基于鐵死亡相關(guān)長鏈非編碼RNA對子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后分析

宋玉瑩 崔 琳 孫 蕾 何玉鳳 祝慧穎 王 飛 李 焱

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室及心臟中心，河南鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心，河南鄭州 450000

2015 年我國新發(fā)病子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）病例數(shù)6.9 萬，發(fā)病率為10.28/10 萬人[1]。患者陰道不規(guī)則出血癥狀典型，因此多數(shù)患者可早期診斷，5 年生存率達95%。當(dāng)患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移或具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險時，其生存率、治愈率低[2-3]。EC 治療方法是手術(shù)，存在高復(fù)發(fā)風(fēng)險時術(shù)后給予放療[4]，但會出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如急性毒性和長期并發(fā)癥[5]；出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移時術(shù)后給予化療[4]，但患者的生理功能和情感狀態(tài)持久遞減[6]。因此，尋找敏感、可靠的標(biāo)志物對疾病的診斷和治療至關(guān)重要。鐵死亡是新型的細胞死亡方式。在腫瘤中調(diào)控鐵死亡的基因常發(fā)生突變，使癌細胞對鐵死亡敏感[7]。鐵又是癌細胞增殖和發(fā)展的必需元素[8]。因此，調(diào)節(jié)鐵死亡水平可能是針對癌癥的新型治療方法。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）雖不編碼蛋白，但參與細胞內(nèi)多種過程的調(diào)控，如腫瘤細胞增殖和分化、基因表達的遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等的調(diào)節(jié)[9]。越來越多的研究表明鐵死亡相關(guān)lncRNA 特征與腫瘤的進展、療效及預(yù)后密切相關(guān)[10]。

1 資料與方法

1.1 鐵死亡基因及富集分析

①TCGA 數(shù)據(jù)庫中收集EC 患者的RNA-Seq 數(shù)據(jù)、臨床數(shù)據(jù)。臨床資料包括生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、分級等。②FerrDb 數(shù)據(jù)庫中得到鐵死亡基因。③通過R 軟件將疾病數(shù)據(jù)與鐵死亡基因取交集，得到在癌與癌旁組織中差異表達的鐵死亡相關(guān)基因，即差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。④以|logFC|≥1、錯誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05 為條件，利用R 軟件的clusterProfiler、enrichplot、ggplot2、stringi、colorspace 安裝包對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析。

1.2 鐵死亡預(yù)后lncRNA

以鐵死亡基因為點，通過Pearson 相關(guān)性分析得到鐵死亡相關(guān)lncRNA，以P＜0.001、相關(guān)系數(shù)＞0.4條件篩選lncRNA。利用limma 安裝包合并鐵死亡相關(guān)lncRNA 表達與臨床數(shù)據(jù)的生存狀態(tài)，生存時間合并的表達文件利用R 軟件的survival 安裝包進行單因素Cox 回歸分析找出與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA（P＜0.05）。確定與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA 在腫瘤組織中是呈正相關(guān)（HR＞1）還是呈負(fù)相關(guān)（HR＜1）。

1.3 基于預(yù)后相關(guān)lncRNA 構(gòu)建模型

從預(yù)后lncRNA 中，運用Lasso-Cox 回歸分析，再次篩選用于構(gòu)建模型的lncRNA，計算風(fēng)險評分，根據(jù)中位數(shù)分組，即高風(fēng)險組（≥中位數(shù)）、低風(fēng)險組（＜中位數(shù)）。風(fēng)險評分=系數(shù)lncRNA×lncRNA 表達量。

1.4 應(yīng)用預(yù)后模型進行預(yù)后分析

用R 軟件survival、survminer 安裝包繪制Kaplan-Meier生存曲線，觀察高、低風(fēng)險組生存狀況，當(dāng)P＜0.001 時，則提示兩組間存在生存差異。用R 軟件的pheatmap 安裝包繪制風(fēng)險評分熱圖、風(fēng)險評分圖、生存狀態(tài)分布圖。用R 軟件的timeROCR、ggDCA 繪制受試者操作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲線、決策曲線分析法（decision curve analysis，DCA）曲線分析預(yù)后模型風(fēng)險評分及臨床特征預(yù)測的生存效果，以曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）評估預(yù)后預(yù)測能力。

