羅氏沼蝦Doublesex 基因的原核表達與蛋白純化

王瑞睿，馬克異

（1.上海海洋大學 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306；3.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）為 節肢動物門（Arthropoda）十足目（Decapoda）長臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium）重要的淡水養殖蝦類，具有較高的經濟價值［1］。羅氏沼蝦雄性個體顯著大于雌性個體，展現出典型的性別二態性。對其性別調控機制的研究將有利于促進甲殼動物性控機制的解析。同時，對羅氏沼蝦的性控育種發展和產業價值的提升也具有深遠的影響。【前人研究進展】在遺傳性別決定（Genetic sex determination）的過程中，性別決定與分化通常由多基因調控。在脊椎動物中發現了一系列參與性別決定與分化的關鍵基因［2-5］。與之類似，在無脊椎動物中，不同物種間性別決定與分化的調控關鍵基因也大不相同。例如，果蠅（Drosophila melanogaster）中關鍵的性控基因有Sxl和Dsx［6］，而線蟲中（Caenorhabditis elegans）則是Xol-1和Her-1等基因［7］。目前，在羅氏沼蝦中也發現了一些性別決定與分化相關基因［8-9］，表明甲殼動物羅氏沼蝦也存在類似的基因調控性別決定與分化機制。然而，甲殼動物促雄腺作為雄性個體特有的內分泌器官，也具有影響性別分化的功能。因此，甲殼動物的性別決定與分化機制可能更復雜［10-11］。Dmrt-like［9］和Dsx（Doublesex）［6］等基因均屬于一個大基因家族，即Dmrt基因家族，該家族由果蠅Dsx同源基因和線蟲Mab-3同源基因組成。作為轉錄因子，該基因家族的主要特征是其所編碼的蛋白質均含有保守且富含半胱氨酸的Doublesex/Mab-3 結構域（DM 結構域）［12-13］。Dmrt基因家族在魚類、昆蟲類以及甲殼類等動物中均有發現［14-16］，而其中Dsx被認為是Dmrt基因家族中作為性別決定級聯通路中參與調控性別決定與分化的末端節點基因［17-18］。目前，蝦蟹類已有轉錄因子Dsx的克隆和表達分析的報道［19-23］，且中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的IAG啟動子區域存在轉錄因子Dsx結合的順式作用元件，表明甲殼動物性別決定與分化相關基因IAG的表達可能受Dsx的調控［21］。【本研究切入點】目前，對羅氏沼蝦性別決定與分化機制的研究，主要集中在IAG和Dmrt-like基因的功能方面，有關羅氏沼蝦Dsx（命名為MrDsx）作用機制及調控網絡的研究仍未見報道。除DM 結構域外，不同物種的Dsx 蛋白在其他區域的序列保守性較低。因此，有必要對MrDsx進行單獨研究，以探明其是否影響羅氏沼蝦IAG的表達從而發揮性別決定與分化的調控作用。大量研究表明，在大腸桿菌中誘導原核重組蛋白表達，是研究蛋白特征及功能的一種重要方法。【擬解決的關鍵問題】基于前期獲得的羅氏沼蝦轉錄組數據，通過特異性引物進行PCR 擴增，克隆獲得MrDsx的開放閱讀框ORF 序列。構建羅氏沼蝦MrDsx基因的原核表達載體，為羅氏沼蝦MrDsx后續的抗體制備、蛋白質功能研究和互作蛋白的篩選奠定基礎，也為進一步研究MrDsx在羅氏沼蝦性別決定與分化中的作用機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年3—5 月在上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室進行，試驗使用的菌種大腸桿菌DH 5α 和BL 21（DE3）為本實驗室保存。T4 DNA 連接酶和pGEM-T 載體購自Promega 生物技術有限公司（北京）；pET-32a（+）質粒保存于上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室；質粒小提試劑盒購自Tiangen 生化科技有限公司（北京）；蛋白Marker 購自南京海利克斯信息技術有限公司；Hind III 和XhoI 內切酶購自TaKaRa 公司（大連）；LB 固體、液體培養基、IPTG 和X-gal 購自Sangon Biotech 公司（上海）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 通過本實驗之前的轉錄組數據庫（未發表）獲得了羅氏沼蝦MrDsx的ORF 序列，利用Primer 3.0 在線設計MrDsx的特異性引物組，包括Dsx-F：CCCAAGCTTGGA TGTATGAAGAGGGAGAATACG（下劃線為Hind III 酶切位點，斜體為保護堿基）和Dsx-R：CCGCTCGAGAAGTTGATGTTTCATTGACTTC（下劃線為XhoI 酶切位點，斜體為保護堿基）。

