基于代謝組學技術分析枸杞愈傷組織抗氧化活性成分差異

曾曉倩,周笑如,劉春環,劉 學,楊 成

江南大學化學與材料工程學院 合成與生物膠體教育部重點實驗室,無錫 214122

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.),茄科枸杞屬植物,是被載入2020年版《中華人民共和國藥典》(后文簡稱《中國藥典》)的中國傳統藥用植物[1],因其富含多酚、生物堿等活性物質,抑菌抗炎等效果良好[2],食用與藥用價值高,被我國食藥監局列入首批藥食同源目錄,在國內外保健品商品市場中備受青睞。由于溫度、濕度等氣象因子對枸杞品質的影響[3],寧夏、青海等省一直是枸杞主產區,但傳統農業生產生長周期長、人工調控難等問題仍突出,植物組織培養技術為這一難題提供了解決方案。

植物組織培養是一種在無菌及人工控制的條件下,使離體的植物器官、細胞等在適宜的培養基上再生細胞或成為完整植物的技術[4],愈傷組織就是離體的植物器官較易誘導出的一種呈無定形狀態的薄壁細胞。而根據植物細胞的全能性,枸杞愈傷組織與天然枸杞植株具有相同的遺傳信息,其化學成分與生物活性也將具有高度相似性。且與傳統農業種植相比,通過植物組織培養技術誘導枸杞愈傷組織的條件更可控,愈傷組織生長周期較人工種植的枸杞也更短,因此通過植物組織培養誘導枸杞愈傷組織拓寬了枸杞資源的獲取途徑,利于滿足枸杞市場與日增長的需求。代謝組學是研究生命體中分子質量在1 500 Da以內的代謝物種類、數量及其變化規律的科學,在黃芪、人參等[5]藥食兩用的天然植物的成分分析中應用廣泛,但目前對枸杞的成分分析仍局限于自然條件下生長的枸杞果實、花、葉等[6]。

本研究從枸杞種子出發建立了穩定的枸杞愈傷組織培養體系,比較不同植物生長調節劑組合誘導出的愈傷組織抗氧化活性并對其進行代謝組學檢測,分析愈傷組織物質組成與代謝途徑,探究枸杞愈傷組織抗氧化活性代謝物來源,為枸杞資源深入開發與多元化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

寧夏枸杞干燥果實,產自寧夏銀川,購于百瑞源枸杞股份有限公司。

Murashige and Skoog培養基(MS)(青島海博生物技術有限公司,批號:20220307,純度:BR);2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)(批號:B2222178,純度:≥97%)、1-萘乙酸(NAA)(批號:I2008068,純度:96%)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(批號:I1924138,純度:≥98%)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)(批號:I2104107,純度:≥99%)、激動素(KT)(批號:I2023136,純度:99%)(均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

OSE-Y50組織研磨器(北京天根生化科技有限公司);Triple TOF 6600質譜儀(美國愛博才思公司);1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(美國安捷倫公司);ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美國沃特世公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞無菌苗培育

將大小均一的枸杞果實在水中浸泡12 h后去除果肉,清洗種子3次后再浸泡12 h,2% NaClO溶液浸泡30 min,無菌水沖洗5次,濾紙吸干水分,接種于無菌MS固體培養基上培育無菌苗,溫度25±1 ℃,濕度50%,光照16 h,黑暗8 h,培養45 d。

1.2.2 愈傷組織培養體系建立

以枸杞無菌苗莖段為外植體,接種于添加了不同植物生長調節劑的MS培養基上,其中以0.25 mg/L NAA+0.125 mg/L 6-BA為植物生長調節劑組合誘導出的枸杞愈傷組織記為NB,以0.25 mg/L 2,4-D+0.125 mg/L KT為植物生長調節劑組合誘導出的枸杞愈傷組織記為DK。每皿4節莖段,每段0.5～1 cm,每一培養條件設5個平行。溫度25±1 ℃,濕度50%,黑暗培養,45 d后記錄出愈率、愈傷組織生長量與生長形態。取1 g枸杞愈傷組織,接種于繼代培養基上,每7 d稱重并繪制愈傷組織生長曲線,確定繼代周期。

1.2.3 愈傷組織與枸杞種子、果實、根皮提取

取冷凍干燥后的愈傷組織、枸杞種子、果實、根皮各2 mg于研磨器中,70%乙醇1 mL,10 000 r/min提取1 min,40 ℃超聲提取30 min,8 000 r/min離心15 min,取上清液待測。

1.2.4 抗氧化活性檢測

將40 μL愈傷組織上清液與160 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入96孔板中,振板1 min,避光反應30 min后,于517 nm測吸光度(A)。對照組為提取溶劑+DPPH溶液,空白組為愈傷組織上清液+Tris-HCl緩沖液。