1.5 生存因素的評價

用survival 將患者年齡、分級、預(yù)后模型風(fēng)險評分納入單、多因素Cox 比例風(fēng)險模型，評價生存因素。

1.6 lncRNA 與病理表現(xiàn)間的關(guān)系及預(yù)測患者生存期

用pheatmap 繪制熱圖評估鐵死亡相關(guān)lncRNA與臨床病理表現(xiàn)之間的關(guān)系。用regplot 構(gòu)建結(jié)合預(yù)后特征的列線圖，預(yù)測EC 患者的1、3、5年生存期。

1.7 預(yù)后模型的免疫分析與基因表達

應(yīng) 用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QU-ANTISEQ、MCPcounter、XCELL、EPIC 算法，對高、低風(fēng)險組免疫細胞及功能進行分析。用R 軟件對兩組lncRNA 進行免疫細胞、功能、檢查點及m6A 的相關(guān)mRNA 差異表達分析。利用熱圖揭示了不同算法下免疫反應(yīng)lncRNA 的差異。

2 結(jié)果

2.1 鐵死亡相關(guān)基因及富集分析

在TGCA 數(shù)據(jù)庫中得到589 組RNA-Seq 數(shù)據(jù)，其中35 個正常組、554 個癌癥組；548 組臨床數(shù)據(jù)。RNA-Seq 數(shù)據(jù)中與鐵死亡相關(guān)基因248 個。與248個鐵死亡相關(guān)基因相關(guān)的lncRNA 有1 616 個，其中有80 個DEGs（表達上、下調(diào)分別有55、25 個）。

2.2 DEGs 的富集分析

GO 分析的生物過程結(jié)果顯示，主要參與氧化應(yīng)激、細胞對化學(xué)應(yīng)激等過程；細胞組成結(jié)果顯示，主要調(diào)控基底質(zhì)膜、細胞基底等合成；分子功能結(jié)果顯示，主要影響陰離子、有機陰離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等功能。KEEG 結(jié)果顯示，主要參與鐵死亡、谷胱甘肽代謝通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化等過程。見圖1。

圖1 DEGs 的富集分析

2.3 鐵死亡預(yù)后相關(guān)lncRNA

整理得到1 616 個lncRNA。單因素Cox 回歸分析初步篩選出45 個與鐵死亡相關(guān)的lncRNA，經(jīng)Lasso-Cox 優(yōu)化，最終確定14 個lncRNA 用于構(gòu)建預(yù)后模型。見表1。

表1 lncRNA 參數(shù)

2.4 應(yīng)用風(fēng)險評分模型預(yù)測患者生存

①Kaplan-Meier 生存曲線顯示，低風(fēng)險組生存狀況優(yōu)于高風(fēng)險組（P＜0.001），圖2A；②lncRNA 風(fēng)險分型 結(jié)果顯示，AL606970.1、AC004585.1、AC067750.1、AC004596.1 屬于低風(fēng)險 lncRNA，AC244517.7、AP001107.5、LINC00443、AC010761.4、CFAP58-DT、PVT1、AC103563.2、SCAT2、LINC00942、LINC01629 屬于高風(fēng)險lncRNA，見圖2B；③預(yù)后模型風(fēng)險評分、患者生存狀態(tài)分布顯示，患者的危險評分與EC 患者的生存成反比，見圖2C；④ROC 曲線顯示，應(yīng)用風(fēng)險評分模型預(yù)測患者1、2、3 年生存的AUC 為0.696、0.715、0.747，見圖2D；⑤AUC 值結(jié)果顯示，風(fēng)險評分預(yù)測患者1 年生存的AUC 值大于年齡、分級，見圖2E；⑥D(zhuǎn)CA曲線分析顯示，風(fēng)險評分預(yù)測患者生存優(yōu)于年齡、分級，見圖2F。以上結(jié)果提示構(gòu)建的預(yù)后模型在生存預(yù)測上優(yōu)于臨床特征。

圖2 預(yù)測結(jié)果評價

2.5 單因素、多因素Cox 分析

單因素、多因素Cox 結(jié)果顯示，模型風(fēng)險評分是預(yù)測EC 患者生存的獨立影響因素[HR（95%CI）＝1.105（1.081～1.129）；HR（95%CI）＝1.108（1.081～1.135），均P＜0.001]；納入預(yù)后模型的lncRNA 與鐵死亡基因共表達的網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。

