僵蠶藥材蛋白質分級指紋圖譜建立及產地鑒定相關分子研究

宋美營,王立勇,王巧宇,張林松,徐衛東,湯 建,聞崇煒*

1江蘇大學藥學院,鎮江 212013;2鎮江市食品藥品監督檢驗中心,鎮江 212050;3亳州學院中藥學院,亳州 236800

僵蠶(Bombyx Batryticatus)為家蠶幼蟲在養殖中感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant致死而形成的副產物,具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結的功效[1]。由于我國“東桑西移”產業布局的實施,四川與云南成為我國蠶桑產業大省,也因而成為僵蠶藥材的主要產區。由于四川產僵蠶比云南產的性狀特征更符合歷代本草典籍及63、77年版藥典所述“身直肥壯、質堅色白、斷面光亮”的優質僵蠶標準,因此市場認可度更高,銷售價格也更高[2-4]。市場調查中發現常有商家在銷售中故意混淆兩者產地以牟利,為提高臨床用藥的安全性及有效性,有必要對僵蠶產地鑒定方法開展研究。

眾所周知,中藥材有效成分的形成和積累與其生長的自然條件有著密切關系,因此產地是影響中藥材質量的重要因素之一,建立產地鑒定與溯源方法對滿足消費者了解產品信息的需求、保護生產、加工、銷售企業的權益、提升我國藥材在國際市場上的競爭力具有重要作用。廖保生等提出可以基于分子生物學技術、中藥指紋圖譜技術、同位素示蹤技術、無線射頻識別溯源技術及條形碼技術進行中藥材的產地鑒定及溯源[5]。蛋白質電泳為國際種子檢驗協會采納的標準品種鑒定方法,但該法尚有分辨率不高、難以進行種內鑒定的缺點,難以用于中藥材的產地鑒定與溯源。有鑒于此,本文擬探索將分級沉淀及蛋白質電泳技術相結合建立分級指紋圖譜技術的可行性,以此分析云南及四川僵蠶的蛋白質組差異,并對所得差異分子進行鑒定及生物信息學分析,挖掘產地鑒定相關分子,為建立簡便易行、科學準確的產地鑒定方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥材

僵蠶藥材購自荷花池、亳州、安國及玉林中藥材市場,四川產僵蠶(以下均簡稱為川產)批號分別為:150510、160106、20160420、20150703;云南產僵蠶(以下均簡稱為滇產)批號分別為:130101、160512、201512082,經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體。

1.2 試劑

丙烯酰胺(批號:20161017,化學純)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(20111012,含量≥98.0%)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)(含量≥99.0%)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)(批號:2021082,含量≥99.0%)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(含量≥99.0%)、甘氨酸(Glycine)(批號:C1488777,含量99.0%)、牛血清白蛋白(BSA)等均購自生工生物工程(上海)有限公司。冰醋酸(批號:2016041301)、無水乙醇(批號:2211199)、過硫酸銨(批號:20181018)、三氯醋酸(TCA)(批號:C14297217)、丙酮(批號:20200107)、甘油(批號:T20090224)、EDTA(批號:20140324)純度均為分析純,考馬斯亮藍G-250(批號:71011284,有效分光含量≥85.0%)等購自國藥集團化學試劑有限公司。蛋白質分子量標準購自Fermentas公司。

1.3 儀器

FE20型實驗室pH計(Mettler Toledo公司);SpectraMax 190酶標儀(Molecular Devices公司);VE-180垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)、DYY-6C穩流穩壓電泳儀(南京馳順科技發展有限公司);GenoSens 2100 凝膠成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司);島津UV-2550紫外分光光度計(Shimadzu公司)、nanoLC-Ultra 1D plus高效液相色譜系統(美國Eksigent Technologies公司);配備Nanospray Flex離子源的TripleTOF 5600 系統(美國AB Sciex公司)。

1.4 方法

1.4.1 僵蠶蛋白質提取及定量

僵蠶藥材水洗后置于40 ℃下烘干,粉碎后過70目篩備用。準確稱取多份僵蠶藥材粉末,分別按液料比60∶1(mL/g)加入0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH 4.8)、60∶1(mL/g)加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、50∶1(mL/g)加入ddH2O、25∶1(mL/g)加入40%EtOH,25 ℃震蕩提取8 h,13 000 r/min離心10 min后取上清液,即得僵蠶酸溶、堿溶、水溶、醇溶性總蛋白質。以BSA為標準品,Bradford法測定樣品中蛋白質含量并計算提取率,樣品置于-80 ℃保存備用。