1.2.2MrDsx原核表達載體的構建 以保存的羅氏沼蝦性腺cDNA 為模板，利用MrDsx基因特異性引物進行PCR 擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；回收PCR 產物，連接 pGEM-T 載體并轉化大腸桿菌DH 5α；將擴大培養的陽性克隆提取質粒后，送至上海Sangon Biotech 公司測序鑒定。使用Hind III和XhoI 內切酶對鑒定的陽性重組pGEM-T 質粒和pET-32a（+）空質粒分別進行雙酶切，并經電泳檢測。膠回收上述目的基因及線性化載體pET-32a（+），4 ℃連接后轉化感受態細胞DH 5α。經測序鑒定后命名為重組質粒pET-32a-MrDsx。

1.2.3 重組質粒pET-32a-MrDsx的原核表達 將提取的重組質粒pET-32a-MrDsx轉化大腸桿菌BL 21（DE3）后，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養基上，37 ℃培養過夜。挑取陽性菌落于含有氨芐青霉素的LB 液體培養基中擴大培養；之后，按1：200 轉接到LB 液體培養基培養至對數期（OD ≈ 0.7），分別加入不同濃度的IPTG進行誘導，37 ℃誘導6 h。誘導結束后將菌體進行超聲破碎，分別收集裂解后的菌體上清液和菌體沉淀。同時，將部分菌體沉淀用8 mol/L 尿素進行溶解，之后進行SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍染色，以確定蛋白表達量及純度。

1.2.4 重組蛋白pET-32a-MrDsx的純化及Western blot免疫印跡分析 使用蛋白純化試劑盒（MagneHis?Protein Purification System，Promega），具體純化步驟如下：洗滌緩沖液和洗脫緩沖液分別加入8 mol/L 尿素，混勻備用；向上述未純化的粗蛋白溶液中加入500 mmol/L NaCl，隨后加入適量Ni 混勻并靜置30 min；放入磁力吸附架使結合了重組蛋白的Ni 被吸附在管壁，移除上清；加入洗滌緩沖液充分洗滌Ni，放入磁力吸附架，移除上清液，重復3 次；加入洗脫緩沖液，使洗脫緩沖液與Ni混勻，靜置10 min后放入磁力吸附架，收集上清液，即純化后的重組蛋白溶液，吸取部分純化后的蛋白溶液進行SDS-PAGE，檢測pET-32a-MrDsx 蛋白的純化結果；將重組蛋白加入到透析袋中進行透析，透析結束后分裝到2 mL 的收集管中，超低溫保存備用。Western blot 免疫印跡方法參照之前的研究［24］，用以鑒定重組蛋白pET-32a-MrDsx的表達特征。

1.2.5 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的質譜分析 將純化后的重組蛋白pET-32a-MrDsx 送至上海中科新生命生物科技有限公司，使用QE 質譜儀進行質譜分析。利用胰蛋白酶對重組蛋白進行消化，然后使用LCMSMS 和MASCOT 等質譜相關軟件對蛋白數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 MrDsx 基因PCR 擴增結果

PCR 產物的電泳檢測結果顯示，在660 bp 附近出現單一DNA 的特異性條帶（圖1）。該DNA條帶大小與預期目的基因大小相符。PCR 產物連接pGEM-T 載體、轉化大腸桿菌DH 5α、測序結果（圖2）經比對后與目的序列一致，表明以羅氏沼蝦性腺cDNA 為模板，已成功獲得了羅氏沼蝦MrDsx基因的ORF 序列（GenBank 登錄號：OQ993218）。

