基于TCGA 數據庫篩選宮頸鱗狀細胞癌潛在的預后標志物及驗證

顏怡君 ，楊宏英 ，張紅平 ，李 政 ，賈 岳 ，趙 敏

（1）云南大學附屬醫院核醫學科，云南 昆明 650021;2）昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院婦科，云南 昆明 650118;3）醫務部，云南 昆明 650118）

宮頸癌是發病率較高的常見婦科癌癥之一，也是全球第四大導致女性死亡的癌癥[1]，僅次于乳腺癌、結直腸癌和肺癌。宮頸癌發病逐漸年輕化[2]，而且容易發生淋巴節轉移或蔓延，導致患者預后不佳[3-4]。據統計，全球每年新增病例604 127 例，死亡人數超過 341 831 例[5]，其中超過90%的死亡病例發生在包括中國在內的發展中國家。據世界衛生組織估計，從2015 年到2030 年，全世界宮頸癌的死亡率將增加約22%。對于包括中國在內的發展中國家來說，宮頸癌仍是一個重要的公共衛生問題。宮頸癌的主要病理類型85%以上是宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC），宮頸脫落細胞篩查、HPV 檢測和陰道鏡的聯合應用對CESC 癌前病變檢出率較高，同時隨著HPV 疫苗的普及，可有效降低患CESC 的風險，但昂貴的檢查費用和宮頸癌預防的普及教育不足，導致包括中國在內的發展中國家婦女未能廣泛獲得篩查和疫苗接種的機會，同時CESC 的早期癥狀并不典型以及現有診斷方法的局限性，因而超過50%的患者就診時已伴局部浸潤或淋巴轉移，5 a 生存率不足17%。在當今個性化醫療的時代，為實現對CESC 患者的精準治療，手術后第一時間準確預測患者的預后轉歸情況尤為重要。因此，臨床上迫切需要尋找能夠準確預測CESC 患者預后的特異性標志物，以便能通過個性化的治療和隨訪方案來改善患者預后。

miRNA 是一類具有調節功能的單鏈非編碼RNA，其長度為19～25 個核苷酸，通過與靶基因mRNA 的3’端非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）結合[6]，來降解某些特定基因或抑制其表達，從而影響蛋白水平的表達或功能。miRNA可以調節約 60% 的蛋白質編碼基因，因此被稱為人類基因組的“主調節劑”[7]。miRNA 與腫瘤增殖、侵襲、轉移、腫瘤細胞的生長和凋亡有關[8]，已被鑒定為一種有效的腫瘤抑制因子/啟動子（TsmiRs/Onco-miRs），具有成為生物標志物的潛力。

本研究利用TCGA 公共數據庫中CESC 的miRNAs 表達數據及相關臨床數據，通過生物信息學方法構建了一個由4 個miRNAs（miR-505-5p、miR-142-3p、miR-532-5p、miR-218-1-3p）組成的預后風險模型，在CESC 組織中驗證后顯示miR-505-5p 在CESC 組織中的表達顯著低于癌旁組織，同時通過細胞實驗發現miR-505-5p 與CESC 細胞增殖、遷移和凋亡密切相關。進一步預測并初步驗證了TBL1XR1 作為miR-505-5p 靶基因的可能性，為miR-505-5p 作為CESC 的預后標記物及探索CESC 發生的潛在分子機制提供一定的依據。

1 資料與方法

1.1 篩選CESC 中差異表達的miRNAs

從TCGA 數據庫（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載255 例CESC 組織和2 例癌旁正常組織的miRNAs 測序信息和相應臨床數據，將miRNAs 表達量在癌與癌旁正常組織相差2 倍以上（|logFC∣ ＞ 1），校正后P值 ＜0.05（FDR ＜ 0.05）作為過濾條件，利用R 語言中的edgeR 包對miRNAs 的表達進行差異分析，繪制差異表達miRNAs 的火山圖；利用pheatmap 包，選擇上調和下調最顯著的20 個miRNAs，繪制熱圖。

