云南省結核分枝桿菌分子特征和傳播相關因素分析

陳連勇，楊 星，茹浩浩，陳 濤，閆雙群，許 琳

（云南省疾病預防控制中心結核病防治所，云南 昆明 650022）

結核病是由結核分枝桿菌引起的的一種古老的慢性傳染性疾病，WHO 2021 年報告顯示[1]2020 年全球新發結核病患者990 萬例，結核病是導致死亡的主要原因之一，嚴重危害了群眾身體健康和經濟社會的發展。隨著科學技術的發展，分子生物學技術在結核病的診斷、流行病學調查方面顯示了獨特作用。通過對結核分枝桿菌的傳播動力學、來源和傳播的深入了解，增強了筆者對結核流行病學的理解，有助于有效預防和控制結核病。本研究采用Spoligotyping 和MIRU-VNTR技術，對來源于云南省耐藥監測點的結核分枝桿菌開展基因分型，以了解云南省MTB 的分子特征、傳播及相關影響因素。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

846 株結核分枝桿菌為2016 年1 月至2019年12 月期間，云南省32 個耐藥監測點從就診中發現的涂陽肺結核病患者，收集其痰標本并分離培養后獲得。同時以國家結核病參比實驗室提供的結核桿菌標準株（H37Rv）作為對照。

1.2 表型藥物敏感性試驗

采用比例法，具體試驗操作參照人衛版《結核病實驗室檢驗規程》[2]，藥敏試驗的6 種抗結核藥物分別為異煙肼（INH）、鏈霉素（SM）、利福平（RFP）、卡那霉素（KM）、氧氟沙星（OFX）和乙胺丁醇（EMB），培養基中藥物終濃度分別為0.2 μg/mL、4 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、2 μg/mL和2 μg/mL。同時以H37Rv 作為藥敏試驗的對照進行質量控制。

1.3 DNA 模板制備

用標準接種環均勻刮取1 環改良羅氏培養基斜面上生長良好的新鮮菌株，重懸于300 μL TE 中，95℃恒溫金屬浴20 min 滅活，然后使用Lab-Aid 824 結核分枝桿菌核酸提取Maxi 試劑盒及Lab-Aid 824 核酸提取儀，根據操作說明提取DNA 作為模板備用。

1.4 Spoligotyping 分型

采用熒光PCR 熔解曲線技術（McSpoligotyping）進行Spoligotyping 基因分型，每個樣本分為3 個反應體系（A/B/C），每個PCR 反應體系為25 μL，分別含McSpoligotyping PCR Mix 19.75 μL（A/B/C），McSpoligotyping 酶混合液0.25 μL，DNA 模板5 μL。PCR 反應分為兩個程序，（1）擴增程序：50℃5 min→95℃ 10 min→（95℃ 15s→57℃ 15s→72℃15s）×50 個循環；（2）熔解程序：95℃ 1 min→35℃ 1 min→35℃～90℃ 以 0.04℃/s升溫速率的速度進行熔解分析，且在此階段采集FAM、CY5、ROX 和HEX 通道熒光信號。判讀結果按順序錄入到Excel 表中。將Spoligotyping 結果按要求格式在線導入SITVITWEB 數據庫中（http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE）進行比對，獲得Spoligotyping 分型結果等信息。

1.5 MIRU-VNTR 分型

采用國際通用的15 個MIRU-VNTR 位點進行結核分枝桿菌基因分型，15 個位點分別是：Mtub04、ETR-C、MIRU4、MIRU40、MIRU10、MIRU16、Mtub21、QUB-11b、ETR-A、Mtub30、MIRU26、MIRU31、Mtub39、QUB-26、和QUB-4156。每個PCR 反應體系的體積為20 μL，分別含19 μL PCR Mix，1 μL DNA 模板。PCR 反應條件為：95℃ 10 min→（94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃1 min）×35 個循環→72℃ 7 min。

取1.5 μL 擴增產物，在含1.2%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳。電壓85 V，120-160 分鐘，然后在凝膠成像系統下成像，根據遷移度判定擴增目的片段的的相對分子量，確定各樣本各VNTR 位點重復單元的重復數并錄入到Excel 表格中。并以H37Rv 作為對照。

利用BioNumberics 5.0 軟件對Spoligotyping和MIRU-VNTR 的數字化試驗結果開展基因分型聚類分析。具有完全相同基因型的菌株≥2 個即為成簇，用于估算近期傳播指數的成簇率采用RTIn-1 法[3]，即成簇率=（nc-c）/n，n 代表所有的結核分枝桿菌菌株數，c 代表結核分枝桿菌菌株成簇數，nc指所有成簇的菌株數。

