支氣管肺泡灌洗液結核分子生物學檢測與外周血T 細胞斑點試驗對痰涂片陰性肺結核患者的診斷價值

張 艷 王 華 侯 婧 王 慶

1.安徽省胸科醫院結核三科，安徽合肥 230022；2.安徽省胸科醫院結核八科，安徽合肥 230022

肺結核（pulmonary tuberculosis，PTB）目前仍是威脅人類健康的世界性公共衛生問題，根據世界衛生組織報告數據顯示，2020 年全球新增約987 萬例PTB患者，發病率為127/10 萬，與2018 年的59.27/10 萬及2019年的55.55/10 萬比較，仍呈明顯上升趨勢[1-2]。造成我國PTB 發病率居高的主要原因有以下兩點：一方面，PTB 患者早期缺乏典型的臨床癥狀及體征，臨床診斷率相對較低、缺乏診斷效能高的診斷方法，延誤患者的診斷和治療；另一方面，作為診斷PTB 金標準的結核分枝桿菌培養需要周期長，難以滿足早期PTB 的診療需要，從而引起PTB 社區傳播的概率增加[3-4]。因此，如何在早期快速確診PTB 對其防控具有十分重要的意義。因目前臨床中痰涂片陰性PTB 患者的早期診斷缺乏病原學依據，僅根據患者癥狀、體征及胸部CT、結核菌素試驗、血結核抗體等進行診斷有局限性。隨著實驗室檢查技術的發展，經氣管鏡取局部支氣管肺泡灌洗液行結核分子生物學檢測結合免疫學的T 細胞斑點試驗可以在一定程度上提高PTB 的診斷率，因此本研究分析通過支氣管肺泡灌洗液結核病（tuberculosis，TB）-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T 細胞斑點試驗在痰涂片陰性PTB 中的臨床診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020 年1 月至2021 年4 月在安徽省胸科醫院（以下簡稱“我院”）住院的疑似PTB 患者198例，年齡14～81 歲，平均（40.7±18.4）歲；男137例，女61例。患者有低熱、盜汗、乏力、咳嗽、咯血等癥狀或無明顯臨床癥狀，但體檢經影像學檢查提示有PTB 可能。納入標準：①胸部CT 和臨床癥狀疑似PTB；②痰涂片陰性；③認知正常，能配合完成相關檢查。排除標準：①拒絕支氣管鏡檢查或合并有支氣管檢查禁忌證；②合并有心臟、肝臟、腎臟等重要臟器嚴重功能障礙；③人類免疫缺陷病毒感染、免疫功能嚴重低下等。

1.2 研究方法

以中華人民共和國衛生行業標準肺結核診斷（WS 288—2017）[5]為金標準：①呼吸道分泌物病原學陽性，包括細菌學和分子生物學。②病理學陽性。③免疫學檢查陽性。④PTB 可疑癥狀、體征。⑤影像學檢查符合PTB 改變。臨床診斷需符合⑤及至少合并有①②③④項中任意一項（其中非病原學與病理學診斷病例需專家會診確定）。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過（K2021-018）。對入選患者進行常規檢測后行支氣管鏡檢查，根據胸部CT 提示肺部病灶位置取局部支氣管肺泡灌洗液，進行TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T 細胞斑點試驗。

1.2.1 TB-DNA 檢測設備由迪澳公司提供的核酸擴增熒光檢測儀（Deaou-16P），試劑采用廣州迪澳生物科技公司的結核分枝桿菌核酸擴增熒光制劑（Deaou-1016）。結果判別：樣本檢測時Tt≤45 判定為陽性，無Tt 時判定為陰性，Tt 為熒光強度變化函數的二階導數＞0 且首次出現熒光強度≥閾值，該采集點對應的為閾值時間。

1.2.2 TB-RNA 檢測設備采用瑞士生產的羅氏熒光定量PCR 檢測儀（LightCycler 480 Ⅱ），試劑由上海仁度生物科技公司提供的結核分枝桿菌核酸擴增熒光制劑（RNA03）。結果判別：Dt≤35 判定為陽性；35＜Dt＜40 的樣本建議重新檢測；Dt＜40 判定陽性；Dt 無數值或等于40 時結果判為陰性。Dt 為陽性判定值，指樣本曲線與閾值交點的橫坐標讀數。