1.2 CESC 預后風險模型的構建

對差異表達的miRNAs 與生存時間的關系使用Kaplan-Meier 生存分析，根據P＜ 0.05，得到與生存相關的miRNAs，定義每個miRNA 的表達中位值，分為高低表達組，并繪制生存曲線。結合患者的生存時間，對上述得到與生存相關的miRNAs 進行單因素COX 分析，找出預后相關的miRNAs。比較每個miRNA 與生存時間的關系，計算每個miRNA 與CESC 患者生存的風險比（hazardratio，HR）和P值，以P＜ 0.05 的標準篩選出與CESC 患者預后顯著相關的miRNAs。單因素COX 分析發現5 個miRNAs 與生存顯著相關，進一步對這5 個miRNAs 進行多因素COX 分析，利用R 軟件中的caret 包對所有樣本等分為訓練組（Train 組）和驗證組（Test 組），對5 個miRNAs進行隨機組合，最終發現4 個miRNAs 構建的多因素COX 風險預后模型在驗證組中準確度最高。

1.3 風險預后模型評價

根據Train 組構建多因素Cox 回歸分析的結果及風險系數（coef），計算基于miRNA 表達量的風險評分（risk score），計算公式為：風險評分（risk score）=風險基因1 的表達量×coef1＋風險基因2 的表達量×coef2+...＋風險基因n 的表達量×coefn（coef 為風險系數）；對Train 組和Test組的每個樣品進行風險評分，依據Train 組風險評分的中位數將所有樣本分為高風險組和低風險組。利用R 軟件中survival 包分別繪制Train 組、Test 組及所有樣本的風險生存曲線，比較高低風險組的生存差異；利用R 軟件中的survival ROC包繪制構建模型的ROC 曲線，用于評價模型預測患者預后的準確性。

1.4 樣本收集

選取2020 年9 月至2021 年5 月在昆明醫科大學第三附屬醫院就診，且病理確診為宮頸鱗狀細胞癌的患者作為研究對象，于術中留取宮頸鱗狀細胞癌組織及癌旁組織（癌旁組織距癌組織 ＞ 2 cm）各21 份，立即放入裝有RNA 保存溶液（RNA SAVE）的耐超低溫的凍存管中，后轉存到-80 ℃冰箱中保存。本研究獲得了昆明醫科大學第三附屬醫院倫理委員會的批準，所有患者均簽訂了知情同意書。

1.5 細胞、主要試劑與儀器

人子宮頸鱗癌細胞（SiHa）來自美國ATCC，由武漢普諾賽生命科技有限公司復蘇后保存使用。FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 逆轉錄試劑盒購自北京TIANGEN，Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit、Ribo FECT CP Transfection Kit 轉染試劑盒、miR-505-5p 及U6 引物均購自廣州銳博生物科技有限公司，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液購自碧云天生物，CCK-8 試劑盒購自上海東仁化學，凋亡試劑盒購自上海七海復泰生物，DMEM 基礎培養基購自美國Gibco 公司，TBL1XR1 抗體購自北京Bioss，GAPDH 抗體購自上海Abmart。

1.6 實驗方法

1.6.1 RT-PCR 檢測CESC 組織中4 個miRNAs的表達將21 例CESC 組織和21 例癌旁組織分別作為實驗組和對照組，液氮研磨20 mg 組織后，采用TRIZOL 提取總RNA，并在ND-1000 型紫外分光光度計中測RNA 的濃度，A260/280 比值在1.8～2.0 者可用于后續實驗，并根據RNA 濃度計算RT-PCR 反應體系中所需總RNA 的體積。按照逆轉錄試劑盒說明將樣本中提取的RNA 逆轉錄為cDNA，在羅氏LightCycle 96 實時熒光定量PCR 儀中按照RT-PCR 說明書進行擴增反應，反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共進行40～45 個循環，采用U6 作為內參基因，每個樣本均設3 個復孔。反應結束，做Ct 值分析。實驗結果以2-△△Ct法即相對表達量來表示，2-△△Ct==2^-[（Ct 實驗組目的基因-Ct 實驗組內參基因）-（Ct 對照組目的基因-Ct 對照組內參基因）]。

