木芙蓉葉乙酸乙酯部位抗氧化與抗炎作用研究及UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

黃李璐,夏厚林,馮麗萍,葉 磊,嚴(yán) 鑫,熊 靜,馮五文,胡 攀*

1成都市中草藥研究所,成都 610016;2成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137

木芙蓉葉為錦葵科木槿屬植物木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)的干燥葉,收載于2020版《中國藥典》,主產(chǎn)我國四川、湖南、廣東、云南等地。氣微,味辛平,具有涼血、解毒、消腫、止痛等功效[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]記載:“稟夏末秋初之氣,故其味辛,辛屬金化,故能清肺,其氣平平即涼也,故能涼血散熱解毒,兼治一切癰疽腫毒惡瘡,排膿止痛,小兒疳積。”現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,木芙蓉葉有良好的抑菌、抗感染和抗病毒作用[3],對腎缺血再灌注損傷和慢性肝損傷具有保護(hù)作用[4,5]。木芙蓉葉中的主要化學(xué)成分有黃酮類、有機(jī)酸類、酚類、氨基酸、鞣質(zhì)、糖類、甾體類化合物及揮發(fā)油類[6]。

課題組前期[7]通過木芙蓉葉對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率,已初步確定木芙蓉葉乙酸乙酯部位具有較好的抗氧化活性,黃酮類成分可能為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。但體外化學(xué)法無法準(zhǔn)確反映活性物質(zhì)在生物體內(nèi)的真實(shí)作用,故本研究構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,測定活性氧(ROS)的產(chǎn)生,探究木芙蓉葉不同極性部位對HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用,建立LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型,測定乙酸乙酯部位抑制細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的程度,從細(xì)胞層面上對其抗氧化和抗炎作用進(jìn)一步研究,并基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對木芙蓉葉乙酸乙酯部位化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,對藥效部位精準(zhǔn)分析,研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位的主要成分為黃酮及其苷類成分,為全面闡釋木芙蓉葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

HaCaT細(xì)胞(人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞)、RAW 264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞)購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物與試劑

30%過氧化氫(H2O2,批號:2021051801,成都市科隆化學(xué)品有限公司);胎牛血清(批號:12B052)、雙抗(批號:04052938)、DMEM低糖培養(yǎng)基(批號:8121295)(上海泰坦科技股份有限公司);0.25% EDTA-胰蛋白酶(批號:CR2012027,Servicebio公司);CCK-8試劑盒(批號:20010149,Proteintech公司);ROS檢測試劑盒(批號:101121220118)、脂多糖(LPS,批號:ST-1470)、地塞米松(DXM,批號:2066651)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號:027E2232EA)、RNA isolaterTotal RNA Extraction Reagen(批號:017E2231FA)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);秦皮素(批號:MUST-21103019,成都曼斯特生物科技有限公司);蘆丁(批號:MUST-21012102)、異槲皮苷(批號:wkq20060104)(四川省維克奇生物科技有限公司);山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號:DSTDS007501,成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司);銀椴苷(批號:CHB180214,成都克洛瑪生物科技有限公司),純度均≥98%。

木芙蓉葉樣品于2020年10月中旬采收于成都市植物園(成都市金牛區(qū)外北天回鎮(zhèn)蓉都大道1116號),經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛教授鑒定為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的葉。

1.1.3 儀器

SpectraMax I d5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司);qTOWER3 G touch熒光定量基因擴(kuò)增儀(德國耶拿分析儀器股份公司);DS-11超微量紫外可見分光光度計(jì)(美國丹諾爾Denovix公司);ForeAmp-SN695基因擴(kuò)譜儀(成都凡晶生物技術(shù)有限公司);Thermo Scientific Q Exactive-MS高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

