SNHG17 通過調節miR-23b-3p 和ZHX1對膠質母細胞瘤惡性表型的調控作用研究

葛北海 周 偉 韋檸琳 張 獻 莫 云 蘇 州 秦光平 徐國龍

1.廣西壯族自治區腦科醫院神經內科，廣西柳州 545005；2.廣西壯族自治區腦科醫院神經外科，廣西柳州 545005

膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤之一，膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）具有細胞增殖和侵襲能力強、惡性程度高、復發率高的特點、5 年生存率僅5%[1]。臨床上一直在探索膠質瘤的有效治療方法，其中靶向治療越來越引起學者的重視[2]。研究GBM 的發病機制，尋找其分子診斷標記和分子靶點，對于改善膠質瘤預后具有積極意義。小核仁RNA 宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）是一個含1 186 個核苷酸的長鏈非編碼RNA，屬于SNHG 家族，位于人類染色體20q11.23 上。既往的研究報道，SNHG17 在多種腫瘤中異常高表達，其通過充當內源競爭RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）或直接結合蛋白質發揮調節細胞增殖、侵襲、遷移、血管生成、細胞周期及凋亡的功能[3-7]。然而，SNHG17 在GBM 中的表達特征和功能還未得到完全闡明。本研究旨在探究SNHG17 是否通過miR-23b-3p/ZHX1 軸調控GBM 惡性表型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標本 選取2020 年1 月至2022 年11 月廣西壯族自治區腦科醫院（以下簡稱“我院”）神經外科診斷為GBM 的33 例患者，其中男21 例，女12 例；年齡11～56 歲，平均（26.0±6.5）歲。收集患者的手術標本，包括其GBM 樣本和癌旁正常組織，所有樣本經廣西柳州市工人醫院病理科醫生確認。手術過程中獲得樣本后，立即將所有組織在液氮中冷凍儲存直至使用。納入標準：①在我院神經外科行手術治療；②年齡≥18 歲；③首次診斷。排除標準：①合并其他系統腫瘤；②術前采用放射療法或化學療法；③孕婦。本研究得到了我院倫理委員會的批準（2020-21），且已獲得所有參與患者的書面知情同意。

1.1.2 細胞 人源GBM 細胞系A172 和DK-MG 購自American Type Culture Collection。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染 所有細胞系均置于含有10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養基中，于37℃、5%CO2條件下培養。在GBM 細胞處于對數生長期時，使用Lipofectamine2000（Invitrogen，11668，美國）進行細胞轉染。轉染36 h 后，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測轉染效率。通過細胞轉染，將細胞分為si-NC 組、si-SNHG17#1 組和si-SNHG17#2 組；繼續轉染后將細胞分為si-NC 組、si-SNHG17 組（選擇轉染效率更高的si-SNHG17#2）及si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組，所有材料均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2.2 qRT-PCR 檢測基因表達水平 使用TRIzol 試劑盒（Invitrogen，15596-026，美國）分離并提取細胞和組織中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa，rr047a，日本）進行逆轉錄獲得cDNA。之后以cDNA 為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix（QPK-201，日本）進行實時定量PCR，使用2-ΔΔCt法計算相對表達。PCR 擴增條件：預變性（95℃，2 min）；變性（95℃，30 s），退火（60℃，30 s）；延伸（70℃，1 min），共40 個循環；最后延伸（70℃，5 min）。PCR 反應體系為cDNA 4 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μl 及雙蒸水6.5 μl。引物（深圳華大基因股份有限公司）序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8 檢測細胞增殖 細胞計數試劑盒將細胞以2×103個細胞/孔的密度接種于96 孔板，每組6個復孔，分別培養0、24、48 及72 h。在每個時間點，每孔加入10 μl CCK-8 溶液并孵育1 h。之后使用酶標儀在450 nm 波長處觀察光密度值，僅含有培養基的孔為對照孔。