1.6.2 細胞培養及轉染將復蘇后的SiHa 細胞接種至含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、1%谷氨酰胺的DMEM 培養基中，并放入5%CO2，37℃的培養箱中培養。取對數期生長的細胞用0.25%胰酶消化收集細胞，將細胞接種至不同的孔板中（6 孔板、12 孔板、96 孔板），至細胞培養至融合度60%左右時，按照轉染試劑盒Ribo FECT CP Transfection Kit 說明書轉染mimics NC及miR-505-5p mimics，6 孔板于轉染24 h 后用于PCR 檢測、WB 檢測及流式檢測細胞凋亡，12孔板用于做劃痕實驗，96 孔板于轉染24 h 后進行CCK8 檢測。以SiHa 細胞正常培養和轉染mimics NC 作為對照組，轉染miR-505-5p mimics作為過表達組，再次采用RT-PCR 對各組細胞中miR-505-5p 的表達情況進行檢測，方法同1.6.1。

1.6.3 CCK8 法檢測3 組細胞增殖于轉染24 h后去除培養板中的細胞上清液，設置空白對照孔，每孔加入100 μL 基礎培養基；向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，放回培養箱中避光孵育2 h，用酶標儀在450 nm 處檢測各孔的OD 值；按以下公式計算細胞活力：細胞活力%=（實驗孔OD-空白孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。實驗重復3 次。

1.6.4 細胞劃痕實驗于轉染后加入0.25%胰酶消化并收集3 組細胞，調整細胞濃度至1.0×105個/mL，接種至新的12 孔板中，每組3 孔重復。過夜培養至融合度95%時，用10 μL 槍頭橫豎劃兩條線，基礎培養基洗一次，加入完全培養基，0 h、12 h、24 h、48 h 時間點拍照觀察，直至中間劃痕長滿為止。

1.6.5 流式細胞儀檢測3 組細胞的凋亡情況于轉染后24 h 收集各組細胞，按照凋亡試劑盒說明書在流式細胞儀中檢測各組細胞的凋亡。實驗重復3 次。

1.6.6 miR-505-5p 靶基因預測使用miRDB（http://www.mirdb.org/）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/download.php）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）3 個數據庫分別進行miR-505-5p 的靶基因預測，對3 個數據庫預測出的靶基因取交集，設置過濾條件為P＜ 0.01，進行GO（GeneOntology，基因本體論）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）功能及通路的富集分析。通過生物信息學的方法分析靶基因在TCGA 數據庫CESC 組織中的表達情況，為了進一步縮小研究范圍，選擇TCGA 數據庫中CESC 組織和癌旁組織差異表達2 倍以上的靶基因作為研究對象。經預測分析，TBL1XR1 可能是miR-505-5p 的靶基因。

1.6.7 RT-PCR 檢測 miR-505-5p 對 TBL1XR1RNA 表達水平的影響 取轉染mimics NC 及miR-505-5p mimics 24 h 后的2 組細胞，采用TRIZOL 提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA 后按照PCR 擴增試劑盒說明書進行擴增，以GAPDH 作為內參，GAPDH 上游引物（序列：TTGCCCTCAACGACCACTTT），GAPDH 下游引物（序列：TGGTCCAGGGGTCTTACTCC），TBL1XR1上游引物（序列：AAGTGCTGGAGTAGACAAG），TBL1XR1 下游引物（序列：AATGCTGGTGCT GAATGA），反應體系包括Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上游引物 0.25 μL、下游引物0.25 μL、cDNA 模板1.0 μL、Nuclease-Free Water 3.5 μL，反應條件為95 ℃預變性10 min，95℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，進行40～45 個循環，每個樣本均設3 個復孔，通過2-△△Ct法分析TBL1XR1 的相對表達量。

