荊芥揮發(fā)油對脂多糖致抑郁樣模型小鼠的抗抑郁作用研究

秦甜甜,胡靖文,曾九僧,劉 蓉,曾 南

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

抑郁癥是一種嚴(yán)重的心理障礙,其特征是持續(xù)性心境低落、興趣減退、思維遲緩、悲觀、睡眠障礙、容易疲勞等[1,2]。神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一,而NLRP3炎癥小體通路激活是神經(jīng)炎癥進(jìn)展的關(guān)鍵[3]。NLRP3炎癥小體是由含NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)及胱天蛋白酶-1(Caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合物[4]。其被活化后,NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)水平顯著提高,能促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎癥因子產(chǎn)生,誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)[5]。荊芥揮發(fā)油作為唇形科植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,研究證實(shí)其抗炎作用良好,作用機(jī)制與抑制NLRP3小體的激活有關(guān)[6]。實(shí)驗(yàn)室前期開展了荊芥揮發(fā)油抗抑郁作用研究,發(fā)現(xiàn)其對LPS所致抑郁樣模型小鼠的血清IL-1β及NO水平有降低作用,并下調(diào)海馬部位IL-1β、pro IL-1β蛋白表達(dá),縮短小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾試驗(yàn)中不動時(shí)間及新奇攝食實(shí)驗(yàn)中的攝食潛伏期[7]。本研究同樣以LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣模型為載體,進(jìn)一步觀察荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用,并從NLRP3炎癥小體激活、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及神經(jīng)損傷角度探究其作用機(jī)制,以豐富荊芥揮發(fā)油抗抑郁作用的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 藥物

荊芥穗,購自太極大藥房,批號20210101,經(jīng)本校鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求。

鹽酸氟西汀(fluoxetine,FLX)膠囊購自Patheon France公司,20 mg/粒,批號9833A;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自Sigma公司,批號028M4094V;荊芥揮發(fā)油(essential oil fromSchizonepetatenuifoliaBriq.,EOST)的提取及成分鑒定方法參照文獻(xiàn)[7]。荊芥揮發(fā)油經(jīng)GC-MS檢測,其主要成分有胡薄荷酮、異薄荷酮、薄荷酮及胡椒酮等,相對含量分別為36.76%、14.39%、14.39%、2.73%。

1.2 動物

SPF級雄性ICR小鼠,5周齡,體質(zhì)量18～20 g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,合格證號SCXK(京)2019-0010。所有動物飼養(yǎng)于24 h明暗周期的環(huán)境中,晝夜各半,溫度維持在(25±1)℃,相對濕度40%～60%。本實(shí)驗(yàn)符合動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求,獲成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號20200320)。

1.3 試劑

小鼠白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(批號:UX04Z6PP4008、UX034VLH2757,武漢伊萊瑞特有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:P0010,碧云天試劑公司);NLRP3兔單克隆抗體(批號:T55655ES,Abmart公司);ASC、Caspase-1、Iba-1兔單克隆抗體(批號:DF6304、AF4022、DF6442,Affinity公司);GAPDH兔單克隆抗體(批號:GB11002,Servicebio公司);Ultra Signal超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物(批號:4AW011-100,北京四正柏生物科技有限公司);二甲苯與中性樹膠(批號:10023418、10004160,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);尼氏染液(貨號G1032,塞維爾有限公司)。

1.4 儀器

BS323S型電子天平(Sartorius公司);1500型全波長多功能讀數(shù)儀(Thermo Fisher Scientific公司);ST16R型冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司);DYY-6C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠);ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司);Revos型脫水機(jī)(Thermo scientific公司);JB-P5型包埋機(jī)、JB-L5型凍臺(武漢俊杰電子有限公司);RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);KD-P型組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);GFL-230型烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司);Nikon Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡及Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.5 LPS致抑郁樣小鼠模型的建立、分組與給藥

將SPF級ICR雄性小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組(control,Con)、模型組(model,Mod)、FLX組(fluoxetine,FLX,10 mg/kg),EOST高劑量組(high-dose EOST,EOST-H, 1/5 LD50,100 mg/kg),荊芥揮發(fā)油低劑量組(low-dose EOST,EOST-L,1/10 LD50,50 mg/kg),每組10只小鼠,分組后1 d開始灌胃給藥,空白組給予等體積溶劑,每日1次。給藥第12～14 d,在給藥后1 h模型組和各給藥組小鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg)造模,空白組腹腔注射等量生理鹽水,連續(xù)注射3 d,每日1次。給藥第15 d(第3次腹腔注射LPS 24 h后),給藥1 h后,進(jìn)行小鼠行為學(xué)測試。

1.6 小鼠行為學(xué)測試

1.6.1 糖水偏好試驗(yàn)