1.4.2 紫外檢測

紫外可見分光光度計在240～500 nm波長范圍內對僵蠶蛋白質樣品進行全波長掃描,得紫外檢測圖譜。

1.4.3 丙酮分級沉淀

取適量酸溶性蛋白質樣品,滴加丙酮至終濃度為10%(V/V),靜置20 min,13 000 r/min離心10 min后取沉淀,得酸溶性蛋白質10%沉淀部分,上清繼續滴加丙酮至終濃度為20%(V/V),13 000 r/min離心10 min后取沉淀,得20%沉淀部分,上清同上處理,繼續增加丙酮終濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%(V/V),收集各部分沉淀,依次可得30%、40%、50%、60%、70%、80% 分級沉淀部分。同法處理堿溶、水溶、醇溶性蛋白質樣品,可得各對應分級沉淀樣品。

1.4.4 蛋白質電泳(SDS-PAGE)

取上述各分級沉淀樣品,加適量ddH2O及等體積2×上樣緩沖液,煮沸10 min后進行SDS-PAGE[6]。80 V恒壓電泳至溴酚藍指示劑距膠板底部邊緣時結束電泳。結束后按常規方法進行剝膠、固定及染色,隨后脫色至背景無色,電泳條帶清晰。

1.4.5 圖像分析及數據處理

采用GenoSens2100型凝膠成像系統采集凝膠圖像,泳道對比以發現差異蛋白質分子,Quantity One 4.6.2軟件進行圖像分析,根據條帶遷移率計算蛋白質分子量,根據條帶灰度值計算蛋白質含量。

1.4.6 液質聯用分析

凝膠中差異蛋白質樣品常規膠內酶解后進行分析。液相條件:nanoLC-Ultra 1D plus系統,Eksigent C18色譜柱(75 μm × 150 mm,3 μm)分離;流動相: 0.1% 甲酸水溶液(A)-含0.1% 甲酸的乙腈溶液(B);梯度洗脫(0～55 min ,5% →23% B;55～75 min,23%→52%B;75～76 min,52%→80%B;76～80 min,80%B;80～90 min,0%→5%B);流速:300 nL/min;檢測波長:275 nm;柱溫:50 ℃;進樣量:7 μL。質譜條件:TripleTOF 5600系統,配備Nanospray Flex離子源,正離子模式進行掃描。質量范圍m/z:350～1 500;S-Lens RF(射頻電壓)50 V,噴霧電壓2 000 V,氣簾氣壓力2 × 106Pa,霧化氣壓力3.4 × 105Pa,加熱溫度150 ℃,質譜掃描方式為IDA模式。一級TOF-MS單張圖譜的掃描時間為250 ms,每次IDA循環下,最多采集40張電荷為+2～+5且單秒計數大于120的二級質譜,每張二級質譜的累積時間為50 ms。

1.4.7 數據庫檢索

質譜數據通過ProteinPilot (V4.5)檢索,檢索算法為Paragon。使用數據庫為UniProt中Beauveria_bassiana和Bombyx_mori的蛋白質組參考數據庫。檢索參數如下:Sample Type選Identification;Cys Alkylation選Iodoacetamide;Digestion選Trypsin;Search Effort設置為Rapid ID。檢索結果以Unused≥1.3為標準進行篩選,刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白,余下鑒定信息用作后續分析。

1.4.8 生物信息學分析

采用eggNOG5.0(http://eggnog5.embl.de/)對檢索得到的差異表達蛋白質分子進行基因同源性分類(Gene ontology,GO)功能注釋分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)代謝通路分析以及蛋白相鄰類聚簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins,COG)功能分析。相關蛋白質詳細信息通過Python實現數據可視化。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜檢測

按“1.4.2”所述對僵蠶蛋白質樣品在240～500 nm波長范圍內進行全波長掃描,結果顯示,滇產僵蠶的最大吸收波長是277 nm,川產僵蠶的最大吸收波長是279 nm(見圖1),因此后續液質聯用分析中以275 nm為檢測波長。

圖1 紫外光譜掃描圖 Fig.1 Ultraviolet spectrum scan注:A:滇產僵蠶;B:川產僵蠶。Note:A:Bombyx Batryticatus from Yunnan;B:Bombyx Batryticatus from Sichuan.

