寧都黃雞GH 基因SNP 與雞冠性狀的關聯分析

馬荊鄂，曾成瑤，周 敏，譚玉文，朱學農，饒友生，許繼國

（南昌師范學院生物技術研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室，江西 南昌 330032）

【研究意義】寧都黃雞是江西省特優質型黃羽肉雞，具有“三黃”（喙、脛、羽）、“五紅”（冠、髯、臉、眼圈、耳葉）［1］、性早熟、體小、矮腳等特征，以及肉質鮮美、口感豐富等優點。其肌肉中的蛋白質及必需氨基酸含量、單位面積肌纖維數量等指標均優于國內多個肉雞品種［2-4］，因此深受廣大消費者喜愛，但寧都黃雞繁殖性能低，影響其產業的健康發展。雞冠性狀不僅是消費者選購禽肉產品的重要參考因素，同時冠長、冠高與產蛋量、平均蛋重等繁殖性狀有顯著相關性［5-7］。因此，對雞冠性狀進行分子標記輔助選擇，是優質肉雞選育的重要任務之一。【前人研究進展】雞冠是雞頭部的皮膚衍生物，缺乏羽毛，公雞雞冠十分發達，是其第二性征，是衡量雞性成熟的重要指標［8-9］。雞冠始于上喙的一個區域，位于前鼻突的后方，由表皮、真皮和中央層組成。表皮具有角質層和生發層，角質層位于表皮最外層，對雞冠皮下組織起保護作用，防止皮下組織受到感染［10］。雞冠是一類變異豐富且易于觀察的外觀性狀，其相關研究多從基因的角度進行遺傳分析，目前已發現一些常見冠型的改變均源自基因序列變異和異位表達［11］。研究發現，AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A基因具有調節雞冠生長發育的作用，是雞冠性狀選育的重要候選基因［12-16］。【本研究切入點】生長激素（Growth hormone，GH）基因能夠調節糖類、脂肪和蛋白質的代謝，促進機體各個組織的生長發育［17］。GH基因序列中存在多個SNP［18-19］，部分多態性位點與開產體質量、開產日齡以及生長性狀有顯著關聯性［20］。目前關于GH基因SNP 與寧都黃雞公雞雞冠性狀的關聯分析少見報道。【擬解決的關鍵問題】研究GH基因上游調控區域（5'-側翼區）和內含子1 區域序列單核苷酸多態位點對寧都黃雞公雞雞冠性狀的影響，尋找地方雞種雞冠性狀選育的分子標記。選取前期篩選的GH基因SNP，采用SAS 軟件分析雞冠性狀關聯的SNP，解析優勢基因型，為寧都黃雞雞冠性狀的分子輔助選育積累理論基礎，進而為改良寧都黃雞的繁殖性狀奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的499 只4～16 周齡寧都黃雞公雞的雞冠表型數據來源于實驗室前期記錄［3］，包括7 個周齡（分別為4、6、8、10、14、16 周齡）的冠高、冠長、冠厚、肉垂長、肉垂厚和冠齒數 6 個雞冠性狀指標。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因頻率和基因型頻率 假設基因座兩個等位基因分別為A、a，基因型為AA、Aa、aa，則基因頻率（p、q）、基因型頻率（PAA、PAa、Paa）計算公式如下：

式中，n表示該基因型個體數。

1.2.2 Hardy-weinberg 平衡狀態檢驗 對處于Hardy-weinberg 平衡狀態下的群體，可以通過χ2適合性檢驗判定。

式中，Ei為理論期望值，Oi為實際觀察值，n為等位基因數。

1.2.3 遺傳多樣性分析 采用群體雜合度（Heterozygosity,He）、群體純合度（Homozygosity,Ho）和多態信息含量（Polymorphism information content,PIC）等衡量種群內的遺傳多樣性。

式中，Pi為任意位點上第i個等位基因頻率。

1.2.4 基因型與性狀關聯分析 以實驗室前期篩查到的GH基因5'-側翼區域和內含子1 中的45 個SNP 為雞冠性狀候選標記位點［21］，采用SAS8.1 軟件GLM 模塊，對所篩選SNP 與雞冠性狀進行關聯分析，采用的混合模型如下：

式中，Y為表型變異，μ為群體均值，G為基因型效應，D為母體效應，H為批次效應，e為殘差效應。

等位基因的加性效應是用2 個純合子離差的均值計算，加性效應=(AA-BB)/2；等位基因顯性效應是用雜合子與2 種純合子均值的離差來計算，顯性效應=AB-(AA+BB)/2。其中，AA、BB 和AB分別為基因型AA、BB和AB的表型最小二乘均值。顯著水平檢驗水平為雙側0.05，對于多重比較采用Bonferroni 法進行校正，在遺傳多態性關聯分析中，校正次數為同一基因中檢驗的不同SNP個數。