1.6 統計學處理

采用SPSS16.0 軟件進行統計分析。計數資料采用百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗，成簇危險因素分析是將是否成簇作為因變量，將單因素分析中P＜ 0.2 的變量納入Logistic 回歸分析，計算比值比（OR）和95%可信區間（95%CI），P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本情況

846 例病例中，來自云南省16 州（市）的32個耐藥監測縣（區），16 個州（市）病例數最少的為21 例，最多的為125 例（表1）；男女比例為2.78:1；平均年齡（43.41±16.59）歲（最小年齡12 歲，最大年齡85 歲）；民族分布以漢族為主（513，60.64%），其次分別為彝族（104，12.29%）和傈僳族（44，5.20%）；小學及以下文化程度的患者的比例占57.80%；農民患者占90.07%。初治肺結核患者占到總數的88.53%（749/846）。

表1 846 株結核分枝桿菌的州市分布情況Tab.1 Distributions of 846 Mycobacterium tuberculosis by prefecture

2.2 藥敏試驗結果

846 株結核分枝桿菌中，總耐藥率為20.80%。對INH、SM、RFP、KM、OFX、EMB 6 種抗結核藥物的耐藥率依次為10.28%、9.10%、6.38%、2.48%、2.25%和1.65%，其中耐多藥（MDR）菌株有32 株，MDR 率為3.78%。

2.3 Spoligotyping 分型結果

846 株結核分枝桿菌菌株中，北京基因型有539 株，占菌株總數的63.71%，為最大的一個基因家族。非北京基因型有307 株，占菌株數的36.29%，非北京基因型主要基因家族包括T1（20.69%，175/846）、T3（4.49%，38/846）和T2（2.36%，20/846），其次還有H3（0.83%，7/846）、T2-T3（0.59%，5/846）、T5（0.47%，4/846）、MANU2（0.47%，4/846）、EAI3-IND（0.12%，1/846）和CAS1_DELHI（0.12%，1/846）等基因家族（表2）。另有42 株（4.96%）在SITVITWEB 數據庫中不存在，為本研究中新發現或未定義的Spoligotyping分型結果。

表2 846 株結核分枝桿菌Spoligotyping 分型結果Tab.2 Spoligotype of 846 Mycobacterium tuberculosis Strains

各州（市）北京基因型所占比例范圍為43.55%～82.61%，其中，迪慶州的北京基因型占比最高，達82.61%（19/23），其次為曲靖市（78.22%）和楚雄州（76.25%）；北京基因型占比最低的為西雙版納州，為47.06%（24/51），各州市北京基因型分布存在明顯的地域分布差異（χ2=159.40，P＜ 0.001）。北京基因型和非北京基因型結核分枝桿菌與耐藥無關（P＜ 0.05）

2.4 MIRU-VNTR 結果

846 株結核分枝桿菌由2 個基因群組成，共627 個基因型，包括101 個基因簇和526 個獨立基因型（圖1），101 個基因簇中，成簇菌株數為2～18 株，成簇率為25.89%。根據與Spoligotyping結果比對，第Ⅰ群均為北京基因型，539 株含379 個基因型，包括71 個基因簇和308 個獨立基因型，成簇率為29.68%。第Ⅱ群共307 株菌，為非北京基因型，占總菌株數的36.29%，含248個基因型共307 株，其中218 個獨立基因型，其余89 株成簇的菌株分為30 個基因簇，成簇率為19.22%。Ⅰ群與Ⅱ群菌株成簇率相比，差異有統計學意義（29.68 % vs 19.22%，P＜ 0.01）。

圖1 846 株結核分枝桿菌的15 MIRU-VNTR 位點聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of 15 MIRU-VNTR loci in 846 strains of Mycobacterium tuberculosis

2.5 結核近期傳播危險因素分析

以結核分枝桿菌是否成簇當作因變量，將結核病患者性別、年齡、民族、來源、耐藥情況、治療史和基因型等因素納入單因素分析（表3），然后以P＜ 0.2 作為納入標準進行Logistic 多元回歸分析，結果顯示，北京基因型及INH 敏感是結核分枝桿菌成簇的危險因素，與非北京基因型相比，北京基因型成簇的風險是其1.861 倍（P＜ 0.05，95%CI1.376～2.516）；而INH 敏感菌株成簇風險是耐藥菌株的1.869 倍（P＜ 0.05，95%CI1.129～3.094），見表4。