2.2 酸溶性蛋白質分級指紋圖譜及差異分子研究

以0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH 4.8)提取兩地僵蠶藥材的酸溶性總蛋白質,并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明兩者相似度極高,難以據此進行產地鑒定(圖2第1、2泳道)。對酸溶性總蛋白質進行分級處理,再對所得分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明10%～30%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在27 kDa以上的蛋白質,40%～60%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在5～36 kDa的蛋白質,70%～80%的丙酮溶液可以沉淀出分子量小于15 kDa的蛋白質(圖2第3～18泳道)。滇產及川產僵蠶的酸溶蛋白質均有分子量為30.6 kDa 的蛋白質(圖2中箭頭A所示),同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在4.95、27.11、29.40、30.42、36.91、38.93 kDa的差異蛋白質條帶(圖2箭頭B、C、D、E、F、G所示)。

圖2 滇產及川產僵蠶酸溶性總蛋白質指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.2 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of acid soluble proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan注:1、2:總蛋白質;3、5、7、9、11、13、15、17:滇產各分級處理樣品;4、6、8、10、12、14、16、18:川產各分級處理樣品;M:蛋白質分子量標準。下同。Note:1,2:Total protein;3,5,7,9,11,13,15,17:Sample treated in each grade from Yunnan;4,6,8,10,12,14,16,18:Sample treated in each grade from Sichuan;M:Protein marker.The same below.

2.3 堿溶性蛋白質分級指紋圖譜及差異分子研究

以0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.6)緩沖液提取兩地僵蠶藥材的堿溶性總蛋白質,并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明兩者相似度極高,條帶覆蓋嚴重,難以據此進行產地鑒定(圖3第1、2泳道)。對堿溶性總蛋白質進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明10%～30%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在30 kDa以上的蛋白質,40%～60%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在6～40 kDa的蛋白質,70%～80%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在15 kDa以下的蛋白質(圖3第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在36.96 kDa高豐度差異蛋白質條帶(圖3箭頭H所示)。

圖3 滇產及川產僵蠶堿溶性總蛋白質指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.3 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of alkaline-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.4 水溶性蛋白質分級指紋圖譜及差異分子研究

以ddH2O提取兩地僵蠶藥材的水溶性總蛋白質,并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明兩者相似度極高,難以據此進行產地鑒定(圖4第1、2泳道)。對水溶性總蛋白質進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE分級指紋圖譜分析,結果表明,10%～30%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在25 kDa以上的蛋白質,40%～60%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在6～35 kDa的蛋白質,70%～80%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在15 kDa以下的蛋白質(圖4第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在6.84、17.62、51.32 kDa差異蛋白質條帶(圖4箭頭I、J、K所示)。

圖4 滇產及川產僵蠶水溶性總蛋白質指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.4 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of water-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.5 醇溶性蛋白質分級指紋圖譜及差異分子研究

以40%EtOH溶液提取兩地僵蠶藥材的醇溶性總蛋白質,并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明兩者相似度極高,難以據此進行產地鑒定(圖5第1、2泳道)。對醇溶性總蛋白質進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結果表明,10%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在30 kDa附近的蛋白質,20%～50%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在6～36 kDa的蛋白質,60%～80%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在20 kDa以下的蛋白質(圖5第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在6.51、29.19、30.06、31.45、36.57、36.72 kDa差異蛋白質條帶(圖5箭頭L、M、N、O、P、Q所示)。

圖5 滇產及川產僵蠶醇溶性總蛋白質指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.5 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of ethanol-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.6 LC-MS/MS分析

切取包含差異蛋白質條帶的凝膠,膠內酶解后進行LC-MS/MS分析,得總離子流圖(見圖6),共計得到7 593個譜圖,2 238個肽段,ProteinPilot數據庫檢索及匹配分析共得到273個差異蛋白質分子,其中主要差異蛋白質見表1。

表1 滇產及川產僵蠶主要差異蛋白質

圖6 僵蠶總離子流圖Fig.6 Total ion chromatograms of Bombyx Batryticatus注:A:滇產僵蠶;B:川產僵蠶。Note:A:Bombyx Batryticatus from Yunnan;B:Bombyx Batryticatus from Sichuan.

2.7 生物信息學分析

對差異蛋白質分析進行GO概念注釋分析(見圖7),結果表明主要涉及細胞過程(20.87%)、代謝過程(19.59%)、應答刺激(9.92%)、生物學調控(9.92%)、發育過程(6.62%)等生物過程;其中52.04%位于胞內細胞器,16.33%位于細胞外表面,9.18%位于外囊狀結構,6.12%位于包膜;主要涉及催化活性(57.86%)、結合活性(28.57%)、抗氧化活性(5.71%)、分子功能調節活性(5.00%)、結構分子活性(2.86%);特別是過氧化氫酶(30.77%)、硫氧還蛋白過氧化物酶(15.38%)、維生素B6結合(15.38%)、幾丁質類角質層(7.69%)、幾丁質結合(7.69%)等活性。

圖7 差異蛋白質分子GO功能注釋結果Fig.7 GO function annotation results of different protein molecules注:A:生物過程分析;B:細胞組成分析;C:分子功能分析。Note:A:Biological process;B:Cellular process;C:Molecular function.

