HRT-FET 中雌激素應用天數(shù)對妊娠結(jié)局的影響

潘正美，吳妍芝，李 艷，趙怡越，胡 希，劉 洋

（昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學科，云南 昆明 650101）

輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）是目前臨床上治療不孕癥的主要手段。凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）是指將在ART 周期中獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎進行冷凍保存，以便進行下一次移植，減少控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）的次數(shù)，提高累積妊娠率，同時減少卵巢過度刺激綜合征的發(fā)病率，并為胚胎植入前遺傳學檢測的實施預留時間[1-3]。近10 a 來，隨著胚胎玻璃化冷凍技術的發(fā)現(xiàn)，胚胎的存活率和FET 的妊娠率得到極大提高[4]。FET 已越來越多地應用于ART 中。

研究表明，子宮內(nèi)膜容受性是除了胚胎質(zhì)量以外影響胚胎移植結(jié)局的最重要因素[5-6]，尤其是在FET 周期。因此，通過改善子宮內(nèi)膜容受性對提高妊娠率尤為重要。近年來，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術（RNA-seq）評估子宮內(nèi)膜容受性，協(xié)助判斷種植時間窗，指導胚胎移植時間受到廣泛關注，但其費用昂貴，且為侵襲性操作，其結(jié)果用來指導下一次月經(jīng)周期的移植時間窗是否準確尚不清楚[7]。因此，目前臨床上檢測子宮內(nèi)膜容受性最常用的方法是通過陰道超聲檢查綜合評估子宮內(nèi)膜的厚度、分型和子宮動脈血流來判斷種植時間窗。大量研究表明，子宮內(nèi)膜厚度是影響胚胎移植成功的主要因素之一，因此，選擇最佳的子宮內(nèi)膜準備方案以便有效促進子宮內(nèi)膜增殖對于提高FET 的妊娠率尤為重要。

目前凍融胚胎移植技術的子宮內(nèi)膜準備方案主要包括自然周期、激素替代周期（hormone replacement therapy，HRT）、促排卵周期[8]，雖然缺乏高質(zhì)量證據(jù)明確FET 周期最佳的子宮內(nèi)膜準備方案，但無論何種內(nèi)膜準備方案，確保胚胎與子宮發(fā)育的同步性是移植成功的關鍵。HRT 是指通過補充外源性雌激素和孕激素來促進子宮內(nèi)膜的增長和轉(zhuǎn)化，尋找種植時間窗。因HRT 周期具有就診次數(shù)少，移植時間靈活，患者依從性高，近年來在臨床中得到廣泛應用[9]。研究表明在HRT 周期中，應該模擬28 d 正常月經(jīng)周期內(nèi)激素變化，在早卵泡期給予補充外源性雌激素，持續(xù)約14 d 左右，以達到促進子宮內(nèi)膜增生的目的，當內(nèi)膜厚度超過8 mm，另外補充孕激素使子宮內(nèi)膜在雌激素和孕激素共同作用下向分泌期轉(zhuǎn)化。對于薄型子宮內(nèi)膜的患者，可以采用增加雌激素使用劑量和延長使用時間使內(nèi)膜增長。但是目前，最佳雌激素應用時長和劑量需要進一步研究，且超生理劑量的雌激素是否影響子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局，目前還沒有確切結(jié)論。有研究表明，雌激素暴露時間控制在12～19 d，少于12 d 或超過19 d 妊娠率均會下降[10]。本中心HRT 周期雌激素的使用時間分布在10～28 d，因此本研究將1 348 個周期HRT-FET 的數(shù)據(jù)按照雌激素的使用天數(shù)分為4 組：A 組（≤12 d），B 組（13～16 d），C 組（17～20 d），D 組（＞ 20 d），探討雌激素應用天數(shù)對HRT-FET 周期妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集在昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科 從2017 年01 月 至2020 年12 月應用HRTFET 治療患者的臨床資料，根據(jù)納入及排除標準，共納入1 348 個周期。

納入標準：（1）取卵年齡≤40 歲；（2）接受FET 的患者；（3）使用HRT 周期準備內(nèi)膜；（4）HRT 方案中采用補佳樂準備內(nèi)膜；（5）每周期至少有一枚優(yōu)質(zhì)胚胎。

排除標準：（1）夫妻任何一方染色體異常；（2）子宮畸形、重度宮腔粘連等解剖異常；（3）BMI≥30 kg/m2；（4）采用降調(diào)+HRT 周期準備內(nèi)膜；（5）反復流產(chǎn)和反復種植失敗；（6）自身免疫性疾病。

1.2 方法

納入的周期根據(jù)患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前補佳樂使用天數(shù)分為4 組：A 組（≤12 d），B 組（13～16 d），C 組（17～20 d），D 組（＞ 20 d）。