測試之前進(jìn)行糖水訓(xùn)練:各組小鼠給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用,適應(yīng)12 h后,所有小鼠單籠飼養(yǎng),禁食禁水24 h。測試時(shí)每只小鼠都放置1瓶白水與1瓶1%蔗糖水,記錄水瓶原始重量。測試3 h后,再次稱量水瓶重量,2次水瓶重量差值即為小鼠白水或蔗糖水的消耗量,計(jì)算小鼠糖水偏好率:糖水偏好率=蔗糖水消耗量/(白水消耗量+蔗糖水消耗量)×100%。

1.6.2 飛濺試驗(yàn)

將10%的蔗糖水連續(xù)3次噴于小鼠背部靠近尾端處。隨后將小鼠放入原本居住的飼養(yǎng)籠中,記錄5 min內(nèi)小鼠梳洗背部的時(shí)間(該時(shí)間記為梳洗時(shí)間)。

1.7 小鼠血清炎癥因子水平檢測

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后12 h,小鼠摘眼球取血,室溫靜置凝血。3 500 r/min離心10 min,分離血清,ELISA法檢測小鼠血清中IL-18和TNF-α的水平。

1.8 小鼠海馬 CA3區(qū)尼氏小體染色

0.01 mol/L PBS經(jīng)左心室快速灌注后取小鼠全腦。4%多聚甲醛固定24 h后以3 μm的厚度均勻切片,烘干,經(jīng)過逐步脫水,石蠟包埋,脫蠟后尼氏染色液染色,0.1%冰醋酸分化,水洗后烘干,二甲苯透明,中性樹膠封片。拍照觀察,IDO法檢測海馬CA3區(qū)尼氏小體平均光密度值。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測海馬組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取海馬組織20 mg,使用RIPA裂解液裂解獲得上清液,釆用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量,調(diào)至等濃度后上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉1.5 h后分別加入NLRP3、ASC、Caspase-1、Iba-1(1∶1 000)兔抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜后,孵育二抗山羊抗兔(1∶5 000)1.5 h,洗膜后在凝膠成像系統(tǒng)中成像,Image Lab凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布,多組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),2組間比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)者則采用非參數(shù)檢驗(yàn)法分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠行為學(xué)的影響

與空白組比較,模型組小鼠糖水偏好率和梳洗時(shí)間顯著減少(P< 0.05),表明動物快感缺失,并呈現(xiàn)出行為淡漠狀態(tài),提示造模成功。與模型組相比,荊芥揮發(fā)油高、低劑量組的糖水偏好率顯著性升高(P< 0.05,P< 0.01),表明荊芥揮發(fā)油能改善模型小鼠的快感缺失。荊芥揮發(fā)油低劑量組可使小鼠梳洗時(shí)間顯著延長(P< 0.05),高劑量有延長趨勢(P> 0.05),改善模型小鼠的淡漠狀態(tài)(見表1)。

表1 荊芥揮發(fā)油對LPS致抑郁模型小鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響～10)

2.2 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

與空白組比較,模型組小鼠血清IL-18、TNF-α水平明顯升高(P<0.05,P<0.001),提示LPS造模導(dǎo)致小鼠外周發(fā)生炎癥反應(yīng);與模型組比較,荊芥揮發(fā)油高、低劑量均顯著減少小鼠血清IL-18含量(P<0.01),對TNF-α水平有降低趨勢(P>0.05)。結(jié)果表明,荊芥揮發(fā)油能夠降低LPS致抑郁樣小鼠外周炎癥水平(見表2)。

表2 荊芥揮發(fā)油對LPS致抑郁樣模型小鼠血清IL-18和TNF-α水平的影響(ˉ～8)

2.3 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠海馬CA3區(qū)尼氏小體數(shù)的影響

海馬CA3區(qū)尼氏染色顯示,空白組小鼠海馬神

經(jīng)元尼氏體豐富(黑箭頭),著色明顯,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。與空白組比較,模型組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞間間隙增寬,胞漿尼氏體數(shù)量減少,神經(jīng)元細(xì)胞皺縮(黃箭頭),表明模型組小鼠海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元明顯損傷。與模型組比較,荊芥揮發(fā)油高、低劑量組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,染色更清晰,排列更整齊,胞漿尼氏體數(shù)目明顯增加。表明各給藥組均對小鼠海馬神經(jīng)元損傷具有一定保護(hù)作用(見圖1)。

圖1 荊芥揮發(fā)油對LPS致抑郁樣模型小海馬CA3區(qū)尼氏小體的影響(×400,ˉ x ± s , n = 4)Fig.1 Effect of EOST onthe dyeing of Nissl’s body on hippocampus CA3 area in LPS-induced depression mice (×400,ˉ x ± s ,n = 4)注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。Note: Compared with Con,##P<0.01; Compared with Mod,**P<0.01.