KEGG通路富集分析發現69、38、30、28個差異蛋白質分子分別與代謝性途徑、次生代謝產物合成、不同環境下微生物代謝、抗生素生物合成相關。COG分析表明其中25.78%為碳水化合物運輸及代謝相關,23.83%與翻譯后修飾/蛋白質周轉/伴侶蛋白相關,9.77%與氨基酸運輸及代謝相關,5.08%與防御機制相關,14.84%為功能未知的新蛋白(見圖8)。

圖8 差異蛋白質分子KEGG及COG分析結果Fig.8 Analysis results of KEGG and COG注:A:KEGG分析;B:COG分析。Note:A:KEGG analysis;B:COG analysis results.

研究表明僵蠶形成過程中,白僵菌首先通過分生孢子膨大發芽以直接穿透表皮而感染家蠶,在入侵家蠶體壁和血腔之初分泌大量的胞外蛋白酶,家蠶因而發生相應的防御反應,通過表達高水平的蛋白酶抑制劑以響應白僵菌入侵[7-9]。本文結果表明滇產與川產僵蠶的抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶等因子的表達水平均存在顯著差異,有望用作產地鑒定的分子依據。此外,酪氨酸降解途徑為動植物體內非常重要的代謝途徑,其中斷會引起嚴重的代謝紊亂,延胡索酰乙酰乙酸水解酶為該途徑的末端限速酶[10]。本文結果也表明該酶也有望用作產地鑒定的分子依據。

3 討論與結論

本文提取了滇產與川產僵蠶的酸溶、堿溶、水溶、醇溶性蛋白質,并分別進行總蛋白質及分級指紋圖譜研究,結果表明兩種僵蠶的總蛋白質指紋圖譜相似度很高,難以據此進行產地鑒定;兩種僵蠶的分級指紋圖譜則有顯著差異,有望用于產地鑒定;分級指紋圖譜提供信息的豐富程度依次為醇溶性蛋白質>酸溶性蛋白質>水溶性蛋白質>堿溶性蛋白質。依據分級指紋圖譜差異共發現β-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶結構域蛋白等273種特征蛋白質分子,這些分子具有轉移酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白過氧化物酶等活性,參與多種細胞過程、代謝過程、應答刺激、生物學調控及發育過程,涉及次生代謝產物合成、不同環境下微生物代謝、抗生素生物合成、生物防御機制等途徑,體現了不同生境因子對家蠶-白僵菌互作及僵蠶形成具有重要影響,具有用于僵蠶產地鑒定的潛在價值。

道地藥材是中藥學中控制藥材質量的一項獨具特色的綜合判別標準,深刻反映了中藥材質量與其產地密切相關[11,12]。建立科學的產地鑒定方法可以為中藥材市場監管提供重要的技術支撐。楊健、張洪坤、宋君等分別依據穩定同位素、礦物元素指紋及DNA條形碼進行了鐵皮石斛、知母、黑木耳的產地鑒定研究[13-15]。分子生藥學研究表明,產地對中藥材質量的影響是由于溫度、濕度、光照等生境因子的改變并對相關基因的表達發生影響來實現的。蛋白質為基因表達的產物,生境因子的改變也必然影響其表達種類與表達豐度,因而其在產地鑒定中的應用前景值得關注。本文結果表明,云南與四川的不同生境因子對兩地所產僵蠶的蛋白質表達有顯著影響,利用分級指紋圖譜可以檢出相應差異。與SDS-PAGE及二維凝膠電泳技術相比,分級指紋圖譜技術首先將樣品用丙酮處理,使其按疏水性強弱進行分級,再將相似樣品放在同一張凝膠對比,具有操作簡便、分辨率較高、結果準確、重現性高的優點,為其他中藥材的產地鑒定研究提供參考。此外,僵蠶醇溶性蛋白質中沒有顯著高豐度分子,構建分級指紋圖譜時可以避免條帶之間的相互干擾及覆蓋,可以提供比其他種類蛋白質更為豐富的指紋圖譜信息及更好的分辨率,上述結果也為其他中藥材產地鑒定相關分子的選擇提供思路。