取木芙蓉葉中粉10 g,加10倍量70%乙醇回流提取2次,分別為2 h、1.5 h,濾過、合并濾液,濃縮至無醇味,加水至100 mL使成混懸液,依次使用等體積石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取,各萃取3次,分別合并、減壓濃縮、干燥為浸膏,萃取后的剩余水溶液,減壓濃縮、干燥,即得石油醚部位(petroleum ether extract,E1)、乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract,E2)、正丁醇部位(n-butanol extract,E3)和水部位(aqueous extract,E4)。精密稱取各部位樣品適量,加入DMSO溶解,制成200 mg/mL的儲(chǔ)備液。用完全培養(yǎng)基(含DMEM低糖培養(yǎng)基,10%胎牛血清,1%雙抗)稀釋儲(chǔ)備液,得到質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400、800 μg/mL的木芙蓉葉不同極性部位供試品溶液。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL,并設(shè)置加入100 μL完全培養(yǎng)基,不含細(xì)胞的孔作為空白組,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)孔中的完全培養(yǎng)基,重新加入100 μL完全培養(yǎng)基作為對照組(control,CON),加入100 μL濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL的木芙蓉葉不同極性部位供試品溶液作為給藥組,每組5個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。吸棄原培養(yǎng)基,每孔加入110 μL CCK-8測試液(100 μL完全培養(yǎng)基與10 μL CCK-8檢測液配制),將96孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h,用酶標(biāo)儀于檢測波長450 nm處測定吸光度值。同法測定給藥組為25、50、100、200、400、800 μg/mL的木芙蓉葉不同極性部位供試品溶液對RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響,酶標(biāo)儀于檢測波長450 nm處測定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As:給藥孔吸光度,Ac:對照孔吸光度,Ab:空白孔吸光度。

1.2.3 HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量測定

利用熒光探針DCFH-DA檢測HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平,按照1×104個(gè)/孔密度接種細(xì)胞于黑色不透光96孔板,置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。除去完全培養(yǎng)基,對照組和模型組(model,MOD)加入200 μL無血清培養(yǎng)基(含DMEM低糖培養(yǎng)基,1%雙抗),給藥組分別加入200 μL無血清培養(yǎng)基稀釋儲(chǔ)備液后濃度為200 μg/mL的木芙蓉葉不同極性部位溶液以及25、50、100、200 μg/mL的木芙蓉葉乙酸乙酯部位溶液,每組6個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后,模型組和給藥組每孔加入250 μmol/L H2O2,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后除去培養(yǎng)基,用適量的PBS洗滌細(xì)胞3次,加入適當(dāng)體積用無血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為10 μmol/L的DCFH-DA,于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,使用熒光酶標(biāo)儀測定每組在488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 q-PCR測定炎癥因子表達(dá)

將RAW 264.7細(xì)胞按每孔2×105個(gè)/孔均勻鋪于六孔板,置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h,至細(xì)胞密度達(dá)80%以上。將細(xì)胞分為對照組、給藥組、模型組,每組3個(gè)復(fù)孔。給藥組加入25、200 μg/mL木芙蓉葉乙酸乙酯部位供試品以及10 μmol/L的地塞米松溶液,置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后,對照組不予任何處理,給藥組和模型組加入LPS溶液至每孔濃度為1 μg/mL,放入培養(yǎng)箱中孵育12 h。利用Trizol法提取各組細(xì)胞中Total RNA,使用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測Total RNA樣品濃度值,完成體系配制,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成cDNA。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配置反應(yīng)體系,上機(jī)檢測,記錄輸出的CT值,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,以2-△△CT計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析木芙蓉葉乙酸乙酯部位化學(xué)成分

1.2.5.1 供試品溶液的制備

精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下制備的木芙蓉葉乙酸乙酯部位樣品適量,加入70%乙醇溶液溶解并定容,制備為0.2 mg/mL的溶液,再以0.22 μm的微孔濾膜濾過,得供試品溶液。

1.2.5.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取秦皮素、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、銀椴苷適量,用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為32.97、44.82、48.86、18.63、102.79 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.5.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脫(0.01～3 min:5%→11%B;3～4 min:11%→12%B;4～16 min:12%B;16～23 min:12%→15%B;23～33 min:15%→19%B;33～40 min:19%→26%B;40～58 min:26%B);流速0.25 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