2.4 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1和Iba-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比,模型組NLRP3、Caspase-1、ASC及Iba-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01),提示LPS造模導(dǎo)致小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。與模型組比較,荊芥揮發(fā)油高、低劑量均可降低模型小鼠海馬組織中上述蛋白的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01,P<0.001),提示其能抑制NLRP3炎癥小體和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活(見圖2)。

圖2 各組小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果及電泳圖譜(ˉ x ± s ,n =4)Fig.2 Electrophoresis profiles and expression results of NLRP3 inflammasome related proteins in hippocampus in each group mice(ˉ x ± s ,n =4) 注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note: Compared with Con,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001; Compared with Mod,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 討論與結(jié)論

LPS作為一種免疫刺激劑,可以啟動機(jī)體固有免疫反應(yīng),引起多種炎性細(xì)胞因子分泌,并進(jìn)一步誘發(fā)中樞神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng),從而誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為,如快感缺失等表現(xiàn)[8,9],目前該模型在抗抑郁藥物的篩選研究中應(yīng)用較多,尤其是干預(yù)神經(jīng)炎癥的藥物。蔗糖偏好測試是觀察動物快感缺乏行為的一個(gè)重要環(huán)節(jié),糖水消耗減少,被認(rèn)為是快感缺乏的跡象,用于評價(jià)抑郁程度[10,11]。飛濺測試則主要觀察動物是否出現(xiàn)行為淡漠狀態(tài)。本研究采用LPS誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠模型,通過糖水試驗(yàn)、飛濺試驗(yàn)評價(jià)了荊芥揮發(fā)油的抗抑郁作用。結(jié)果表明,LPS造模后,相較于空白組小鼠,模型組小鼠糖水偏好率明顯降低,梳洗時(shí)間明顯縮短,提示模型構(gòu)建成功。與模型組比較,荊芥揮發(fā)油組糖水偏好率顯著提高,飛濺測試中的梳洗時(shí)間亦有延長表現(xiàn),表明荊芥揮發(fā)油能改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為,具有抗抑郁作用。

近年來,神經(jīng)炎癥作為抑郁癥的病理機(jī)制受到廣泛關(guān)注,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥標(biāo)記物[12]。研究表明,LPS可以誘導(dǎo)大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化,促進(jìn)Iba-1(小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)的表達(dá),誘導(dǎo)抑郁狀態(tài),并伴有炎癥因子表達(dá)的增加[13,14]。本實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),模型組小鼠海馬區(qū)域Iba-1蛋白表達(dá)上調(diào),且血清中IL-18、TNF-α水平升高,提示小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,外周及中樞均呈現(xiàn)炎性反應(yīng),而荊芥揮發(fā)油能抑制上述指標(biāo)的上調(diào),提示荊芥揮發(fā)油能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,減輕炎性反應(yīng),從而發(fā)揮抗抑郁作用。尼氏染色結(jié)果顯示模型組小鼠海馬CA3區(qū)胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體減少,荊芥揮發(fā)油干預(yù)后,CA3區(qū)尼氏小體數(shù)量增加,核固縮、溶解、碎裂現(xiàn)象減少。結(jié)果表明荊芥揮發(fā)油可減輕LPS引起的海馬神經(jīng)元損傷。

NLRP3炎癥小體在抑郁癥的神經(jīng)炎癥病理機(jī)制學(xué)說中具有關(guān)鍵作用[12],研究表明,NLRP3炎癥小體與急性給予脂多糖(LPS)引起的抑郁癥相關(guān)行為有關(guān)[15]。一般而言,NLRP3在激活后與ASC結(jié)合,然后與Caspase-1結(jié)合。活性Caspase-1迅速將IL-1β前體和IL-18前體裂解為成熟的IL-1β和IL-18。隨后,IL-1β和IL-18在細(xì)胞外釋放,引起炎癥[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS致抑郁樣模型小鼠海馬部位NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào),提示該模型小鼠海馬部位NLRP3炎癥小體激活;與模型組比較,荊芥揮發(fā)油治療后上述蛋白的表達(dá)量均下調(diào),表明藥物能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上,本研究進(jìn)一步證實(shí)了荊芥揮發(fā)油對LPS致抑郁樣模型小鼠的抗抑郁作用,并表明其作用發(fā)揮與抑制 NLRP3炎癥小體激活,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而減輕神經(jīng)炎癥和海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)。研究結(jié)果拓展了荊芥揮發(fā)油良好抗炎作用的應(yīng)用范圍,為中藥精油用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一定藥理學(xué)依據(jù)。后續(xù)研究可進(jìn)一步從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)角度探索藥物對NLRP3炎癥小體下游通路中關(guān)鍵分子的影響,同時(shí)探究其活性成分。