腺癌細胞具有顯著抑制作用的大環內酯類化合物[11]。綜上研究表明,對宿主植物與其內生真菌間的聯系進行探討具有重要意義,同時從藥用植物中分離和篩選具有活性的菌株也可作為獲取天然活性物質的潛在來源。

陽春砂的外觀性狀和品質始終是藥材市場首要考慮因素,課題組前期調研發現,云南西雙版納和馬關產的陽春砂樣品存在一定差異性,為初步探究二者差異性的原因及陽春砂宿主植物與其內生真菌間的作用機制。本研究分別以西雙版納和馬關自然林下的陽春砂作為研究材料,對其根、莖、葉部位內生真菌進行分離鑒定,分析和比較了兩地陽春砂內生真菌的多樣性,為進一步探討影響陽春砂品質的因素,同時為充分利用和開發砂仁內生真菌資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

兩年生陽春砂于2021年12月分別采自云南西雙版納勐臘縣勐臘鎮和云南文山馬關縣八寨鎮,兩地采集的新鮮無病害陽春砂植株均為自然林下種植,經中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所張麗霞研究員鑒定為陽春砂AmomumvillosumLour.。陽春砂植株標本(YJ-SR08和YJ-SR09)均保存在中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所南藥重點研究實驗室。

1.2 供試菌株

細菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC25922)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ATCC6633)、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes,ATCC13048)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi,CMCC(B)50071)均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 試劑

甲醇(批號:20221005,分析純)、乙酸乙酯(批號:20211028,分析純)、次氯酸鈉(批號:P2079439,分析純)、硫酸亞鐵(批號:20210807,分析純)、水楊酸(批號:P1372875,99%)、30%過氧化氫均購自昆明仁科商貿有限公司;硫酸鏈霉素(批號:P1926944,720 IU/mg)、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(批號:Z6B8N-SO,97%)、抗壞血酸(批號:P1552401,99%)、鐵氰化鉀(批號:P1586039,99%)、三氯乙酸(批號:P2067948,99%)、三氯化鐵(批號:P1599135,99%)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、瓊脂粉、酵母提取物、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒均購自上海泰坦科技股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 內生真菌的分離純化

新鮮陽春砂植株洗凈,于超凈工作臺中用50%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min,取出洗凈,再用75%的乙醇溶液浸泡2 min,取出洗凈,消毒過程中暴露的末端舍去,余下的用于接種。培養皿恒溫培養3～15 d,每天觀察待組織邊緣長出菌落時,轉接于新培養皿中,重復4～5次,純化至得到形態顏色完全一致的單菌落。最后一次清洗樣品的無菌水作為樣品觀察其無任何菌落生長,以保證分離得到的菌株為內生真菌且無染菌。已純化的菌株于PDA斜面上保存。

1.4.2 內生真菌的鑒定

菌絲用液氮研磨至粉末狀,提取DNA,用ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。由昆明碩擎生物科技有限公司對擴增結果進行測序,測序片段用BLAST處理,運用MEGA 7.0中的鄰接法(neighbor-joining methods,NJ)、基于Kimura 2-parameter距離構建菌株系統發育樹,并以自展法(bootstrap)進行檢測,自展次數設為1 000次。

1.4.3 統計分析方法

1.4.3.1 內生真菌的分離頻率(isolation frequency,IF):用來衡量陽春砂中不同種或屬真菌的優勢度,計算公式為:IF =N1/N×100%,N1為同一種或屬真菌的株數,N為真菌總株數。IF>10%為優勢種(屬);1%≤IF≤10%為常見種(屬);IF<1%為稀有種(屬)[12]。

1.4.3.3 辛普森多樣性指數(Simpson,D):用于研究內生真菌種類多樣性(用于比較同一個群落生物多樣的高低),計算公式為:D= 1-∑P2i,數值范圍為0～1,D越大,相應群落內生真菌多樣性越高。

1.4.3.4 種類均勻度(species evenness,E):表示內生真菌種類的均勻程度,計算公式為:E=H′/lnS,S表示種類的豐富度。

1.4.3.5 相似性系數(Jaccard,CJ):用于比較不同產地兩種植物間內生真菌種類組成的相似程度,計算公式為:CJ=j/(a+b-j),j為2個產地陽春砂共有內生真菌種數或屬數,a為西雙版納產陽春砂內生真菌種數或屬數,b為馬關產陽春砂內生真菌種數或屬數。