1.6.8 蛋白印跡法檢測miR-505-5p 對TBL1XR1蛋白水平的影響取轉染mimics NC 及miR-505-5p mimics 24 h 后的2 組細胞，加入RIPA 裂解液冰浴上裂解，離心后，使用超微量分光光度計，測量每個樣本蛋白濃度。根據各個樣本蛋白濃度，調整各樣本上樣體積，保證每個樣品的蛋白上樣量均為30 μg，進行SDS-PAGE 電泳，反應結束后，使用濕轉法將蛋白質樣品轉至PVDF 膜，將PVDF 膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫封閉1 h，TBST 漂洗后加入TBL1XR1 抗體（1∶1 000）4℃冰箱過夜，取出后TBST 緩沖液漂洗，加入酶標山羊抗小鼠抗體（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，ECL 顯色并平放在凝膠成像儀里采集圖像。每個樣本重復3 次。

1.7 統計學處理

采用 SPSS26.0 軟件及Graph prism 對數據進行統計分析，組間比較采用Mann-Whitney U 秩和檢驗或t檢驗，3 組間比較采用單因素方差分析來比較組間差異，采用Pearson 或Spearman 相關法來檢驗miR-505-5p 相對表達量與宮頸癌患者各臨床資料間的相關性。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異miRNA 的篩選

相比于正常組織，在CESC 組織中共有115個差異表達的miRNAs（上調39 個，下調76 個），繪制火山圖（圖1），并選擇上調與下調最顯著的前20 個miRNAs 繪制熱圖（圖2）。圖中紅色表示該基因在CESC 組織中的表達較正常宮頸組織上調；綠色表示該基因在CESC 組織中的表達較正常宮頸組織下調。

圖1 CESC 中115 個差異表達的miRNAs 火山圖Fig.1 Volcano map of 115 differentially expressed miRNAs in CESC heatmap

圖2 CESC 組織中差異表達最顯著的前20 個miRNAs 熱圖Fig.2 Heat map of the top 20 miRNAs with the most significant differential expression in CESC tissues

2.2 CESC 預后風險模型的構建

分析115 個差異表達miRNAs 與生存時間的關系，使用Kaplan-Meier 生存分析，得到9 個與CESC 患者生存相關的miRNAs（P＜ 0.05）:hsa-miR-101-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-145-5p、hsamiR-200c-3p、hsa-miR-218-1-3p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-3613-5p，并分別繪制其生存曲線（圖3A-I），紅色代表miRNA 高表達組，藍色代表miRNA 低表達組。

圖3 9 個與CESC 患者生存相關miRNAs 的生存曲線Fig.3 Survival curves of 9 miRNAs related to CESC

對9 個與生存相關的miRNAs 進行單因素及多因素Cox 回歸分析，最后得到由4 個miRNAs（hsa-miR-505-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-218-1-3p）組成的風險預后模型，該模型在驗證組中準確度最高，4 個miRNAs 的風險系數均小于零，提示這4 個miRNAs 是患者預后的保護因素，其表達量與生存時間正相關，見表1。

表1 多因素COX 回歸分析Tab.1 Multivariate COX regression analysis

2.3 風險評分方程的建立及生存曲線的繪制

根據上述多因素COX 分析得到的4 個miRNAs及風險系數，得到風險評分方程risk score=-0.41*hsa-miR-505-5p 表達量-0.48* hsa-miR-142-3p 表達量-0.81* hsa-miR-532-5p 表達量-0.48* hsa-miR-218-1-3p 表達量。根據此方程，計算每位宮頸鱗狀細胞癌患者的risk score 數值，根據Train 組risk score 數值的中位值，將CESC患者分為高風險評分組和低風險評分組，并將此模型運用到Test 組和所有樣本中進行驗證。利用R 軟件中的survival 包繪制風險生存曲線，比較高低風險組的生存差異，紅色代表高風險，藍色代表低風險。Train 組、Test 組和所有樣本的生存曲線（圖4A、4B、4C）均顯示，高風險組生存率明顯低于低風險組（P＜ 0.05），模型準確。