1.3 HRT 周期子宮內(nèi)膜準備

對于納入研究準備進行冷凍胚胎移植的患者，在月經(jīng)周期的第2～4 天予以口服戊酸雌二醇片（4～6 mg/d，補佳樂，拜耳，德國），連續(xù)口服10 d 后，檢測患者性激素水平，并通過陰道超聲檢查子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)患者的雌激素及子宮內(nèi)膜厚度對補佳樂用量進行調(diào)整。當子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm 時，給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜并安排凍融胚胎移植時間。所有胚胎均采用玻璃化冷凍復蘇，每周期至少有一枚優(yōu)質(zhì)胚胎。移植后繼續(xù)原劑量口服補佳樂，并補充外源性孕激素進行黃體支持治療。

1.4 妊娠結(jié)局判定

在胚胎移植后14 d 檢測血清β-人絨毛膜促性腺激 素（β-HCG），β-HCG 大 于10 U/L 為HCG 陽性；FET 后30 d 行經(jīng)陰道超聲檢查，超聲下見妊娠囊診斷為臨床妊娠；早期流產(chǎn)定義為妊娠12 周以前宮內(nèi)妊娠終止；異位妊娠為胚胎種植在子宮腔外并發(fā)育；妊娠28 周后分娩一名或多名活嬰兒則為活產(chǎn)；早產(chǎn)定義為妊娠37 周前分娩；低出生體重兒為新生兒出生體重小于10 個百分位。

1.5 比較項目

比較4 組患者的一般特征（主要包括不孕年限、取卵年齡、BMI、AMH、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日血清E2水平、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日血清孕酮水平等）和妊娠結(jié)局（包括HCG 陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、單胎早產(chǎn)率、單胎低出生體重兒率等）。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS26.0 軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，并通過單因素方差分析對多組間進行比較。分類資料采用百分率（%）表示，多組組間比較采用χ2檢驗。P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

總共分析了1 348 個周期，根據(jù)患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前補佳樂使用天數(shù)分為A 組（≤12 d，n=165 例），B 組（13～16 d，n=672 例），C 組（17～20 d，n=430 例），D 組（＞ 20，n=81 例）。

2.1 4 組基本情況的比較

A、B、C、D 4 組患者臨床特征比較，取卵年齡、不孕年限、BMI、AMH 比較均無顯著性統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05），見表1。

表1 4 組患者的基線資料（）Tab.1 Baseline characteristics of the four groups patients（）

表1 4 組患者的基線資料（）Tab.1 Baseline characteristics of the four groups patients（）

2.2 4 組移植情況的比較

A、B、C、D 4 組患者移植情況比較，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的子宮內(nèi)膜厚度、雌激素水平比較具有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），其中A 組的子宮內(nèi)膜厚度最高，其他組依次遞減，A 組的雌激素水平最低，其他組依次遞增，見表2。

表2 4 組移植情況的比較（）Tab.2 Embryo parameters of the four groups patients（）

表2 4 組移植情況的比較（）Tab.2 Embryo parameters of the four groups patients（）

*P ＜ 0.05。

2.3 4 組妊娠結(jié)局的比較

A、B、C、D 4 組妊娠結(jié)局比較，HCG 陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、單胎早產(chǎn)率、單胎低出生體重兒率比較均無顯著性差異（P＞ 0.05），見表3。

表3 4 組妊娠結(jié)局的比較（%）（1）Tab.3 Clinical outcomes of the four groups（%）（1）

3 討論

自從1984 年首例FET 成功，F(xiàn)ET 得以快速發(fā)展，并隨著胚胎冷凍保存技術的改進，目前在ART 得到廣泛的應用[10]。FET 周期妊娠結(jié)局的影響因素有很多，其中胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育的同步性是胚胎著床成功的關鍵[11]。近年來，隨著 COH 技術的完善和胚胎體外培養(yǎng)技術的改進，獲得優(yōu)質(zhì)的胚胎不再是臨床醫(yī)生的主要困擾。因此，學者們將提高胚胎種植成功的關鍵鎖定在改善子宮內(nèi)膜容受性上。FET 中內(nèi)膜準備方案是影響子宮內(nèi)膜和胚胎同步發(fā)育的重要因素。然而FET 的最佳子宮內(nèi)膜準備方案需要進一步研究。HRT 周期因方法簡單、靈活，已經(jīng)成為最常用的FET 方案[12]。在HRT 周期中，在通過大劑量補充外源性雌激素，使得子宮內(nèi)膜上雌激素受體的數(shù)量增加，內(nèi)膜的血管內(nèi)皮生長因子表達上調(diào)，促進血管生成，改善內(nèi)膜發(fā)育，從而提升胚胎種植率[13]。對于子宮內(nèi)膜薄的FET 患者，臨床上常采用超生理劑量的雌激素或延長雌激素的使用天數(shù)，使子宮內(nèi)膜能達到可移植厚度[14-16]。但HET 周期最佳雌激素水平和應用時長，目前沒有確切的結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)，A、B、C、D 4 組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的子宮內(nèi)膜厚度、雌激素水平比較具有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），其中A 組的子宮內(nèi)膜厚度最高，其他組依次遞減。A 組的雌激素水平最低，其他組依次遞增。四組患者HCG 陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、單胎早產(chǎn)率、單胎低出生體重兒率，均無顯著性差異（P＞ 0.05）。結(jié)果提示，使用HRT-FET 周期準備內(nèi)膜，對于子宮內(nèi)膜較薄的患者，或許可以延長雌激素應用時長可以改善子宮內(nèi)膜，達到與正常子宮內(nèi)膜厚度相類似的妊娠結(jié)局。Ying 等[17]通過研究接受固定雌激素劑量組和增加劑量組的妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)與固定劑量組相比，增加劑量組延長雌激素使用時間，其子宮內(nèi)膜仍較薄，但是兩組的妊娠率相似，這提示筆者是否薄型子宮內(nèi)膜的患者可以通過延長雌激素的使用時間來提高妊娠率。