1.4.4 抑菌活性測定

1.4.4.1 供試品的制備

菌株接種于大米培養基中室溫靜置培養30 d,乙酸乙酯超聲萃取后減壓蒸干即得浸膏。用甲醇將浸膏分別配成5.0 mg/mL的待測溶液,陽性對照鏈霉素也配成相同濃度溶液備用。供試菌株活化后接種于LB液體培養基,37 ℃震蕩培養16～17 h,將培養液稀釋至菌落個數為1×105～1×106CFU/mL,即得供試菌液。

1.4.4.2 濾紙片法抑菌試驗

取200 μL稀釋菌液加到LB固體培養基上,用涂抹棒均勻涂抹。分別各取20 μL待測溶液和鏈霉素溶液滴加到直徑6 mm的圓形濾紙片上,待溶劑揮干,用鑷子置于含菌培養皿上,同時滴加相同體積甲醇的濾紙片作為陰性對照。于37 ℃恒溫培養箱培養24 h,用游標卡尺測量抑菌圈大小,所有操作均重復三次[13]。

1.4.5 抗氧化活性評價

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取1 mL試樣溶液和3 mL 0.1 mmol/mL的DPPH溶液置于10 mL離心管中靜置30 min,5 000 r/min離心5 min,在517 nm下測定吸光度為A1。將DPPH溶液換成無水乙醇重復操作測定吸光度A2,將試樣溶液換成超純水重復操作測定吸光度A0。將清除率對受試物濃度對數進行非線性回歸擬合抑制曲線計算IC50值。陽性對照為Vc,同一試樣重復3次[14]。按下式計算清除率。

清除率= [1-(A1-A2)/A0] × 100%

1.4.5.2 羥基自由基清除能力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取1 mL試樣溶液于10 mL離心管中,依次加入1 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,搖勻后靜置6 min,再加入1 mL過氧化氫溶液。搖勻后2 500 r/min離心20 min,在510 nm下測定吸光度為A1。用超純水替代過氧化氫測定吸光度為A2,用無水乙醇代替樣品溶液測定吸光度為A0。將清除率對受試物濃度對數進行非線性回歸擬合抑制曲線計算IC50值。以Vc作為陽性對照,同一試樣重復3次[14]。清除率計算公式與DPPH自由基清除相同。

1.4.5.3 總還原力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取2.5 mL試樣溶液于15 mL離心管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/mL pH = 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。混勻后置于50 ℃水浴保溫20 min后取出,迅速冷卻。再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混勻后2 000 r/min離心10 min。取上層清液2.5 mL,依次加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,搖勻后靜置10 min。在700 nm處測定吸光度(A),以Vc作為陽性對照,同一試樣重復三次。將Vc用無水乙醇配成濃度梯度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1 mg/mL的待測溶液,按同法測定吸光度(A),以Vc的濃度值為橫坐標,測得的吸光度值(A)為縱坐標繪制標準曲線圖[14]。

2 結果與分析

2.1 陽春砂內生真菌鑒定及菌落組成

2.1.1 西雙版納陽春砂內生真菌鑒定

從西雙版納陽春砂根、莖和葉中共分離純化出39株內生真菌,其中根部18株、莖部12株、葉部9株,歸屬為13目23科(含4個未知科)27屬(含3個未知屬)。根據菌株的分子生物學進行結果鑒定(見表1),內生真菌系統發育進化分析見圖1(菌株BSR 19、36-37因ITS系列相似度低于97%,不能準確地比對到目前已知的種類)。

圖1 基于ITS序列的西雙版納陽春砂內生真菌系統發育進化分析Fig.1 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi separated from Xishuangbanna A.villosum

表1 西雙版納陽春砂內生真菌分離鑒定及相對分離頻率

2.1.2 馬關陽春砂內生真菌鑒定

從馬關陽春砂根、莖和葉中共分離純化出38株內生真菌,其中根部18株、莖部9株、葉部11株,歸屬為15目24科(含3個未知科)30屬(含2個未知屬)。根據菌株的分子生物學進行結果鑒定(見表2),內生真菌系統發育進化分析見圖2(菌株MSR 9、MSR 14、MSR 23因ITS系列相似度低于97%,不能準確地比對到目前已知的種類)。