1.2.5 代謝組學檢測

通過UHPLC-Q-TOF-MS對NB、DK愈傷組織提取物上清液檢測,分析其代謝物變化,每組6個重復。其中NB記為NB-1、NB-2、NB-3、NB-4、NB-5、NB-6,DK為DK-1、DK-2、DK-3、DK-3、DK-4、DK-5、DK-6。

色譜條件:1290 Infinity LC超高效液相色譜系統;ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量2 μL;流動相為25 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.5%甲酸)(A)、甲醇(B)。流動相洗脫程序為0～0.5 min,5% B;0.5～10 min,5%→100% B;10～12 min,100% B;12～12.1 min,100%→5% B;12.1～16 min,5% B。

質譜條件:電噴霧離子化(ESI)源條件為離子源溫度600 ℃,霧化氣輔助加熱氣60 psi,輔助加熱氣60 psi,氣簾氣30 psi,噴霧電壓±5 500 V(正負兩種模式);一級質荷比檢測范圍為60～1 000 Da,一級質譜掃描累積時間0.20 s,二級子離子質荷比檢測范圍為25～1 000 Da,二級質譜在峰強度值篩選模式采用數據依賴型采集模式IDA獲得,去簇電壓為±60 V(正、負兩種模式),碰撞能量為35±15 eV。

1.2.6 代謝組學數據處理與分析方法

原始數據經ProteoWizard軟件由Wiff格式轉換為mzXML格式,用MSDAIL軟件進行峰對齊、保留時間校正與提取峰面積操作。將MSDAIL提取得到的數據與中科新生命植物代謝組數據庫中代謝物的分子質量(誤差<10 ppm)、保留時間、二級碎裂譜圖等信息進行匹配,鑒定代謝物結構。利用主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析進行多元統計分析獲取差異代謝物并進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織培養體系建立

NB生長量與出愈率均高于DK且兩者的生長形態存在一定差異(見表1),這是由于培養基中添加的植物生長調節劑不同。作為啟動愈傷組織誘導的關鍵條件,植物細胞內細胞分裂素含量較生長素高時形成新芽,生長素含量較細胞分裂素含量高時促進生根[4],當生長素與細胞分裂素比例不當時會抑制愈傷組織生長甚至無法誘導出愈傷組織,只有生長素與細胞分裂素處于一定水平時有利于愈傷組織生長、分化并影響其次生代謝物質如黃酮類物質花青素[7]或咖啡酸、綠原酸等酚類物質[8]的生成。枸杞愈傷組織繼代培養情況如圖1所示,NB與DK繼代生長曲線呈“S”型,在繼代后的7 d內愈傷組織生長最慢,在7～21 d內進入指數生長期,愈傷組織生長量增速最快,培養基養分被大量消耗,加速愈傷組織中代謝物的合成,21～28 d,培養基趨于耗盡,愈傷組織質量增長減緩,因此以28 d作為枸杞愈傷組織的最佳繼代周期。

圖1 NB與DK枸杞愈傷組織繼代生長曲線Fig.1 Subculture growth curve of L.barbarum callus of NB and DK

表1 枸杞愈傷組織生長量、出愈率及生長形態

2.2 枸杞愈傷組織抗氧化活性檢測

抗氧化活性是枸杞具有的眾多生物活性之一,DPPH自由基清除法是一種常用的檢測天然產物抗氧化活性的方法,DPPH自由基清除率高低能在一定程度反映物質的抗氧化能力強弱。NB、DK以及枸杞植株不同部位提取物DPPH自由基清除率結果如圖2所示,NB在質量濃度為2 mg/mL時DPPH自由基清除率最高達74.8%,DK在相同質量濃度時的DPPH自由基清除率僅為38.6%,NB的DPPH自由基清除率是DK的1.9倍,說明NB更易積累抗氧化活性物質。在質量濃度2 mg/mL時,NB的DPPH自由基清除率較自然條件生長的枸杞種子、果實、根皮更高,可見枸杞愈傷組織抗氧化性能良好。

圖2 枸杞愈傷組織與植株不同部位提取物DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of L. barbarum callus and different part of L. barbarum extract注:與DK相比,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。Note:Compared with DK,*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001.