1.2.5.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀為Thermo Scientific Q Exactive-MS高分辨質(zhì)譜儀;電噴霧離子源,正/負(fù)離子模式(ESI+/ESI-);離子源溫度:120 ℃,噴霧電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:300 ℃,探頭加溫器溫度:350 ℃,鞘氣流速:35 psi,輔助氣流速:10 psi,最大噴霧電流:100 A,S-Lens分辨率:50,在100～1 500m/z范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 木芙蓉葉不同極性部位對細(xì)胞存活率的影響

采用CCK-8試劑盒檢測25、50、100、200、400、800 μg/mL木芙蓉葉不同極性部位對HaCaT細(xì)胞的毒性,以及對RAW 264.7細(xì)胞的毒性,當(dāng)存活率大于90%時(shí),可認(rèn)為該藥物濃度對細(xì)胞無毒性作用,結(jié)果如圖1A所示,木芙蓉葉不同極性部位在25～200 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),對HaCaT細(xì)胞無細(xì)胞毒性,當(dāng)濃度大于400 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率明顯低于90%,HaCaT細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。如圖1B所示,木芙蓉葉不同極性部位在25～200 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),對RAW 264.7細(xì)胞無毒性作用,濃度大于400 μg/mL后,RAW 264.7細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01),結(jié)果說明,給藥濃度過高對HaCaT細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞有一定的刺激性,影響其存活率。

圖1 木芙蓉葉不同極性部位對細(xì)胞存活率的影響(ˉx ± s,n = 5)Fig.1 Effect of different polar extracts of Hibisci Mutabilis Folium on the survival rate of cells (ˉx ± s,n = 5)注:A為HaCaT細(xì)胞存活;B為RAW 264.7細(xì)胞存活率。與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:A is the survival rate of HaCaT cells;B is the survival rate of RAW 264.7 cells.Compared with the control group,*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001.

2.2 木芙蓉葉不同極性部位的比較及乙酸乙酯部位對HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)

HaCaT細(xì)胞生長較快,適應(yīng)性強(qiáng),穩(wěn)定性高,常應(yīng)用于抗氧化功效的評價(jià),ROS過度增加或持續(xù)存在可對細(xì)胞形成氧化應(yīng)激,造成多種損傷,利用H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型是評價(jià)抗氧化活性的重要細(xì)胞模型[8-10]。由圖2A可知,模型組與對照組相比,ROS含量顯著升高(P<0.001),說明H2O2能成功誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了較多的ROS,模型建造成功。與模型組對比,木芙蓉葉不同極性部位都顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS含量(P<0.01),降低程度依次為乙酸乙酯部位>水部位>石油醚部位>正丁醇部位,其中乙酸乙酯部位供試品溶液給藥后HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量最低,說明乙酸乙酯部位為木芙蓉葉不同極性部位中對細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用最強(qiáng)的部位。由圖2B可知,乙酸乙酯部位給藥濃度為25、50、100、200 μg/mL時(shí),都顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS含量(P<0.001),其中,濃度為100 μg/mL時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS含量與對照組相近。給藥濃度越高,清除ROS的能力越強(qiáng),對HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用越強(qiáng)。

圖2 木芙蓉葉不同極性部位及乙酸乙酯部位對HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響(ˉx ± s,n = 6)Fig.2 Effect of different polar extracts of Hibisci Mutabilis Folium on ROS content in HaCaT cells (ˉx ± s,n = 6)注:與對照組相比,###P<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:Compared with the control group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001.

2.3 木芙蓉葉乙酸乙酯部位對RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型炎癥因子表達(dá)的影響

RAW 264.7細(xì)胞在炎癥因子釋放、修復(fù)炎癥中具有重要作用,是體內(nèi)重要的先天免疫細(xì)胞,細(xì)胞生長速度快,培養(yǎng)方便[11],選擇RAW 264.7細(xì)胞來構(gòu)建炎癥模型。通過CCK-8法測定細(xì)胞存活率,根據(jù)給藥濃度范圍設(shè)置25、200 μg/mL的低高濃度給藥組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步對木芙蓉葉乙酸乙酯部位的抗炎活性進(jìn)行評價(jià),測定模型組、對照組和給藥組RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的表達(dá)量。結(jié)果見表1和圖3,與對照組比較,模型組炎癥因子表達(dá)顯著升高(P<0.001),說明成功建立炎癥模型。乙酸乙酯部位給藥濃度為200 μg/mL時(shí),能明顯抑制RAW 264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2 mRNA的表達(dá)(P<0.001),對細(xì)胞中的炎癥因子具有明顯的抑制作用,具有良好的抗炎活性。