圖2 基于ITS序列的馬關陽春砂內生真菌系統發育進化分析Fig.2 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi separated from Maguan A.villosum

表2 馬關陽春砂內生真菌分離鑒定及相對分離頻率

2.1.3 云南陽春砂內生真菌菌群組成

綜合整理表1和表2可知,從采自云南西雙版納和馬關兩個地區產陽春砂的根、莖和葉中共分離獲得77株內生真菌。從分離頻率來看,西雙版納與馬關陽春砂內生真菌的優勢菌群存在一定差異,西雙版納陽春砂中分離頻率最高的菌群為Penicillium和Colletotrichum,占總菌株數的10.26%,其次是占總菌株數5.13%的Xylaria、Daldinia、Diaporthe等;而馬關陽春砂中分離頻率最高的是Penicillium,占總菌株數的7.89%,其次是占總菌株數5.26%的Phanerochaete、Pyrenochaetopsis、Neopestalotiopsis和Cladosporium,說明西雙版納和馬關陽春砂內生真菌菌群組成存在一定差異性。

總體上來看,77株內生真菌分布在子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉菌門(Mucoromycota)。其中子囊菌門為優勢門類,分離率為88.31%(68/77)。其中子囊菌綱為優勢綱,共43株,分離率為55.84%,包括炭角菌目、肉座菌目、小叢殼目、間座殼菌目等;座囊菌綱共16株,分離率為20.78%,包括球腔菌目、格孢腔菌目、葡萄座腔菌目等;散囊菌綱共8株,分離率為10.39%,包括散囊菌目和刺盾炱目。錘舌菌綱1株,分離率最低,為1.30%,只檢出柔膜菌目。擔子菌門的分離率為10.39%(8/77),8株均為傘菌綱,包括銹革孔菌目、多孔菌目、紅菇目和傘菌目;毛霉菌門的分離率最低,1.30%(1/77),僅有毛霉菌綱。從種屬水平上看,所有菌群均為常見種屬。

2.2 陽春砂內生真菌多樣性

通過對陽春砂樣品根、莖和葉三個不同組織中分離得到內生真菌的多樣性進行分析,結果見表3。分離鑒定的77個種群,其中根36個,莖21個,葉20個。陽春砂根部、莖部和葉部的H′分別為3.029 9、2.682 0和2.595 4,陽春砂根部、莖部和葉部的D分別為0.942 9、0.949 0和0.876 5。綜上表明,根、莖和葉三個部位的內生真菌多樣性存在一定差異,且種類豐富度也各不相同,其中根部內生真菌種類較多,葉部較少。三個組織內生真菌總H′和D分別為3.485 1和0.965 6。

表3 陽春砂不同組織部位內生真菌多樣性

由表4可知,馬關陽春砂內生真菌的H′為3.271 8,D為0.963 2均高于西雙版納陽春砂內生真菌,其H′為3.111 5,D為0.953 1,表明馬關產區陽春砂內生真菌類群多樣性較西雙版納產區豐富。從兩個產區真菌均勻度來看,馬關的E為0.899 4,也高于西雙版納。此外,馬關和西雙版納陽春砂內生真菌的CJ為0.222 2,屬于極不相似程度,說明兩地陽春砂內生真菌存在顯著差異性。

表4 不同樣品采集地陽春砂內生真菌多樣性指數

2.3 陽春砂內生真菌發酵物抗菌活性

據表5可知,綜合分析共有29株陽春砂內生真菌發酵物表現出抑菌作用,其中對三株細菌同時具有抑制作用的內生真菌2株,菌株BSR 18抑制活性較強;對兩株細菌同時具有抑制作用的11株,菌株BSR 32抑制活性較強;對一株細菌表現抑制作用的16株。對大腸桿菌抑制作用最強的菌株為BSR 34,對枯草芽孢桿菌抑制作用最強的菌株為BSR 32和MSR 15,對傷寒沙門氏菌抑制作用最強的菌株為BSR 10和BSR 32。而所有菌株發酵物對金黃色葡萄球菌和產氣腸桿菌的抑制活性均不強。