2.3 代謝組學分析

2.3.1 代謝物數量與分類

采用UHPLC-Q-TOF-MS檢測分析枸杞愈傷組織中代謝物。正、負離子模式合并后共鑒定出752種代謝物,其中正離子模式431種,負離子模式321種,常見種類代謝物統計結果見表2。愈傷組織中類脂的含量較高達17.6%,而自然生長的枸杞也富含亞麻酸等必需多不飽和脂肪酸[9]。枸杞中糖類含量豐富,其中含量最高的是葡萄糖,其次為果糖、蔗糖[10],甜菜堿與一類特定的多糖在《中國藥典》中被作為枸杞合格標準的生物標志物[1],而在枸杞愈傷組織中也檢測到甜菜堿與大量糖類物質。此外,枸杞根皮中主要活性成分地骨皮乙素[11]也存在于愈傷組織中,可見枸杞愈傷組織與天然枸杞植株代謝物組成具有較高的相似性。

表2 枸杞愈傷組織代謝物在各化學分類的數量及含量占比

2.3.2 主成分分析

主成分分析反映組間樣本的總體分布趨勢和組間樣本的差異度。正、負離子模式下,NB與DK主成分分析結果如圖3所示,NB與DK各自的6個生物學重復聚集在一起,說明組內樣品重復性良好,兩種類型的點分離,說明NB與DK樣品之間代謝物存在較明顯差異。經7次循環交互驗證,正、負離子模式下PCA模型解釋率R2X分別為0.694、0.871,兩者均接近1,表明模型穩定。

圖3 正(A)、負(B)離子模式下NB與DK的PCA圖Fig.3 PCA diagram of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

2.3.3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘判別分析通過濾除與分類信息無關的噪音,將組間差異最大化,提高模型解析能力與有效性。正、負離子模式下,NB與DK正交偏最小二乘判別分析結果如圖4所示,兩種類型的點組內聚集,組間分散,說明NB與DK具有明顯差異。經7次循環交互驗證,正、負離子下模型預測能力Q2分別為0.955、0.990,兩者均大于0.5,表明模型可靠。

圖4 正(A)、負(B)離子模式下NB與DK的OPLS-DA圖 Fig.4 OPLS-DA diagram of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

為避免過度擬合,保證模型的有效性,對模型進行200次響應的置換檢驗,正、負離子模式下,NB與DK正交偏最小二乘判別分析置換檢驗結果如圖5所示,隨著置換保留度逐漸降低,隨機模型的R2和Q2均下降,說明原模型未過度擬合,模型穩定。

圖5 正(A)、負(B)離子模式下NB與DK的OPLS-DA置換檢驗Fig.5 OPLS-DA permutation test of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

2.3.4 差異代謝物分析

以OPLS-DA模型獲得的變量權重值(VIP)衡量代謝物在模型解釋中貢獻情況,將VIP>1和P<0.05作為顯著性差異代謝物篩選標準并對篩選結果進行分析,正、負離子模式下,NB與DK差異代謝物統計結果見表3。

表3 正、負離子模式下NB與DK差異代謝物統計結果

正、負離子模式下,顯著性差異代謝物層次聚類熱圖如圖6所示,圖中右側編號對應的代謝物見表3,圖內顏色種類與深淺程度反映NB、DK代謝物富集情況差異,其中橙紅色代表代謝物富集,紅色越深富集程度越高,藍色相反。NB較DK共有55種差異代謝物,其中22種差異代謝物含量上調且差異倍數超1倍,上調代謝物中2種肉桂酸及其衍生物(阿魏酰O-甲基多巴胺、順式-咖啡酸),1種木質素苷(8-羥基松脂醇 4′-葡萄糖苷)等次生代謝物均有一定的抗氧化作用,(+/-)-格羅沙酰胺可以抑制脂多糖誘導的巨噬細胞中自由基與氧化損傷的產生[12],提升了NB的抗氧化能力,而NB較DK高11倍的乳糖、乳果糖,雖然都是初生代謝物,不直接參與次生代謝物合成,但通過糖酵解、三羧酸循環、磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑等初生代謝途徑也可以促進次生代謝物質生成,Zhong等[13]也發現碳水化合物的積累能夠促進次生代謝物穿心蓮內酯的生物合成。此外,NB中咖啡酸乙酯含量比DK高55倍(VIP>1,P=0.087),而咖啡酸乙酯抗氧化能力強[14],且具有高于原兒茶醛的α淀粉酶抑制活性,可減緩碳水化合物分解成單糖[15],降糖活性良好,是一種潛在的植物源活性物。

圖6 正(A)、負(B)離子模式下顯著性差異代謝物層次聚類熱圖Fig.6 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in positive (A) and negative (B) ion mode