1.2.3 Xpert MTB/RIF 檢測 Xpert MTB/RIF 檢測是結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術，檢測系統采用美國Cepheid 公司生產的Xpert MTB/RIF 檢測儀（16 模塊）；試劑是由賽沛公司生產的結核分枝桿菌rpoB 基因突變檢測試劑（GXMTB/RIF-CN-50）。支氣管肺泡灌洗液樣品以2∶1的比例加入樣品處理試劑，振搖10～20 次，室溫靜置15 min，待樣本液化完全后，用無菌移液管取出2 ml緩慢加入檢測匣中，然后使用檢測系統進行檢測。約2 h 后儀器自動判讀結果高、中、低、非常低及陰性結果。Ct 值與結核分枝桿菌載量的對應關系如下，Ct值＜16 為高；16≤Ct 值＜22 為中；22≤Ct 值≤28 為低；Ct 值＞28 為極低，檢測到rpoB 基因突變報告為利福平耐藥，未檢測到rpoB 基因報告利福平耐藥陰性。未檢測到結核分枝桿菌目標DNA 為陰性。

1.2.4 外周血T 細胞斑點試驗 采用SPOT.TB 酶聯免疫熒光斑點分析儀（AID ELISPOT Reader）（德國AID公司），試劑盒（英國Oxford Immunotec Ltd 公司，130100594），嚴格按照儀器及產品說明書操作。結果判斷[6]：①陰性對照孔斑點數＜6 個時，抗原A 孔或抗原B 孔的斑點數-陰性對照孔斑點數≥6 個；②陰性對照孔斑點數≥6 個時，抗原A 孔或抗原B 孔的斑點數≥2×陰性對照孔斑點數。滿足以上任意一條為陽性，否則為陰性。

1.2.5 聯合診斷 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測與外周血T 細胞斑點試驗聯合判定：任意一項陽性判定為陽性，兩項均陰性判定為陰性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計數資料采用例數或百分率表示，采用Kappa 系數分析一致性，Kappa 值為＜0.40、0.40～0.75、＞0.75 的情況下分別代表為一致性較差、一般、較好。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同診斷方法與金標準對痰涂片陰性患者PTB診斷的一致性檢驗

198 例患者中確診PTB 者153 例，支氣管肺泡灌洗液TB-DNA、支氣管肺泡灌洗液TB-RNA、支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測、外周血T 細胞斑點試驗及支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測聯合外周血T細胞斑點試驗檢查與金標準具有一定的一致性（Kappa=0.512、0.449、0.327、0.373、0.793，P ＜0.001）。見 表1～5。

表1 支氣管肺泡灌洗液TB-DNA 與金標準的一致性比較（例）

表2 支氣管肺泡灌洗液TB-RNA 法與金標準的一致性比較（例）

表3 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測與金標準的一致性比較（例）

表4 外周血T 細胞斑點試驗診斷與金標準的一致性比較（例）

表5 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測聯合外周血T 細胞斑點試驗與金標準的一致性比較（例）

2.2 不同檢測方法對痰涂片陰性患者PTB 的臨床診斷價值

痰涂片陰性PTB 患者支氣管肺泡灌洗液TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T細胞斑點試驗的診斷效能見表6。