圖3 獨立預(yù)后Cox 分析鐵死亡相關(guān)lncRNA

2.6 預(yù)后模型lncRNA 的熱圖與列線圖

lncRNA 與臨床特征的關(guān)聯(lián)熱圖顯示，在高、低風(fēng)險組中年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。列線圖顯示：隨機選取第200 個患者，患者的風(fēng)險評分、年齡、分級總分為270，該患者1、3、5 年內(nèi)的死亡率為0.097 9、0.371 0、0.474 0，見圖5。

圖4 預(yù)后模型lncRNA 的熱圖

圖5 預(yù)后模型lncRNA 的列線圖

2.7 免疫浸潤與基因表達

高、低風(fēng)險組免疫細胞分布熱圖顯示：兩組免疫細胞水平存在差異（P＜0.05），見圖6。免疫功能結(jié)果：高、低風(fēng)險組APC 共同刺激、CCR、HLA 等比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7A；免疫檢查點結(jié)果：高、低風(fēng)險組PDCD-1、CTLA-4、TIGIT 等比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7B；m6A 結(jié)果：高、低風(fēng)險組YTHDF1、FTO、RBM15 等比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7C。

圖6 免疫細胞分布

3 討論

鐵死亡能克服惡性腫瘤細胞的耐藥性，有助于瘤細胞清除。因此，針對鐵死亡的治療可作為抗腫瘤的新方法。基于鐵死亡相關(guān)預(yù)后lncRNA 構(gòu)建模型，從免疫浸潤及m6A 方面分析預(yù)后lncRNA 在腫瘤微環(huán)境（tumor micro environment，TME）中的作用。

KEGG 通路顯示，差異基因主要參與鐵死亡、谷胱甘肽代謝通路、癌癥中的中心碳代謝等過程。癌癥組織中活性氧（reactiveoxygen species，ROS）大量增多[11]，為抵抗過高的ROS，會提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平[12]，并利用其解毒能力來抵消抗腫瘤藥物的活性[13]。癌癥中細胞代謝起核心作用，侵襲性腫瘤細胞的特征是代謝轉(zhuǎn)換，即有氧糖酵解和乳酸產(chǎn)生增加[14]。KEGG 結(jié)果提示，DEGs 可能是潛在的治療靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)14 種lncRNA 是EC 的獨立影響因素，已有研究顯示[15-22]，這些lncRNA 是預(yù)后的危險因素。LINC00443 為腫瘤抑制因子，與腎透明細胞癌預(yù)后相關(guān)[15]。Liang 等[16]在CFAP58-DT 對膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)敲低CFAP58-DT，細胞增殖減少、凋亡增多。提示在膀胱癌中CFAP58-DT 可能是促增殖因子，但具體機制有待研究。在腎透明細胞癌中，LINC00942與miR-3139 可調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，影響患者生存和預(yù)后[17]。Sun 等[18]發(fā)現(xiàn)LINC00942 是乳腺癌易感基因，參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，促進mettl14 介導(dǎo)的m6A甲基化修飾，調(diào)控下游基因CXCR4、CYP1B1 的mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達，從而促進腫瘤的生長發(fā)育。同時，驗證1 條LINC00942-mettl14-CXCR4/CYP1B1 通路，為乳腺癌的治療提供新途徑[18]。PVT1 位于著名癌基因MYC 下游，與MYC 頻繁共增殖[19-20]。作為致癌因子，PVT1 通過吸附結(jié)合miRNA 等機制，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與代謝等密切相關(guān)[20]。AP001107.5[21]、AC004585.1[22]在腫瘤中已有研究報道。其他lncRNA在腫瘤中首次發(fā)現(xiàn)。目前為止，尚未有關(guān)于鐵死亡相關(guān)lncRNA 在EC 預(yù)后中的作用的研究。這些發(fā)現(xiàn)可能為未來控制癌癥提供寶貴的信息。

根據(jù)免疫細胞、功能顯示：TME 免疫浸潤在高風(fēng)險組處高水平。TME 中主要有B 細胞、T 細胞、巨噬細胞等，參與體內(nèi)諸多免疫過程，是治療腫瘤重要靶點[23-25]。免疫細胞及功能在高、低風(fēng)險組間存在差異，這可能是導(dǎo)致生存差異的重要因素。

本研究是預(yù)測性的研究，沒有臨床驗證，所以結(jié)果的可靠性不能得到保證。此外，臨床數(shù)據(jù)有限，應(yīng)謹(jǐn)慎運用。總的來說，本研究中建立的預(yù)后預(yù)測模型需進一步實驗研究。