表5 內生真菌發酵產物的抑菌活性

2.4 內生真菌發酵物的抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力

由表6可知,除分自馬關陽春砂中MSR 5和MSR 22外,其他77株內生真菌發酵物均對DPPH自由基表現出一定程度的清除活性,其中BSR 10和BSR 18較強,清除率分別為84.87%和81.34%,IC50值分別為71.17和84.12 μg/mL,分屬于Biscogniauxia和Diaporthe屬,菌株BSR 10來源于根部,BSR 18來源于莖部。

表6 內生真菌發酵產物的抗氧化活性

2.4.2 羥基自由基清除能力

由表6可知,77株內生真菌發酵物對羥基自由基均表現出一定程度的清除活性,其中清除率超過80%的菌株有7株,分別為BSR 2、BSR 11、MSR 11、MSR 16、MSR 19、MSR 21、MSR 28,清除率依次為84.95%、90.68%、87.56%、86.69%、83.05%、87.03%、88.98%,IC50值分別為88.66、57.23、82.60、81.72、81.46、69.55、66.71 μg/mL。包括Fusarium、Xylariaceae、Colletotrichum、Cladosporium、Periconia、Barnettozyma屬,除菌株MSR 28來源于莖部,其余6株來源于根部。

2.4.3 總還原力

由表6可知,77株內生真菌發酵物均表現出一定程度的總還原力,其中維生素C當量超過16 μg/mL的菌株有9株,分別為BSR 10、BSR 18、BSR 22、BSR 32、MSR 1、MSR 13、MSR 23、MSR 27、MSR 31,維生素C當量依次為16.50、16.82、22.96、20.42、16.36、16.86、17.04、19.89、16.35 μg/mL,包括Biscogniauxia、Diaporthe、Colletotrichum、Penicillium、Neopestalotiopsis、Trichoderma、Pyrenochaetopsis、Phyllosticta屬。菌株BSR 18和MSR 23來源于莖部,BSR 22、MSR 27和MSR 31來源于葉部,其余4株來源于根部。

3 討論與結論

關于砂仁內生真菌方面的研究已有部分報道,Xiao等[15]分析比較了廣東陽春市陽春砂和云南瀘水市陽春砂莖和葉內生真菌的差異性,結果表明二者內生真菌種類較多,且組成具差異性,各自有不同的優勢菌株,但缺少對根部內生真菌相關的研究;Cao等[16]將內生真菌的解磷功能作為切入點,以云南紅河產區的陽春砂為研究對象,在根部發現有8株內生真菌具有解磷能力;Zhang等[17]僅對陽春砂內生真菌多樣性進行了初步分析。本實驗對云南西雙版納和馬關兩個地區陽春砂根、莖和葉部位內生真菌進行了分離鑒定,共77株,歸屬為18目35科(含7個未知科)44屬(含5個未知屬),根部菌株種類豐富,莖和葉部位菌株種類較根部少。對二者間多樣性進行比較發現,西雙版納與馬關陽春砂內生真菌的優勢菌群和總體菌落組成均存在差異性。另外,馬關產區陽春砂內生真菌類群多樣性較西雙版納產區豐富,上述研究可為深入探討宿主植物陽春砂的差異提供一定的參考依據。

砂仁可作為開發具抑菌和抗氧化作用物質的來源之一,Cao等[18]分析了陽春砂葉和桿乙醇提取物對常見細菌的抑制作用,結果表明砂仁葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果最好,砂仁桿乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果最好;Cao等[19]還發現砂仁生品的石油醚萃取物對大腸桿菌的抑菌效果最顯著;砂仁水提物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也具有抑制作用[20];Tang等[21]發現部分砂仁粗提物表現出較強的體外抗氧化活性。另外,Zhang等[22]從砂仁內生真菌LetendraeahelminthicolaA696的次生代謝產物中發現了一個新的倍半萜類化合物。基于上述研究,本研究通過DPPH自由基清除、羥基自由基清除和總還原力實驗分析了從云南西雙版納和馬關陽春砂中獲得的77株內生真菌發酵粗提物的抗氧化活性,并通過濾紙片法評價了粗提物的抗細菌活性,結果顯示部分菌株兼具抗菌和抗氧化活性,其中BSR 10、BSR 18和BSR 32可作為進一步挖掘具天然生物活性先導化合物的新途徑,也可實現對陽春砂資源的充分可持續利用與開發。