圖4 Train 組、Test 組及所有樣本的生存曲線Fig.4 Survival curves of Train group，Test group and all samples

2.4 風險預后模型的評價

利用R 中的survival ROC 包分別繪制Train組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線（圖5A、B、C），用以評價模型的準確性。Train 組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線顯示，模型預測CESC 患者預后的AUC 分別為0.859，0.758 及0.795，這表明模型具有良好的敏感性、特異性及一定預測能力。

圖5 Train 組、Test 組及所有樣本的ROC 曲線Fig.5 ROC curves of Train group，Test group and all samples

2.5 CESC 患者腫瘤組織及癌旁組織中預后風險模型中4 個miRNAs 的表達

CESC 患者腫瘤組織及癌旁組織中4 個miRNAs 的相對表達量結果顯示：miR-142-3p、miR-532-5p、miR-218-1-3p 在CESC 腫瘤組織及癌旁組織中差異無統計學意義（表2），miR-505-5p 相對表達量分別為癌組織0.253 5（0.107 1，0.926 8）和癌旁組織0.641 7（0.143 0，5.984 8），miR-505-5p 在CESC 患者癌組織中相對表達量低于癌旁組織（Z=-1.987，P=0.047），且差異具有統計學意義，見圖6，因此選擇miR-505-5p 作為下一步研究對象。分析CESC 患者組織中miR-505-5p 相對表達量與患者各臨床資料的相關性，見表3，miR-505-5p 的相對表達量與患者的臨床分期和侵襲程度負相關（P＜ 0.05，圖7）。

表3 miR-505-5p 相對表達量與各臨床資料相關性分析Tab.3 Correlation between the relative expression of miR-505-5p and clinical data

圖6 miR-505-5p 在CESC 組織及癌旁組織中的差異表達Fig.6 Differential expression of miR-505-5p in CESC tissues and adjacent tissues

圖7 miR-505-5p 相對表達量與臨床分期、宮頸侵襲程度的相關性Fig.7 Correlation between the relative expression of Mir-505-5p and clinical stage and cervical invasion degree

2.6 3 組SiHa 細胞中miR-505-5p 相對表達量比較

RT-PCR 檢測正常培養組、轉染mimics NC組以及轉染miR-505-5p mimics 組SiHa 細胞中miR-505-5p 的相對表達量，結果顯示miR-505-5p mimics 組中SiHa 細胞的miR-505-5p 的相對表達量高于正常培養組及mimics NC 組（P＜ 0.05），見圖8。

圖8 RT-PCR 驗證轉染效率Fig.8 Transfection efficiency verified by RT-PCR

2.7 miR-505-5p 抑制SiHa 細胞的活力、遷移及促進凋亡

采用CCK8 實驗、細胞劃痕實驗及流式細胞儀分別檢測miR-505-5p 對SiHa 細胞的活力、遷移及凋亡的影響，結果顯示，與正常培養組及mimics NC 組相比，轉染miR-505-5p mimics 后SiHa 細胞活力（P＜ 0.05）及遷移能力下降，總細胞凋亡率增加（P＜ 0.05），見圖9-11，提示過表達miR-505-5p 抑制SiHa 細胞的活力、遷移能力及促進凋亡。

圖9 CCK8 檢測miR-505-5p 對SiHa 細胞增殖的影響Fig.9 Effect of miR-505-5p on the proliferation of SiHa cells detected by CCK8

圖10 劃痕實驗檢測miR-505-5p 對SiHa 細胞遷移的影響（100×）Fig.10 Effect of miR-505-5p on the migration of SiHa cells detected by scratch test（100×）

圖11 流式細胞儀檢測miR-505-5p 對SiHa 細胞凋亡的影響Fig.11 Effect of miR-505-5p on apoptosis of SiHa cells detected by flow cytometry