表1 木芙蓉葉乙酸乙酯部位對RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2表達(dá)的影響(ˉx ± s,n = 3)

圖3 木芙蓉葉乙酸乙酯部位對RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2表達(dá)的影響(ˉx ± s,n = 3)Fig.3 Effect of ethyl acetate extract of Hibisci Mutabilis Folium on the expression of TNF-α,IL-6,iNOS and COX-2 on RAW 264.7 cells inflammatory model (ˉx ± s,n = 3)注:與對照組相比,###P<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:Compared with the control group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001.

2.4 木芙蓉葉乙酸乙酯部位化學(xué)成分分析

采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對木芙蓉葉乙酸乙酯部位中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測分析,在正離子模式和負(fù)離子模式下的離子流圖分別見圖4、圖5。根據(jù)化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律,結(jié)合mz Cloud、mz Vault、PubChem等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,通過對照品對照和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對[12-18]共鑒定出28個(gè)化合物,包括10個(gè)黃酮類、9個(gè)有機(jī)酸類、2個(gè)香豆素類、2個(gè)酚類、2個(gè)核苷類及3個(gè)其他類成分,其中5個(gè)成分經(jīng)對照品比對確證,化學(xué)成分的分析見表2。

表2 木芙蓉葉乙酸乙酯部位的化學(xué)成分分析

圖4 木芙蓉葉乙酸乙酯部位的UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of the ethyl acetate extract of Hibisci Mutabilis Folium by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

圖5 木芙蓉葉乙酸乙酯部位的UPLC-Q-Orbitrap HRMS負(fù)離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of the ethyl acetate extract of Hibisci Mutabilis Folium by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

2.4.1 黃酮類

黃酮類化合物是木芙蓉葉中的主要化學(xué)成分,從木芙蓉葉乙酸乙酯部位中共鑒定出10個(gè)黃酮及其苷類成分。其中,化合物23為黃酮類,化合物21為黃酮苷類;化合物19、28為黃酮醇類,化合物18、20、22、25、27為黃酮醇苷類;化合物26為二氫黃酮類。以黃酮苷元為母核,糖基種類的不同、連接位置不同,產(chǎn)生了各種黃酮苷類化合物。黃酮苷類化合物的裂解規(guī)律以糖苷鍵斷裂為主,過程中包括黃酮苷元C環(huán)上的逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(RDA)裂解及CHO、CO2、CO、H2O等中性離子的丟失[12]。

化合物18在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z611.163 4[M+H]+、633.146 7[M+Na]+,確定化合物相對分子質(zhì)量為610,根據(jù)元素組成分析分子式為C27H30O16,二級質(zhì)譜中丟失蕓香糖殘基及裂解,形成特征離子m/z303.051 3[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+、465.104 5[M+H-C6H10O4]+,根據(jù)文獻(xiàn)信息[13,14]及與對照品比對,確定化合物18為蘆丁,裂解途徑見圖6。化合物21在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z449.108 2,推測其結(jié)構(gòu)式為C21H20O11,脫去葡萄糖殘基及裂解后形成二級碎片離子m/z153.018 9[M+H-C6H10O5-C8H6O3]+、287.056 4[M+H-C6H10O5]+,綜合裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[13],推測該化合物為木犀草苷。

圖6 蘆丁的裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of rutin

2.4.2 有機(jī)酸類

木芙蓉葉乙酸乙酯部位中鑒定出9個(gè)有機(jī)酸類成分(化合物3、5、6、9、10、14、15、16、24),有機(jī)酸類大多在負(fù)離子模式下有較好響應(yīng),二級質(zhì)譜裂解易失去CO、CO2、CH2、H2O等中性碎片。化合物5在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z153.019 2[M-H]-,確定分子式為C7H6O4,裂解后形成二級碎片離子m/z108.020 8[M-H-CHO2]-,m/z109.028 9[M-H-CO2]-,根據(jù)其裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[15],推測其為2,4-二羥基苯甲酸,裂解途徑見圖7。化合物24在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z187.097 8[M-H]-,其分子式為C9H16O4,裂解后形成二級碎片離子m/z97.065 2[M-H-H2O-C2O3]-、125.096 7[M-H-H2O-CO2]-、143.107 6[M-H-CO2]-,根據(jù)裂解特性及文獻(xiàn)報(bào)道[13],推測其為壬二酸。