2 結果與分析

2.1 GH 基因45 個SNP 基因頻率和基因型頻率分析

分別計算GH基因5'-側翼區域和內含子1 中45 個SNP 的基因頻率、基因型頻率，以及He、Ho、PIC，結果顯示（表1），有14 個位點的PIC＞ 0.25；經χ2適應性檢驗顯示，25 個位點的χ2值沒有達到顯著水平，處于Hardy-weinberg平衡狀態。

2.2 GH 基因SNP 與雞冠性狀的相關性

采用SAS 軟件將45 個SNP 與不同雞冠性狀指標進行關聯分析，選取P＜0.05 的位點。結果（表2）表明，13 個SNP 與7 個冠高性狀指標顯著關聯，包括G1271800A、C1272225T、G1272384A、G1272611A、T1271213G、C1271211T、G1271198A、C1271195A、C1270902T、T1270805C、A1270769G、T1270451C 和G1270155A。其中，A1270769G 與7 個周齡冠高指標均顯著關聯，G1272611A 與5 個周齡冠高指標顯著關聯，T1271213G、C1270902T 分別與4個周齡冠高指標顯著關聯。5 個位點與16 周齡冠高顯著關聯，分別為C1272225T、G1272384A、G1272611A、A1270769G、T1270451C。經過Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、C1272225T 與16 周齡冠高相關性達到顯著水平。

表2 與寧都黃雞冠高顯著相關的13 個SNP 位點P 值Table 2 P value of 13 SNPs significantly related to comb height of Ningdu yellow chickens

10 個SNP 與7 個冠長性狀顯著關聯（表3），分別為C1272225T、G1272611A、C1271211T、C1270902T、A1270769G、G1270640C、T1270578C、G1270503C、T1270451C、C1270032T。其中，C1271211T 與6 個周齡冠長指標顯著關聯，C1270032T 與5 個周齡冠長指標顯著關聯，G1272611A 與5 個周齡冠長指標顯著關聯；與16 周齡冠長顯著關聯的位點為C1272225T、G1272611A、C1271211T、T1270451C。經 過Bonferroni 法校正后，G1272611A 與16 周齡冠長的相關性達到顯著水平。

表3 與寧都黃雞冠長顯著相關的10 個SNP 位點P 值Table 3 P value of 10 SNPs significantly related to comb length of Ningdu yellow chickens

表4 與寧都黃雞其他雞冠性狀顯著相關的4 個SNP 位點P 值Table 4 P value of 4 SNPs significantly related to other comb traits of Ningdu yellow chickens

位點 C1271836T 分別與8 周齡冠厚、10 周齡肉垂長顯著關聯，T1271646G 與16 周齡肉垂厚顯著關聯，C1272225T 與4 周齡冠厚顯著關聯，A1272784G與16 周齡肉垂厚顯著關聯（表 4）。經過 Bonferroni法校正后，均未達到顯著水平。此外，供試的 45個 SNP 與冠齒數性狀均無顯著關聯。

2.3 A1270769G、G1272611A 位點不同基因型與寧都黃雞冠高性狀的相關性

分析寧都黃雞公雞GH基因A1270769G、G1272611A 兩個位點不同基因型與7 個周齡冠高性狀的相關性，并計算其加性效應和顯性效應值（表5）。多重比較分析發現，A1270769G 位點的不同基因型中，AA 型個體的4、6、8、10、14、16 周齡冠高顯著低于AG 和GG 型個體，12周齡冠高的AA 型個體顯著低于AG 型個體；從位點對冠高性狀的作用方式看，該位點主要以加性方式起作用，GG 型更加有利。多重比較分析發現，G1272611A 位點的不同基因型中，GG 型個體的5 個周齡冠高均顯著高于GA 型個體。

表5 GH 基因 A1270769G、G1272611A 位點與寧都黃雞冠高（mm）性狀的相關性Table 5 Correlation between A1270769G,G1272611A in GH gene and comb height (mm) of Ningdu yellow chickens

2.4 C1271211T、G1272611A 位點不同基因型與寧都黃雞冠長性狀的相關性

分析寧都黃雞公雞GH基因C1271211T、G1272611A 兩個位點與7 個周齡冠長性狀的相關性，并計算其加性效應和顯性效應值（表6）。多重比較分析發現，C1271211T 位點的不同基因型中，CC 型個體的4、6、8、10、12、16 周齡冠長均顯著高于CT 和TT 型個體，14 周齡冠長的CC 型個體只顯著高于CT 型個體；從該位點對于4、6、8、10、12、14、16 周齡冠長的作用方式看，該位點加性方式起作用，CC 型更加有利。G1272611A 位點的不同基因型中，GG型個體的8、10、12、14、16 周齡冠長顯著高于GA 型個體。