圖1 MrDsx 基因的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of MrDsx gene

圖2 MrDsx 基因的ORF 序列Fig.2 ORF sequences of MrDsx gene

2.2 重組質粒pET-32a-MrDsx 的雙酶切鑒定結果

使用Hind III 和XhoI 內切酶雙酶切pET-32a-MrDsx陽性重組質粒，經電泳后，可觀察到與2.1 中PCR 鑒定結果一致的DNA 條帶以及約5 900 bp 的載體條帶。插入的片段測序比對后證實為羅氏沼蝦MrDsx基因的ORF 序列，表明重組質粒pET-32a-MrDsx構建正確（圖3）。

圖3 重組質粒pET-32a-MrDsx 的雙酶切鑒定Fig.3 Double-enzyme digestion identification of pET-32a-MrDsx recombinant plasmid

2.3 大腸桿菌的誘導表達效果

分別取超聲裂解后的菌體上清和菌體沉淀進行SDS-PAGE，結果（圖4）顯示，重組蛋白主要存在于超聲裂解后的菌體沉淀中，即重組蛋白是以包涵體的形式存在于大腸桿菌感受態細胞中。而且，只有轉化了重組質粒pET-32a-MrDsx的大腸桿菌菌株在約55 kD的位置出現蛋白條帶，而轉化了空載體pET-32a 的對照組菌株無此蛋白條帶（圖4）。本試驗所用的帶His 標簽的pET-32a 空載體表達的蛋白大小約為30 kD，預測的羅氏沼蝦MrDsx基因編碼的蛋白分子量約為25 kD，因此重組后的蛋白分子量大小約為55 kD，與SDS-PAGE 實驗結果一致，證明pET-32a-MrDsx 融合蛋白表達成功。

圖4 pET-32a-MrDsx 的原核表達Fig.4 Prokaryotic expression of pET-32a-MrDsx

2.4 IPTG 誘導濃度的確定

IPTG 誘導6 h 后，SDS-PAGE 結果顯示，在IPT G 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時，重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達量可達到峰值（圖5），此范圍內的IPTG 濃度變化并未顯著改變重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達量。因此，對于重組蛋白pET-32a-MrDsx 而言，IPTG 誘導濃度范圍可設定為0.1～0.5 mmol/L，最佳誘導濃度為0.1 mmol/L。

圖5 IPTG 濃度對pET-32a-Dsx 表達的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration on pET-32a-Dsx expression

2.5 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的純化及復性效果

對純化及復性后重組蛋白pET-32a-MrDsx 進行SDS-PAGE 電泳，結果（圖6A）顯示，在蛋白相對分子量約55 kD 處出現一條特異性蛋白條帶，其大小與預期結果相符。相比蛋白純化前，純化后的SDS-PAGE 蛋白條帶單一，無其他雜質條帶，表明重組蛋白pET-32a-MrDsx 純化成功。Western blot 結果（圖6B）顯示，重組蛋白pET-32a-MrDsx 可與鼠抗His-tag 單克隆抗體特異性結合，在蛋白相對分子量約55 kD 的位置出現單一且清晰的特異性條帶，說明純化復性后獲得了可溶性的羅氏沼蝦pET-32a-MrDsx 重組蛋白。

圖6 重組蛋白pET-32a-MrDsx 純化后的Western blot 鑒定Fig.6 Identification of purified recombinant protein pET-32a-MrDsx by Western blot

2.6 重組蛋白pET-32a-MrDsx 的質譜分析結果

質譜分析過程將重組蛋白pET-32a-MrDsx 打成肽段，通過質譜分析獲得重組蛋白pET-32a-MrDsx 的部分肽段的質荷比（圖7）。質譜分析顯示共有14 個肽段與理論的氨基酸序列相符合，匹配度達到100%，并且這些肽段共覆蓋理論序列的61.36%，再次證明羅氏沼蝦pET-32a-MrDsx重組蛋白原核表達成功。

圖7 質譜分析重組蛋白pET-32a-MrDsx 的部分肽段質荷比Fig.7 Mass-to-charge ratio of some peptides of recombinant protein pET-32a-MrDsx analyzed by mass spectrometry