圖7 2,4-二羥基苯甲酸的裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of 2,4-dihydroxybenzoic acid

2.4.3 香豆素類

木芙蓉葉乙酸乙酯部位中鑒定出2個(gè)香豆素類成分(化合物7、11),其二級質(zhì)譜裂解常失去CO、H2O、CH3等中性碎片。化合物11在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z207.030 4[M-H]-,確定分子式為C10H8O5,裂解后形成二級碎片離子m/z147.008 6[M-H-CH3-CHO2]-、192.006 6[M-H-CH3]-,根據(jù)其裂解特性、文獻(xiàn)報(bào)道[13]及與對照品比對,確定化合物為秦皮素,裂解途徑見圖8。

2.4.4 酚類

木芙蓉葉乙酸乙酯部位中鑒定出2個(gè)酚類成分(化合物13、17),其二級質(zhì)譜裂解常失去NO2、NO、CNO2、CHO、CO、OH等中性碎片。化合物17在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z138.019 6[M-H]-,確定分子式為C6H5NO3,裂解后形成二級碎片離子m/z93.033 8[M-H-NO2]-,m/z108.021 1[M-H-NO]-,根據(jù)其裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[16],推測其為4-硝基苯酚,裂解途徑見圖9。

圖9 4-硝基苯酚的裂解途徑Fig.9 Fragmentation pathway of 4-nitrophenol

2.4.5 核苷類

木芙蓉葉乙酸乙酯部位中鑒定出2個(gè)核苷類成分(化合物1、2),核苷類成分主要經(jīng)歷核糖碎裂,以及堿基母核的進(jìn)一步裂解,其二級質(zhì)譜裂解常失去NH3、CHN、CO等中性碎片。化合物2在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z268.105 9[M+H]+,確定分子式為C11H9N9,脫去呋喃核糖后形成二級碎片離子m/z94.040 9[M+H-C5H8O4-CHN-NH2]+,m/z119.036 2[M+H-C5H8O4-NH3]+、m/z136.061 8[M+H-C5H8O4]+,根據(jù)其裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[13],推測其為腺苷,裂解途徑見圖10。

圖10 腺苷的裂解途徑Fig.10 Fragmentation pathway of adenosine

2.4.6 其他類

木芙蓉葉乙酸乙酯部位中鑒定出3個(gè)其他類成分(化合物4、8、12),化合物4在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z166.087 0[M+H]+,確定分子式為C9H11NO2,裂解后形成二級碎片離子m/z103.055 1[M+H-NH3-HCOOH]+、120.081 6[M+H-HCOOH]+、131.049 8[M+H-NH3-H2O]+、149.060 3[M+H-NH3]+,根據(jù)其裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[17],推測其為L-苯丙氨酸,裂解途徑見圖11。化合物8在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z137.024 1[M-H]-,其分子式為C7H6O3,裂解后形成二級碎片離子m/z109.029 01[M-H-CO]-,根據(jù)其裂解特性以及文獻(xiàn)報(bào)道[18],推測其為2,5-二羥基苯甲醛。

