基于TLR4/ NF-κB 信號(hào)通路探討“氣血并治”針法對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠炎性損傷的影響

王佳佳 嵇 波 劉翼天 石天宇 葛云鵬 謝亞娜 方 洋 張 玲

北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 102488

神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylosis radiculopathy，CSR）主要表現(xiàn)為上肢放射性疼痛，伴活動(dòng)受限，后期可導(dǎo)致肌肉萎縮，使患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1]，其治療多選擇非甾體抗炎藥、阿片類止痛藥等，但存在胃腸道刺激、藥物依賴等副作用[2]。氣滯血瘀證是CSR 的主要證型之一，約占51.43%[3]，故臨床治療多以益氣活血為主。本研究選取頸夾脊穴、膈俞、足三里，共同組成“氣血并治”穴組，基于Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/ 核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）經(jīng)典炎癥信號(hào)通路，探討“氣血并治”針法對(duì)CSR 大鼠炎性損傷的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD 大鼠24 只，5～7 周齡，180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，合格證號(hào)1100112111151 48985。飼養(yǎng)于12/12 h 明暗周期，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度45%～60%的清潔級(jí)動(dòng)物房。研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BUCM-4-2020090902-3039）。

1.2 主要試劑及儀器

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法試劑盒（貨號(hào)：1210210721，美國(guó)RayBiotech 公司）；前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）（批號(hào)：20220410.60069R，北京瑞博格科技發(fā)展有限公司）；TLR4、GAPDH 抗體（貨號(hào)：bs-2059R、bs-2188R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；NF-κB、環(huán)氧合酶2（cycloxygenase-2，COX-2）抗體（貨號(hào)：8242S，12282S，賽信通生物試劑有限公司）；羊抗兔IgG（貨號(hào)：bs-0259G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。HANS-200A 電針儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）；無菌針灸針（0.20 mm×13 mm，漢醫(yī)醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀SpectraMax M2（美國(guó)Molecular Devices）；H-7650 型透射電子顯微鏡（東京Hitachi）。

1.3 模型制備

將大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、“氣血并治”針法組，每組6 只。模型組、“氣血并治”針法組采用椎管插線法制備CSR 大鼠模型[4]。大鼠麻醉后，俯臥位固定，從T2棘突向上做縱向切口，充分暴露左側(cè)頸6、7 椎弓根，移除左側(cè)頸6、7 椎弓根以暴露脊髓，沿脊髓縱軸，在左側(cè)神經(jīng)根下植入兩根漁線（分別壓迫頸6～胸1 和頸7～頸5 神經(jīng)根），逐層縫閉組織。假手術(shù)組除不置入漁線外，其他操作同上。

大鼠模型評(píng)估。造模后第3 天觀察大鼠有無舔舐、撕咬、嘶叫等行為，結(jié)合Kawakami 法[5]進(jìn)行步態(tài)評(píng)分，1 分：步態(tài)正常，左側(cè)前足無畸形；2 分：輕微步態(tài)障礙，伴有左側(cè)前足畸形，如左前足屈曲；3 分：嚴(yán)重步態(tài)障礙伴有左前足畸形。步態(tài)評(píng)分≥2 分為造模成功。

1.4 治療方法

造模后第3 天，“氣血并治”針法組固定在自制的束縛裝置中，暴露頸部和四肢，參考“大鼠穴位圖譜”[6]取穴針刺雙側(cè)頸5、7 夾脊、足三里和膈俞，頸夾脊穴予電針疏密波，2 Hz/50 Hz，強(qiáng)度1.5 mA，30 min/d。空白組、假手術(shù)組、模型組不予治療，固定同“氣血并治”針法組。

1.5 組織處理

治療結(jié)束后24 h 內(nèi)處死大鼠，收集頸5-胸1 節(jié)段脊髓組織備檢。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 電鏡觀察壓線段脊髓的超微結(jié)構(gòu) 取脊髓組織于4%的戊二醛中固定，染色切片后，在透射電鏡下觀察。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)大鼠脊髓白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、PGE2水平 按照試劑盒說明，測(cè)定大鼠脊髓IL-1β、PGE2蛋白水平，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3 Western blot 檢測(cè)大鼠脊髓TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白表達(dá) 制備12%SDS-PAGE 凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB（1∶2 000）、COX-2（1∶1 000）和GAPDH（1∶4 000）4℃過夜。室溫孵育二抗羊抗兔（1∶2 000）1 h 后顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠步態(tài)評(píng)分表現(xiàn)

治療前，假手術(shù)組步態(tài)評(píng)分與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組步態(tài)評(píng)分較空白組升高（P＜0.05）；治療后，假手術(shù)組步態(tài)評(píng)分與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組步態(tài)評(píng)分較空白組升高（P＜0.01），“氣血并治”針法組步態(tài)評(píng)分較模型組降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后步態(tài)評(píng)分比較（分，，n=6）