2.8 miR-505-5p 靶基因的預測

通過miRDB、miRTarBase、TargetScan3 個數據庫分別進行miR-505-5p 的靶基因預測，對三個數據庫預測出的靶基因取交集，共有14 個共同靶基因，如圖12。為闡釋14 個靶基因的功能，進行了GO 和KEGG 功能及通路的富集分析，結果顯示14 個靶基因主要參與了細胞信號轉導及細胞周期調控的相關信號通路，見圖13。同時分析靶基因在TCGA 數據庫CESC 組織中的表達狀態可知（如表4），TBL1XR1 在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達量是癌旁組織2.046 倍，因此選擇TBL1XR1 作為目標靶基因。

表4 TCGA 數據庫CESC 組織中靶基因的表達Tab.4 Expression of target genes in CESC tissues from TCGA database

圖12 3 個數據庫中miR-505-5p 靶基因預測結果Fig.12 Prediction results of miR-505-5p target genes in three databases

圖13 14 個靶基因GO 及KEGG 通路富集Fig.13 Enrichment of GO and KEGG pathways of 14 target genes

2.9 過表達miR-505-5p 抑制TBL1XR1 RNA及蛋白的表達

采用RT-PCR 及蛋白印跡法檢測miR-505-5p 對SiHa 細胞中TBL1XR1 RNA 及蛋白表達的影響，結果顯示，與mimics NC 組相比，miR-505-5p mimics 組 中SiHa 細 胞TBL1XR1 的RNA 及 蛋白水平下降（圖14A、14B，P＜ 0.05）。說明miR-505-5p 可能抑制TBL1XR1 的表達。

圖14 轉染miR-505-5p 后細胞中TBL1XRI RNA 及蛋白水平的變化Fig.14 Changes of TBL1XRI RNA and protein levels in cells transfected with miR505-5p

3 討論

從正常組織到宮頸鱗狀細胞癌的復雜過程包括輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生、原位癌和浸潤癌，是一個多階段、多基因調控異常的過程。miRNAs 在腫瘤的發生發展過程中扮演著原癌基因或抑癌基因的雙重角色[9]，可通過靶向調控各種信號通路中的靶基因來調節腫瘤發生的關鍵過程[10]。新的miRNAs 和靶基因的發現，將有助于宮頸癌的預后預測和個性化治療方案的實施。

近年來，利用生物信息學分析法篩選腫瘤預后相關的miRNAs 及其靶基因已成為取代RNA 印跡分析法、微陣列芯片等傳統方法成為一種經濟高效的分析方法，本研究采用生物信息學方法對 TCGA 數據庫中255 例宮頸鱗狀細胞癌患者組織及2 例癌旁正常組織相關miRNAs 進行差異分析，共篩選出115 個差異表達倍數在2 倍以上的miRNAs，結合患者臨床信息，通過Kaplan-Meier 生存分析、單因素COX 及多因素COX 回歸分析，構建了由4 個miRNAs 組成的預后風險模型，這4 個miRNA 分別是miR-505-5p、miR-142-3p、miR-532-5p 和miR-218-1-3p。然 而，TCGA 數據庫CESC 組織樣本主要來源于美洲白人和黑人，不排除有人種遺傳的影響，因此本研究進一步通過收集CESC 組織和癌旁組織來驗證預后風險模型中4 種miRNAs 的表達，選擇CESC 組織和癌旁組織中差異表達顯著的miR-505-5p 作為研究對象，同時探究miR-505-5p 對CESC 細胞功能的影響，結果顯示miR-505-5p在CESC 患者癌組織中較癌旁組織低表達，并與CESC 患者臨床分期和侵襲程度呈負相關；細胞功能學實驗表明，miR-505-5p 可抑制宮頸鱗狀細胞癌SiHa 細胞的增殖、遷移并促進其凋亡，提示miR-505-5p 在CESC 中發揮抑癌作用。在既往的研究中，已經報道miR-505-5p 參與調節腫瘤發生的相關細胞通路，并發揮抑癌作用。例如，在一項研究中[11]，miR-505-5p 在膀胱癌組織中顯著低表達，并通過靶向作用于Polo 樣激酶1（polo-like-kinase 1，PLK1）負向調控膀胱癌細胞的增殖和遷移；miR-505-5p[12]可抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲，并可靶向c-Myc 和β-連環蛋白（β-catenin）來抑制Wnt 信號傳導，從而阻止EMT 進程。