表6 GH 基因C1271211T、G1272611A 位點與寧都黃雞冠長（mm）性狀的相關性Table 6 Correlation between C1271211T and G1272611A in GH gene and comb length (mm) of Ningdu yellow chickens

3 討論

本研究采用前期記錄的寧都黃雞公雞生長早期（4～16 周齡）的冠高、冠長、冠厚、肉垂長、肉垂厚和冠齒數性狀數據，與GH基因5'-側翼區域和內含子1 區域的SNP 進行關聯性分析，首先分析了與不同周齡雞冠性狀分別關聯的SNP，發現較少位點與雞冠厚、肉垂長和肉垂厚存在關聯性，而與冠長和冠高關聯位點較多，推測GH基因主要調控雞冠的長度和高度發育；進一步選取與5 個連續周齡冠長或冠高性狀指標均關聯且與16 周齡顯著關聯的位點進行不同基因型多重比較分析，發現3 個位點對應的優勢基因型分別為A1270769G 位點GG 基因型、C1271211T 位點CC 基因型、G1272611A 位點GG 基因型。經過Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、G1272611A 與16 周齡冠長相關性達到顯著水平。Hardy-weinberg 檢驗結果表明，A1270769G、C1271211T 均處于平衡狀態，而G1272611A 未達到平衡狀態。綜上，A1270769G 可為雞冠性狀的潛在關鍵候選分子標記。

本課題組前期研究時發現，G1272611A 位點與16 周齡肉雞的睪丸性狀存在顯著關聯［3］，表明位點G1272611A 既與雞冠性狀又與睪丸性狀顯著關聯，推測該位點為調控雞冠性狀和睪丸性狀的功能位點，對該位點不同基因型對應結合轉錄因子類型進行分析發現，GG 基因型對應的轉錄因子主要有p53、myogenin，AA 基因型對應的轉錄因子主要為En-1、C/EBPalpha［21］，雞冠性狀的優勢基因型為GG，推測轉錄因子p53、myogenin 更有利于雞冠發育通路的激活，這些位點的調控功能還有待進一步驗證。綜合分析，G1272611A 可作為地方雞繁殖性狀選育的重要候選標記，可進一步開展大群體驗證。本研究還發現，C1272225T 與12、14、16 周齡的冠高和冠長均顯著相關，且該位點與16 周齡冠高的相關性經過Bonferroni 法校正后達到顯著水平；C1271211T與6 個周齡的冠長顯著關聯，而這2 個位點也與16 周齡睪丸性狀顯著關聯，說明這些位點變異可能影響GH基因表達，進而調控雞冠和睪丸發育。

在家禽生產中，雞冠性狀是遺傳育種選育中重要的表型性狀，與重要的經濟性狀如開產性狀、睪丸重等有密切聯系［13，20］。雞冠是家禽的第二性征，生長發育受遺傳因素、激素及光照環境等影響。睪酮的分泌影響雞冠和肉垂的發育［22］，其與雞冠表皮層和真皮層的受體結合影響雞冠發育。雞冠的的生長狀況在一定程度上反映雞的性功能是否優良［13，23-24］。韋金兌［25］發現清遠麻雞和廣西麻雞各冠型各日齡公雞的冠高、冠長和肉垂長之間均呈較高程度正相關，相關系數在0.498～0.763 之間。肖俊［26］對清遠麻公雞性早熟進行研究，發現雞冠和睪丸的生長發育有很大的關聯性。周敏等［3］、王琨等［9］和姬杰菲等［27］的研究驗證了性成熟前雞冠與公雞睪丸性狀、母雞開產性狀具有較強的相關性。通過這些結果推測，以冠高或冠長為參數進行分子選育時可達到改良雞繁殖性能性狀的效果。而本研究發現的G1272611A 位點與冠高、冠長性狀、睪丸性狀均顯著關聯，進一步體現了雞冠、睪丸性狀的相關性，可能是因為雞冠、睪丸的發育過程受到同一基因的調控。雞冠是一種復雜性狀，由多基因共同調控，目前已知雞冠性狀候選基因有AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A等［12-17］，GH基因序列變異關聯雞冠性狀的挖掘將為解析雞冠性狀的多基因調控網絡提供新的參考。

4 結論

GH基因可作為調控雞冠長度和高度發育的重要候選基因，位于該基因5'-側翼的G1272611A 位點及位于內含子1 區域的C1271211T、A1270769G位點與寧都黃雞冠長或冠高性狀顯著關聯。A1270769G、G1272611A 均 對8、10、12、14、16周齡冠高性狀指標的影響達到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個位點可作為冠高性狀的分子輔助選育候選分子標記；G1272611A、C1271211T 均對8、10、12、14、16 周齡冠長性狀的影響達到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個位點可作為冠長性狀的分子輔助選育候選分子標記。G1272611A 位點與5 個連續周齡冠長或冠高性狀指標均關聯，可作為調控雞冠性狀的候選分子標記。