1.2.4 EdU 法檢測細胞增殖接種細胞于24 孔板，每組3 個復孔，培養細胞直至細胞進入對數生長期，更換培養基，按照EdU 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明，每孔加入EdU 試劑，孵育2 h。使用PBS清洗細胞及4%多聚甲醛固定細胞，之后滴加0.5%TritonX-100，置于搖床上進行破膜。再次PBS 清洗后加入Click-It 反應物染色，加入Hoechst 在暗室內孵育、復染DNA。使用PBS 再次清洗后置于熒光顯微鏡下觀察細胞。其中，藍色熒光為細胞總數，紅色熒光為增殖的細胞，細胞增殖率（%）=紅色熒光細胞數/藍色熒光細胞數×100%。

1.2.5 Transwell 法檢測遷移和侵襲能力 使用胰酶消化細胞后，用不含FBS 的DMEM 培養基重懸細胞，并接種于上室中，下室添加500 μl 含10%FBS 的DMEM培養基。每組3 個復孔，之后將細胞置于培養箱中培養，24 h 后清理上室中未遷移或侵襲的細胞，用4%多聚甲醇固定遷移或侵襲的細胞30 min，再用結晶紫染色30 min。之后使用PBS 去除浮色，隨后使用倒置顯微鏡（×100）用于計數遷移或侵襲的細胞數量。

1.2.6 Western blot 實驗 用RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）從細胞中提取總蛋白，之后將蛋白樣本與上樣緩沖液按5∶1 比例混合，在沸水中加熱10 min 使蛋白變性。之后通過聚丙十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本，將蛋白電轉到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h后，隨后用對應的一抗anti-ZHX1（1∶1 000）和anti-GAPDH（1∶2 000）在4℃條件下孵育過夜。次日加入HRP 標記的二抗（1∶3 000）于室溫孵育1 h。使用洗膜緩沖液清洗PVDF 膜3 次后使用ECL 試劑盒進行顯色成像。抗體均購自英國Abcam 公司。實驗重復3次，最后通過Image J 軟件（NIH，美國）掃描并確定蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示。使用t 檢驗或單因素方差分析（one-way ANOVA）評估兩組或多組數據之間的差異。使用Pearson 相關分析評估SNHG17、miR-23b-3p 及ZHX1 之間的表達相關性。組間比較采用t 檢驗；計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG17、miR-23b-3p 和ZHX1 在GBM 組織中異常表達

qRT-PCR 檢測結果提示，GBM 組織中SNHG17的表達高于癌旁組織，差異有高度統計學意義（P＜0.01），見圖1A；GBM 組織中miR-23b-3p 的表達低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1B；GBM 組織中ZHX1 高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1C。Pearson 相關性分析結果顯示：在GBM 組織中，SNHG17 和miR-23b-3p 之間的表達呈負相關（r=-0.711，P＜0.001），見圖1D；SNHG17 和ZHX1 之間的表達呈正相關（r=0.648，P＜0.001），見圖1E；miR-23b-3p 和ZH X1 之間的表達呈負相關（r=-0.637，P＜0.001），見圖1F。

圖1 SNHG17、miR-23b-3p 和ZHX1 在GBM 組織中的表達（n=3）

2.2 敲低SNHG17 抑制GBM 細胞的增殖、遷移和侵襲能力

敲低SNHG17 后，qRT-PCR 檢測結果提示，在A172 和DK-MG 細胞中，si-SNGH17#1 組和SNGH17#2 組中的SNGH17 表達均低于si-NC 組，差異有高度統計學意義（P＜0.01），見圖2A。CCK-8 實驗檢測結果顯示，在培養A172 和DK-MG 細胞72 h 時，si-SNHG17#1、si-SNHG17#2 組的細胞增殖能力均低于si-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2B。EdU 及Transwell 實驗檢測結果顯示，在A172 和DK-MG 細胞中，si-SNHG17#1、si-SNHG17#2 組的細胞增殖、遷移和侵襲能力均低于si-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2C～E。