3 討論

D oublesex（Dsx）是果蠅性別決定級聯通路的關鍵終末轉錄因子，通過性別特異性選擇性剪接調控下游基因的表達，進而調控性別分化方向［6］。在大型水蚤（Daphnia magna）中，Dsx基因在雄性特異性組織中表達，從而調控雄性性狀發育［25］。紅鰲螯蝦（Cherax quadricarinatus）中分離鑒定出的Dsx基因在卵巢發育的早期階段表現出較高的轉錄水平，該基因被沉默后可引起紅鰲螯蝦IAG基因表達上調，表明紅鰲螯蝦Dsx基因可能參與了其性腺分化過程［22］。類似地，在中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）和中華絨螯蟹中也分離出了Dsx基因，敲降該基因后，兩者的IAG基因的表達量均顯著下降，也表明了Dsx基因可能參與蝦蟹類的性別分化過程［20-21］。

本研究將羅氏沼蝦MrDsx基因的開放閱讀框（ORF）進行了完整克隆，成功構建pET-32a-MrDsx 原核表達載體，并表達純化了該重組蛋白。作為成熟的表達系統，原核生物大腸桿菌是目前用于異源表達重組蛋白的重要手段［26-30］。借助胞質，大腸桿菌表達系統可將外源蛋白以可溶性或非可溶性的形式表達［31］。因此，本研究使用了原核表達中普遍應用的、可被高效誘導表達的大腸桿菌BL21 菌株。大量研究表明，原核表達蛋白內部信號肽結構有利于提高蛋白可溶性，一定程度降低原核表達重組蛋白的主要形式——包涵體。羅氏沼蝦MrDsx基因所編碼的蛋白并不具有信號肽結果。因此，不具有信號肽結構可能是導致羅氏沼蝦MrDsx 重組蛋白形成包涵體的因素之一。本研究使用高濃度尿素對包涵體進行溶解。該過程降低了蛋白結構柔韌性，增強了蛋白的溶解能力；接著采用Ni 柱純化，去除了雜質菌體蛋白；最后利用透析法去除變性劑，促進蛋白折疊，使重組蛋白復性。研究表明，原核表達的蛋白表達量與IPTG 的誘導濃度息息相關。本研究中，在IPTG 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時，重組蛋白表達量達到最大值；誘導濃度大于0.5 mmol/L 時，蛋白表達量下降，說明IPTG 濃度過高對大腸桿菌的生長存在抑制作用，不利于重組蛋白pET-32a-MrDsx 的高效表達。因此，從節約試劑和降低對大腸桿菌生長的影響等方面考慮，誘導重組蛋白pET-32a-MrDsx 的最佳IPTG 濃度為0.1 mmol/L。因重組蛋白pET-32a-MrDsx 可與帶His 標簽的單克隆抗體特異結合，經Western blot 檢測后，在預測的蛋白分子量大小的位置出現了特征性的單一蛋白條帶，進一步的質譜分析也顯示該重組蛋白的氨基酸序列與預期相符合，證明該蛋白是羅氏沼蝦MrDsx基因的開放閱讀框與pET-32a 原核表達載體的重組蛋白。His 標簽在蛋白互作研究中有著廣泛的應用。本研究選擇His 標簽，不僅方便了His 標簽的單抗特異結合，也為未來利用Pull down 技術篩選與MrDsx 相互作用的重要蛋白提供了實驗基礎。

4 結論

本研究克隆了羅氏沼蝦MrDsx基團的ORF 序列，與載體pET-32a（+）連接后，構建了羅氏沼蝦MrDsx基因的原核表達載體。結果表明，利用IPTG 對陽性轉化細胞進行誘導表達，首次獲得了相對分子量約為55 kD 的羅氏沼蝦MrDsx基因的重組蛋白，且在IPTG 濃度為0.1～0.5 mmol/L 時重組蛋白pET-32a-MrDsx 的表達量達到峰值。可溶性分析顯示該重組蛋白pET-32a-MrDsx 以包涵體為主要表達形式，經高濃度尿素溶解、Ni 柱純化和透析復性后可實現活性pET-32a-MrDsx 重組蛋白的大量回收，為該基因后續的蛋白功能研究、互作蛋白的篩選，以及進一步研究MrDsx 在羅氏沼蝦性別決定與分化中的作用機制奠定了基礎。