表1 各組大鼠治療前后步態(tài)評(píng)分比較（分，，n=6）

注 與空白組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05。

2.2 各組大鼠脊髓超微結(jié)構(gòu)比較

空白組和假手術(shù)組大鼠髓鞘外形規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整；模型組髓鞘結(jié)構(gòu)不規(guī)則，部分髓鞘斷裂消失，厚薄不一，板層結(jié)構(gòu)松散、扭曲、破裂，線粒體腫脹，甚至部分溶解消失；與模型組比較，“氣血并治”針法組髓鞘板層松散程度有所減輕，結(jié)構(gòu)較緊湊，可見清晰的線粒體。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓超微結(jié)構(gòu)（10 000×）

2.3 各組大鼠脊髓IL-1β、PGE2 蛋白表達(dá)水平比較

假手術(shù)組IL-1β 和PGE2蛋白表達(dá)水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組IL-1β 和PGE2蛋白表達(dá)水平高于空白組（P＜0.01）；“氣血并治”針法組IL-1β 和PGE2蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠脊髓IL-1β、PGE2 蛋白表達(dá)水平比較（，n=6）

表2 各組大鼠脊髓IL-1β、PGE2 蛋白表達(dá)水平比較（，n=6）

注 與空白組比較，aaP＜0.01；與模型組比較，bbP＜0.01。IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；PGE2：前列腺素E2。

2.4 各組大鼠脊髓TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組大鼠脊髓組織TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

假手術(shù)組TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白表達(dá)量較空白組升高（P＜0.01）；“氣血并治”針法組TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白表達(dá)量低于模型組（P＜0.01）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

表3 各組大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

注 與空白組比較，aaP＜0.01；與模型組比較，bbP＜0.01。TLR4：Toll 樣受體4；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子κB；COX-2：環(huán)氧合酶2。

3 討論

CSR 發(fā)病率占頸椎病的60%，其發(fā)病率逐年上升，并逐漸傾向年輕化[7]。電針常用于治療CSR[8]，既往多選取頸夾脊穴[9]，夾脊穴有“趨神經(jīng)”現(xiàn)象，針刺頸夾脊對(duì)脊神經(jīng)的前后支和交感神經(jīng)干產(chǎn)生刺激，可以調(diào)節(jié)局部和臟腑功能[10-11]。本研究選取的頸5、7 夾脊穴，其受到刺激后能夠調(diào)節(jié)頸5-胸1 神經(jīng)根受壓的任一節(jié)段，且選擇頸5、7 夾脊穴可以避免因距離過近而致脫針的問題。CSR 的發(fā)生與氣血失和密切相關(guān)[12]，故選取調(diào)和氣血的血會(huì)膈俞和陽明胃經(jīng)的合穴足三里，四者相合，共奏益氣活血之功。

術(shù)后CSR 模型大鼠的行走受限，步態(tài)評(píng)分升高，表明造模成功，與既往研究結(jié)果一致[13-15]；“氣血并治”針法治療后，大鼠步態(tài)評(píng)分趨于正常，提示電針可以有效改善CSR 模型大鼠活動(dòng)受限。當(dāng)脊髓發(fā)生炎癥時(shí)，神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)排列松散、扭曲、破裂，線粒體腫脹，甚至部分消失，與既往研究一致[16-17]；治療后，CSR 大鼠髓鞘板層結(jié)構(gòu)較緊湊，線粒體數(shù)量增多，結(jié)果提示“氣血并治”針法在一定程度上可以改善CSR 大鼠炎性損傷。

TLR4 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在脊髓和脊髓背角均可檢測(cè)到TLR4 蛋白的表達(dá)[18-20]，其能夠激活炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子NF-κB，NF-κB 可以控制編碼促炎性細(xì)胞因子IL-1β 和COX-2 的基因表達(dá)[21-22]，COX-2 為同工酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2[23-24]。IL-1β和PGE2均是較強(qiáng)的致炎因子，可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。有研究[25-26]表明，抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可以減少IL-1β 和PGE2的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，CSR 大鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB、COX-2、IL-1β、PGE2蛋白表達(dá)升高，提示TLR4/NF-κB 通路參與了CSR 的炎癥反應(yīng)。經(jīng)“氣血并治”針法治療后，大鼠脊髓組織中TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白顯著降低，提示“氣血并治”針法具有明確抗炎作用。

綜上，“氣血并治”針法可改善CSR 大鼠步態(tài)，其機(jī)制可能是通過阻抑TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激活，下調(diào)IL-1β 和PGE2的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。