KEGG分析結果如圖7所示,NB中顯著性差異代謝物蔗糖、D-氨基葡萄糖、谷氨酰胺、亮氨酸、環磷酸腺苷、膽堿等主要富集在氨基酸的生物合成、ABC轉運蛋白、甘油磷脂代謝、氨酰-tRNA生物合成等20條通路。氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小,氣泡越大代表影響因子越大,氣泡顏色反映富集分析的P值大小,顏色越深,P值越小,富集程度越顯著。由此可見,ABC轉運蛋白、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成通路富集程度最為顯著,對愈傷組織物質合成影響最大。其中,ABC轉運蛋白是植物中最大的轉運蛋白家族之一,位于植物液泡、線粒體和葉綠體膜上,由ATP直接供能[16],參與調節植物體內生長、發育以及對營養物質的攝取、對生物和非生物脅迫的耐受性、植物激素、初生與次生代謝物質的運輸等多種生物學過程[17]。顯著性差異代謝物谷氨酰胺、亮氨酸、蔗糖、谷氨酰胺、膽堿富集于ABC轉運蛋白通路上,谷氨酰胺、亮氨酸、色氨酸富集于氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成通路上。

圖7 KEGG富集通路圖Fig.7 KEGG enrichment pathway diagram

谷氨酰胺作為無機氮源氮同化的主要產物,也是植物氮代謝的核心代謝產物[18],由葡萄糖經多個初生代謝途徑合成,是生物體內含量豐富的氨基酸,NB高蔗糖水平或是導致其谷氨酰胺的水平較DK更高的原因。谷氨酰胺與植物體內的氮調節密切相關,不同形態的氮促進藥用植物不同種類代謝物的生物合成,但具體作用機制仍有待研究。由于調節氮代謝可減少碳水化合物的消耗,對植物生長與代謝物合成積累具有協同作用[13],枸杞愈傷組織中的谷氨酰胺可能對地骨皮乙素這一重要含氮代謝物的生物合成具有重要調控作用。Sun等[19]發現亮氨酸可以通過改善氧化損傷從而增強抗氧化活性。此外,色氨酸在高等植物中廣泛存在,作為前體物質可合成內源生長素吲哚乙酸來間接調控代謝物合成,Kahveci等[20]發現外源色氨酸促進酚類物質的合成。

上述三條代謝通路中富集的代謝物多為初生代謝物,初生代謝物在ABC轉運蛋白、氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成代謝通路上的顯著富集反映出NB活躍的初生代謝物物質合成、運輸水平,它們可以直接參與植物生命活動過程,為其提供能量,也可進一步生成次生代謝物所需的原料與前體,間接調控具有良好生物活性的酚類、生物堿等代謝物的生成,從而對愈傷組織的抗氧化活性產生影響。雖然植物細胞內物質轉運是一個動態且復雜過程,其具體的作用機制仍未明確,但已有研究表明,ABC轉運蛋白不僅在植物營養和生殖發育中發揮作用,還可以參與調控次生代謝物花青素的積累[21],因為ABC轉運蛋白介導的細胞內轉運是花青素積累的重要限速步驟,轉運蛋白的向內和向外交替的構象結構被認為可以調節底物結合或釋放[22]。因此,初步推斷ABC轉運蛋白功能差異可能是導致不同植物生長調節劑組合誘導出的枸杞愈傷組織抗氧化活性差異顯著的主要原因。

3 討論與結論

從枸杞種子培育無菌苗獲取莖段作為誘導愈傷組織的外植體,建立了穩定的枸杞愈傷組織培養體系,并得到高抗氧化活性枸杞愈傷組織NB。通過非靶向代謝組學分析了枸杞愈傷組織的物質成分及其代謝通路差異,發現枸杞愈傷組織共有752種化合物,與天然植株在活性成分上也具有相似性且抗氧化活性較天然植株更佳。與DK相比,NB中55種代謝物存在顯著差異,其中22種代謝物含量上調,包括抗氧化活性良好的甜菜堿[23]等次生代謝物。此外,NB的乳糖、乳果糖較DK高11倍,這些糖類作為初生代謝物,可以利用糖苷酶水解作用轉化為單糖,通過糖異生途徑生成重要抗氧化劑谷胱甘肽的前體物質谷氨酰胺等[24],間接地促進枸杞愈傷組織次生代謝產物的生成及抗氧化能力的增強。KEGG結果表明,顯著差異代謝物富集于20條代謝通路中,主要通過ABC轉運蛋白、甘油磷脂代謝、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成通路直接或間接調控枸杞愈傷組織生長及代謝物合成。

在已檢測出的55種差異代謝物中,甜菜堿與有機酸研究廣泛,而表小檗堿等次生代謝物鮮見研究,且表小檗堿具有良好的減少脂質積累[25]的作用,對人體健康極具益處。目前,通過控制外源條件對愈傷組織代謝物進行定向誘導,可以富集特定代謝物并利用分離純化手段獲取安全可靠的植物源天然活性物。Khanam等[26]通過添加化學結構不同的植物生長調節劑提高了薄荷油的產量,可見植物次生代謝產物調控具有可行性,植物組織培養有望成為枸杞資源的重要獲取途徑,為枸杞資源的開發尤其是次生代謝產物的工業化生產提供借鑒。