適度的雌激素水平是胚胎的植入成功所必須的。但有學者發(fā)現(xiàn)，暴露于高雌激素水平下會使子宮內(nèi)膜容受性降低，降低臨床妊娠率。在超高雌激素水平狀態(tài)，子宮內(nèi)膜的血流流量減少，并抑制胚胎著床和滋養(yǎng)細胞入侵[18]。Bourdon 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，延長E2暴露會顯著降低凍融囊胚移植后的活產(chǎn)率，他們發(fā)現(xiàn)當凍融囊胚移植前的E2暴露超過28 d 時，活產(chǎn)率顯著下降。閆婭妮等[20]發(fā)現(xiàn)，使用雌激素天數(shù)超過28 d 的患者與21 d 以內(nèi)相比，臨床妊娠率明顯下降，流產(chǎn)率隨著雌激素時間的延長呈上升趨勢。在筆者的研究中，雖然四組患者HCG 陽性率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率并無統(tǒng)計學差異，但是A 組（≤12 d）和D 組（＞20 d）的HCG 陽性率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均低于B組（13～16 d）、C（17～20 d 組）2 組，而統(tǒng)計結(jié)果無顯著性差異可能與樣本量受限有關，若加大樣本量，同時考慮內(nèi)膜生長不良而取消移植的周期，可能研究結(jié)果的差異性會比較明顯[21]。

HRT-FET 周期血清E2水平是否對FET 結(jié)局有影響尚為達成共識。在自然周期中，筆者發(fā)現(xiàn)雌激素水平在促卵泡素作用下逐漸升高，并促進卵泡發(fā)育成熟，當雌激素達到200 pg/mL 以上至少50 h 促發(fā)LH 高峰誘發(fā)排卵，隨后雌激素水平開始下降[18，22]。因此，在HRT 周期中，筆者使用激素遞增方案盡可能地模擬這一生理過程，使得HRT 周期的患者血清E2濃度能夠達到自然周期的正常雌激素水平。但實際上，HRT 周期患者血清雌激素濃度通常高于自然周期雌激素的生理水平，且高血清雌激素水平對妊娠結(jié)局的影響尚未明確，雌激素應該維持在怎樣的水平仍存在爭議。在一些研究中，血清高E2水平能夠提高胚胎種植率，但Kong 等[22]研究卻提示，高水平E2可能與胚胎移植失敗有關，當血清E2水平大于300 pg/mL 時，患者臨床妊娠率顯著下降，當血清E2水平大于1 400 pg/mL 與臨床妊娠率無相關性。然而，在筆者的研究中，四組患者的內(nèi)膜轉(zhuǎn)換日的雌激素水平不同其妊娠結(jié)局沒有差異，Boynukalin 等[24]的研究結(jié)果也證實這一點。目前大多數(shù)研究并沒有得出HRT 周期是否存在雌激素水平的上限的確切結(jié)論。但是結(jié)合既往的研究，過高的血清雌激素水平可能影響子宮內(nèi)膜的容受性和胎盤形成，從而導致胚胎種植率下降和不良產(chǎn)科結(jié)局。在筆者的研究中，D 組（＞20 d）的單胎早產(chǎn)率和單胎低出生兒體重率均高于其他3 組，雖然結(jié)果并無統(tǒng)計學差異。所以作者合理推測，在HRT-FET 周期，過高的雌激素水平可能對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生不利影響，降低臨床妊娠率，增加不良產(chǎn)科結(jié)局風險，因此，超生理劑量的雌激素水平可能成為不良妊娠結(jié)局的一個預測指標[23]。當然，其預測結(jié)果的準確性還需要大樣本研究進行驗證。

綜上所述，延長雌激素應用天數(shù)，在一定的成度上可以增加內(nèi)膜增長不良患者的子宮內(nèi)膜厚度，達到和正常內(nèi)膜患者相似的妊娠結(jié)局，但是過長時間的雌激素暴露，可能降低子宮內(nèi)膜的容受性，還會增加不良產(chǎn)科結(jié)局風險。此外，還加大了患者的經(jīng)濟負擔。最后，過長時間的雌激素暴露是否造成不良的妊娠結(jié)局，還需要大樣本前瞻性研究進一步驗證。