圖2 敲低SNHG17 抑制GBM 細胞的增殖、遷移和侵襲（n=3）

2.3 SNHG17 通過調節miR-23b-3p 影響GBM 細胞增殖、侵襲和遷移

qRT-PCR 檢測結果提示，在A172 和DK-MG 細胞中，si-SNHG17 組中的miR-23b-3p 表達高于si-NC 組，但si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組中miR-23b-3p 表達低于si-SNHG17 組，差異有高度統計學意義（P＜0.01），見圖3A。CCK-8 實驗檢測結果顯示，在培養A172 和DK-MG 細胞72 h 時，si-SNHG17 組的細胞增殖能力均低于si-NC 組，而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組的細胞增殖能力均高于si-SNHG17 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。EdU 及Transwell 實驗檢測結果顯示，在A172 和DK-MG 細胞中，si-SNHG17 組的細胞增殖、遷移和侵襲能力均低于si-NC 組，而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組的細胞增殖、遷移和侵襲能力均高于si-SNHG17 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3C～E。

圖3 SNHG17 調節miR-23b-3p 促進GBM 細胞的增殖、遷移和侵襲（n=3）

2.4 ZHX1 表達受SNHG17 和miR-23b-3p 調控

在A172 和DK-MG 細胞中，si-SNHG17 組 的ZHX1 mRNA 及蛋白表達水平顯著低于si-NC 組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組中的ZHX1 mRNA 及蛋白表達水平高于si-SNHG17 組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖4A～B。

圖4 SNHG17 和miR-23b-3p 在GBM 細胞中調控ZHX1 的表達（n=3）

3 討論

SNHG17 相繼被發現在結直腸癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌及骨肉瘤等腫瘤中過表達[6，8]。SNHG17 可以與DNA、蛋白質及RNA 相互作用，如果位于細胞核內，它可與蛋白質結合，在轉錄水平調控靶基因表達；如果其位于細胞質中，它可充當ceRNA 在轉錄后水平發揮調節細胞增殖、侵襲及遷移的功能[7]。SNHG17 可作為分子海綿與mRNA 競爭性結合miRNA，進而影響多種癌基因如ZHX1 發揮調節細胞增殖、侵襲、遷移等生物學進程[6]。本研究探索了膠質瘤增殖和轉移的新的調控網絡，即SNHG17、miR-23-3p 和ZHX1。

miRNA 是重要的轉錄后調節因子，可通過直接的堿基配對作用于mRNA 的3’端非翻譯區中的靶向位點[9]。近年來有多項研究[10-14]表明，失調的miRNA 在衰老、心血管疾病，尤其在腫瘤的進展中起著關鍵作用。lncRNA 可以發揮ceRNA 的作用，作為分子海綿與mRNA 競爭性結合miRNA，從而在轉錄后水平上調控基因的表達[6]。本研究發現，在GBM 中，SNHG17可作為miR-23b-3p 的分子海綿抑制其表達水平；此外，miR-23b-3p 可逆轉SNHG17 對A172 和DK-MG細胞惡性表型的促進作用。研究結果提示，SNHG17/miR-23b-3p 軸是GBM 進展中的關鍵調控通路。

ZHX 家族由3 種蛋白質組成，即ZHX1、ZHX2 和ZHX3。該家族的所有成員都包含兩個Cys2-His2 鋅指基序和5 個同源框DNA 結合域[15]。既往的研究報道，ZHX 蛋白與腎小球疾病、造血細胞分化和肝細胞癌相關[16-18]。ZHX1 可與NF-YA、BS69 和DNMT3B 的激活域相互作用[19-21]，先前的研究也報道，ZHX1 在不同腫瘤中發揮不同生物學功能：如ZHX1 可抑制胃癌細胞的增殖和遷移[22]，而促進肝細胞癌、乳腺癌和膠質瘤細胞的惡性表型[18，23-24]。本研究發現，在GBM 細胞系A172 和DK-MG 中，ZHX1 是miR-23b-3p 的一個靶基因，且可被SNHG17 調控。

總之，本研究發現GBM 組織中SNHG17 和ZHX1的表達顯著高于癌旁組織，而miR-23b-3p 的表達較癌旁組織顯著下調，且三者之間存在調控關系。體外實驗發現SNHG17 通過靶向下調miR-23b-3p 繼而上調ZHX1 進而促進GBM 細胞增殖、遷移和侵襲。本研究揭示了SNHG17/miR-23b-3p/ZHX1 軸可能是GBM 進展過程中一個重要的功能網絡，為膠質瘤診斷與治療提供了一個新分子靶點。