表3 結核分枝桿菌成簇影響的單因素分析Tab.3 Univariate Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

表4 結核分枝桿菌成簇影響的多因素分析Tab.4 Multifactorial Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

3 討論

本研究對來自云南省的846 株結核分枝桿菌應用Spoligotyping 和15 個MIRU-VNTR 位點的基因分型方法進行了分子流行病學特征分析，結果顯示，我省結核分枝桿菌北京基因型的比例為63.71%，是我省結核分枝桿菌的主要流行株，結核分枝桿菌北京基因型比例略高于既往研究結果（55.7%）[4]，與62.2%的全國平均水平及周邊省份如四川（55.7%）、廣西（60.48%）、貴州（55.13%）相近[5-7]，遠遠低于江西（78.2%）、江蘇（81.1%）等東部省份[8-9]及甘肅（87.58%）、北京（83.3%）、河南（89.8%）等北部省份[10-12]，同時，我省各州、市來源菌株北京基因型比例差異較大（43.55%～82.61%），表明我省結核分枝桿菌北京基因型分布受地域影響較大。本研究還對基因型與耐藥的相關性進行了分析，結果顯示北京基因型與結核分枝桿菌對各藥物的耐藥性以及MDR 均無相關性，這與Luo D 等[8,13-14]研究結果一致，也有研究表明北京基因型結核分枝桿菌與耐藥特別是耐多藥相關[5,15-17]，這些差異的產生可能是由于地理、社會經濟條件、HIV 或糖尿病等因素引起的[10]。

非北京基因型中，以T 家族為主（T1、T3 和T2 等），其次為MANU、H、LAM 和X 等基因型、這與全國其他地方的分布類似，但本研究中還發現了CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等基因型以及43株（5.08%）的未定義或新的Spoligotyping 基因型。EAI 是東南亞和南亞最常見的家族，也流行于北歐，并可能與輸入病例相關，在緬甸，EAI 基因型比例僅次于北京基因型[18]，而在國內僅見廣西有報道[7]；CAS 主要存在于南亞、西亞及非洲東部地區[19]，我國少見，絕大部分分布于北方地區[5]。而CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等我省既往未見報道，本次研究發現的這些基因型這些菌株均來源于邊境州、市，這可能與我省地處西南邊陲，與緬甸、越南和老撾接壤，且與境外無天然屏障，邊貿及人員交流頻繁，結核分枝桿菌基因型也表現為高度多態性。

本研究使用15 個MIRU-VNTR 位點對云南省的結核分枝桿菌基因分型，成簇率為25.89%，說明在云南省存在結核分枝桿菌的近期傳播，因此必須采取措施主動發現患者并實行切實有效的治療管理措施，控制結核病的近期傳播，并對結核病患者的密切接觸者進行篩查，而云南省近些年也加大了經費投資力度，推廣使用新診斷技術、建立示范區等措施，提高患者的發現和治療管理，這將有效地發現肺結核患者并控制結核病的近期傳播。本研究對結核分枝桿菌成簇相關影響因素分析結果顯示北京基因型及對INH 敏感結核分枝桿菌更容易成簇，這與既往研究一致[8,11,13,17,20]，這可能與北京基因型具有高毒力以及卡介苗接種等因素有關，本研究中北京基因型結核分枝桿菌成簇率顯著高于非北京基因型，這也說明了北京基因型具有更強的毒力和傳播能力。有研究表明耐藥結核病病人比敏感病例更容易成簇[15,17,20]，認為耐藥性導致治療失敗并導致患者長期保持感染性，因而更容易成簇，而在本研究中，異煙肼耐藥菌株比異煙肼敏感菌株更不容易成簇，這與Durmaz 等[21-22]研究結果一致，有動物模型顯示異煙肼耐藥可能導致結核分枝桿菌的毒力下降[22]，推測異煙肼耐藥菌株在人群中產生繼發病例的可能性下降，也有研究表明，成簇和不成簇的異煙肼耐藥菌株在異煙肼耐藥基因-katG 基因中的特定突變位點的發生率不同，傳播能力存在差異[22]，具體原因還有待今后的進一步研究。

綜上所述，云南省結核分枝桿菌基因型呈高度多態性，但北京基因型仍是主要流行株，云南省存在結核病的近期傳播，北京基因型和INH 敏感是近期傳播的影響因素，因此必須采取各種措施主動發現傳染源、規范治療和管理，使其不再具有傳染性，并及時篩查活動性結核病例的密切接觸者，以控制結核的傳播。