為進一步探究miR-505-5p 在宮頸鱗狀細胞癌中的潛在作用機制，本研究通過生物信息學分析法篩選出TBL1XR1 是miR-505-5p 的可能靶基因，人類TBL1XR1（轉導素 1X 連鎖受體蛋白1）基因位于染色體3q26.32，由18 個外顯子組成，長度為208661bp。TBL1XR1 編碼的蛋白是組成核受體輔助抑制因子（NCoR）的核心成分，可通過調節維甲酸和甲狀腺激素受體的沉默介質（SMRT）在轉錄活性中發揮關鍵作用[13]。越來越多的研究表明，TBL1XR1 可受多種miRNAs 的調控，在腫瘤中表達上調并作為腫瘤啟動子調節各種生物學過程，包括細胞增殖、遷移、腫瘤血管生成和上皮-間質轉化（EMT）[14]。例如，miR-1 178-3p[15]在肝癌組織和細胞系中表達下調，miR-1 178-3p過表達通過直接調控TBL1XR1/PI3K/Akt 通路抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，在小鼠體內降低腫瘤生長和血管生成。在肺癌[16]中，miR-34c-5p[16]可通過直接靶向TBL1XR1 抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究通過在SiHa 細胞中轉染miR-505-5p mimics 后發現，TBL1XR1 表達水平較miR-505-5p NC 組降低，Western blot 實驗表明過表達miR-505-5p 后TBL1XR1 蛋白水平降低，初步驗證了miR-505-5p 與TBL1XR1 的負向調控關系。既往研究證實TBL1XR1 可通過激活許多信號轉導途徑[17]來發揮作用，包括Notch23、Wnt-β-catenin、NF-κB 及PI3K/Akt 等，例如，在胰腺癌[18]中，TBL1XR1 的表達可激活c-Met/PI3K/Akt 信號通路以及促進EMT 表型轉化，從而誘導胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲；在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中[19]TBL1XR1 通過調節c-Met 介導的MEK 通路介導細胞的存活和增殖。TBL1XR1 作為促癌因子，其高表達被證實與許多腫瘤的不良預后和淋巴轉移有關，如胃癌[20]、原發性睪丸淋巴瘤[21]等。Wang 等[22]研究發現，TBL1XR1 的RNA 及蛋白表達水平在宮頸癌細胞和組織中顯著上調，TBL1XR1 通過調節NF-κB 和 Wnt-β-catenin 通路來誘導 EMT，與宮頸癌患者的臨床分期、生存時間和復發顯著相關，并可作為宮頸癌患者的獨立預后因素。然而目前尚未報道在宮頸癌中miR-505-5p 與TBL1XR1 的相互作用。

綜上所述，本研究初步探究了miR-505-5p在CESC 中可能通過靶向TBL1XR1 發揮抑癌作用，僅是為miR-505-5p 作為CESC 的預后標記物提供一定的依據，同時為CESC 新的靶點的發現提供思路。本研究仍存在許多不足之處，首先，本研究僅在CESC 組織中驗證了miR-505-5p 的表達，其是否能作為CESC 無創預后標記物還應在患者體液中驗證，并可進一步通過隨訪CESC 患者生存時間和狀態來證實。其次，miR-505-5p與TBLIXRI 的靶向關系也只是初步預測，還需通過熒光素酶報告基因、TBL1XR1 敲低回復等實驗來證實二者的靶向關系。