圖11 L-苯丙氨酸的裂解途徑Fig.11 Fragmentation pathway of L-phenylalanine

3 討論與結(jié)論

ROS是細(xì)胞氧化代謝的產(chǎn)物,過度增加或持續(xù)存在會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷,H2O2可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的ROS,是氧化應(yīng)激損傷模型中理想的誘導(dǎo)物質(zhì)[8,10],HaCaT細(xì)胞易于獲取,適應(yīng)性強(qiáng),穩(wěn)定性高,利用H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型是評價(jià)抗氧化活性的常見細(xì)胞模型[9,10]。TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2是典型的炎癥因子,LPS是常見的致炎因子,巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者,介導(dǎo)了炎癥過程中各種免疫病理的發(fā)展,利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞是研究炎癥因子的經(jīng)典細(xì)胞模型[11]。目前已發(fā)布團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中將這兩種方法作為化妝品抗皺以及舒緩功效稱謂的證據(jù)支持之一[19,20]。本研究建立HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型,發(fā)現(xiàn)木芙蓉葉不同極性部位中乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的抗氧化活性,木芙蓉葉乙酸乙酯部位在25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),明顯減少ROS(P<0.001)含量,緩解氧化應(yīng)激,對細(xì)胞氧化損傷模型具有良好的保護(hù)作用;進(jìn)一步探索木芙蓉葉乙酸乙酯部位的抗炎作用,構(gòu)建RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型,乙酸乙酯部位濃度為200 μg/mL時(shí),能明顯抑制RAW 264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2 mRNA的表達(dá)(P<0.001),具有良好的抗炎活性,進(jìn)一步闡明了木芙蓉葉抗氧化、抗炎活性部位,為后續(xù)藥效活性深入研究及化妝品應(yīng)用開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)適用于中藥多組分復(fù)雜體系的分析,具有高分辨率、高質(zhì)量精度、檢測效率高等特點(diǎn)[21]。本研究首次采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對木芙蓉葉乙酸乙酯有效部位中復(fù)雜組分進(jìn)行全面的定性分析,鑒定出28個(gè)化學(xué)成分,其中黃酮類成分10個(gè),主要為蘆丁、銀椴苷、異槲皮苷等;有機(jī)酸類成分9個(gè),主要為阿魏酸、咖啡酸、水楊酸等;還有香豆素類、酚類、核苷類成分,各2個(gè),以及3個(gè)其他類成分,與木芙蓉葉富含黃酮類及酚酸類成分相關(guān)報(bào)道一致[22]。黃酮類成分擁有能夠充當(dāng)供氫分子的酚氫,是很強(qiáng)的抗氧化劑,有良好的抗炎活性[23]。蘆丁在帕金森病(PD)模型中可以增加過氧化氫酶(CAT)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性[24];銀椴苷可以抑制前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生和NF-κB和MAPK信號通路的激活等[25];槲皮素能通過上調(diào)SOD、CAT等酶和谷胱甘肽(GSH)等非酶抗氧化防御系統(tǒng)來抑制ROS介導(dǎo)的肝癌發(fā)生[26];異槲皮苷可增加SOD和降低MDA水平,抑制MEK/ERK信號通路,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]。有機(jī)酸類成分中除壬二酸外都是酚酸類,大量研究表明[28],酚酸由于分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的多酚羥基具有極強(qiáng)還原性,是一類典型的具有清除自由基作用的化合物,例如,阿魏酸能夠提高小鼠血清的抗氧化能力,改善抗生素對小鼠腸道代謝和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面的影響[29];水楊酸可以誘導(dǎo)改善抗氧化酶活性,減輕活性氧生物氧化等[30]。本研究發(fā)現(xiàn)這兩類成分為木芙蓉葉乙酸乙酯部位的主要化學(xué)成分,進(jìn)一步揭示了木芙蓉葉抗氧化和抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以黃酮類成分和有機(jī)酸類成分為主。同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn)了木芙蓉葉中未報(bào)道的1個(gè)新的黃酮類成分為三葉豆苷,2個(gè)新的酚類成分為4-硝基苯酚和4-硝基兒茶酚,1個(gè)新的核苷類成分為腺嘌呤,2個(gè)新的醛類成分為2,5-二羥基苯甲醛和香草醛,豐富了木芙蓉葉的化學(xué)成分庫。

綜上所述,木芙蓉葉乙酸乙酯部位提取物可以極大地緩解細(xì)胞氧化損傷,抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制炎癥因子的表達(dá),黃酮類成分和有機(jī)酸類成分可能為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為后續(xù)木芙蓉葉抗氧化、抗炎作用機(jī)制的深入研究及天然產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。