表6 不同檢測方法對痰涂片陰性患者PTB 的臨床診斷價值（%）

3 討論

在臨床就診的疑似PTB 患者多數痰涂片結果為陰性，由于這部分患者臨床表現不一、病情輕重各異，甚至部分患者系體檢發現，肺部影像學檢查呈多樣性而缺乏特異性改變，從而給PTB 快速診斷造成一定難度[7-9]。結核分枝桿菌培養作為診斷TB 的金標準，但該方法一般需4～6 周后才獲得檢測結果，不利早期診斷[10]。痰涂片檢查簡單、經濟、快速，當天檢測結果即可獲得，但靈敏度偏低（22%～82%），假陰性報告率為17.6%～78.0%，且不能檢出耐藥性[11]，這可能導致部分PTB 患者無法在第一時間得到精準治療，延誤病情。但結核病的病原學檢查仍是發現PTB傳染源的主要檢測方法，并為TB 確診和治療提供重要依據[12-13]。由于結核分枝桿菌在宿主體內大多處于潛伏感染狀態，在這種狀態下，結核分枝桿菌可能會在激活前持續潛伏多年，感染和激活之間的時間間隔未知，因此很難追蹤感染來源，導致疾病傳播情況很難推斷[14-15]。近些年來，結核分子生物學及免疫學檢查的推廣普及可將TB 的診斷從數周的時間降低到數天甚至數小時，臨床比較常見的結核分枝桿菌分子生物學及免疫學檢查為TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF、T 細胞斑點試驗等。

TB-DNA 檢測是一種實時熒光聚合酶鏈反應法檢測技術，此方法通過PCR 檢測結核分枝桿菌DNA。除活菌DNA 外，即使是死菌DNA 在體內也可以存在很長時間[16-18]，可通過PCR 檢測出，故對初治PTB 的敏感性較高，已有曹翌明等[19]研究提示TB-DNA 檢測與分枝桿菌培養的結果完全一致。TB-RNA 檢測是以結核分枝桿菌RNA 為擴增靶向起點，產物RNA 為檢測靶標，由于RNA 只存在于活的結核分枝桿菌中，結核分枝桿菌死亡后菌內RNA 就會很快被降解，故在臨床TB-RNA 檢測可以用于活動性PTB 的診斷及治療效果評估。且TB-RNA 方法快速、簡單，操作過程中交叉污染少[20]。在本研究中，支氣管肺泡灌洗液TB-DNA 與TB-RNA 檢測靈敏度較低，可能與樣本量較小有關。

Xpert MTB/RIF 檢測在本研究中的靈敏度一般，特異度較好，該技術是一種集樣本自動制備、DNA 提取、定量PCR 擴增、結核分枝桿菌特異性核酸檢測及利福平耐藥基因rpo 突變等于一體的快速診斷TB 的方法，同時操作步驟簡單，密閉環境檢測除可避免實驗室人員操作水平及樣本結核分枝桿菌菌量少等因素造成的影響外，還可同時檢出非結核分枝桿菌的特異度也較高，在一定程度上可提高痰涂片陰性PTB患者的診斷水平[21-23]。此外，劉揚等[24]研究證實，Xpert MTB/RIF 技術應用后TB 的確診率高于傳統的診斷方法，并且可以更早、更好地檢測患者是否存在利福平耐藥，對PTB 治療有一定指導作用。

T 細胞斑點試驗是運用特異性抗原ESAT-6 及CFP 10，采用酶聯免疫斑點技術平臺檢測患者機體內是否有針對結核分枝桿菌反應的效應T 細胞，由此診斷該患者是否存在結核分枝桿菌感染[25-26]。T 細胞斑點試驗不僅靈敏度和特異性較高[27-29]，而且送檢時間短，且基本不受機體免疫狀況的影響[25]。T 細胞斑點試驗除靈敏度較高、標本易獲得外，其不受非結核分枝桿菌及其他細菌感染影響，可作為是否有結核感染的鑒別診斷方法，但由于此法不能區分TB 是活動性或潛伏性，臨床存在一定的假陰性[25]。本研究結果提示其不能完全替代病原學檢測診斷PTB，但本研究中將外周血T 細胞斑點試驗與支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測進行聯合診斷，其靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均較好，與金標準的一致性較好，提示聯合診斷方法真實有效，具有很好的可靠性。

綜上所述，每一項檢測方法都具有各自的優勢和缺點。其中運用經支氣管鏡進行局部肺泡灌洗液送檢Xpert MTB/RIF 聯合外周血T 細胞斑點試驗在痰涂片陰性PTB 診斷中具有重要的臨床價值。