五味苦參腸溶膠囊減輕小鼠腸道炎癥

馮碧燕

廣州市第一人民醫院，華南理工大學附屬第二醫院藥劑科（廣州 510180）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一種亞型，是一種發病機制尚未完全清楚的腸道非特異性炎癥疾病，疾病反復復發與緩解交替，結腸黏膜以連續性、彌漫性炎癥為主要特征，患者臨床癥狀主要表現為腹瀉、黏液膿血便［1］。目前臨床上常用治療UC的藥物主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質激素（激素）、生物制劑和免疫抑制劑等。激素依賴、免疫抑制劑的不良反應以及生物制劑價格昂貴等因素限制了其在臨床的應用，尋找其他腸道抗炎藥物具有重要意義［2］。五味苦參腸溶膠囊，又名復方苦參結腸溶膠囊，由苦參、地榆、青黛、白及和甘草組成，原為院內灌腸劑，可用于輕、中度活動期UC的治療［3-5］。本研究通過葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠急性結腸炎，探索五味苦參灌腸液對小鼠腸道炎癥及腸道屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）購自美國的Sigma公司。五味苦參腸溶膠囊（five-flavor sophora flavescens enteric-coated capsules，FSEC），北京中惠藥業有限公司，國藥準字Z20150002，0.4 g/例。PCR儀（東勝興業科學儀器有限公司），離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），NanoDrop微量分光光度計（美國ThermoFischer Scientific公司），生物安全柜（上海力康生物醫療科技有限公司）。

1.2 實驗動物

6～8周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性BALB/c小鼠15只，由廣東省醫學實驗動物中心提供（許可證編號：SCXK 2018-0002）。小鼠飼養在SPF級環境中，遵循晝夜循環節律，維持環境適宜的溫度和濕度，室內溫度：22～26℃；相對濕度：50%～60%。本研究動物實驗方案經廣州市第一人民醫院動物倫理委員會批準（倫理批件號：K-2019-146-01）。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠急性結腸炎及分組 15只小鼠適應性喂養1周，然后隨機分成3組，健康對照組、急性腸炎模型組和五味苦參組，每組5只小鼠。DSS誘導的小鼠腸炎的炎癥嚴重程度與DSS濃度、給藥時間和動物種系有關。用BALB/c小鼠根據此文獻構建急性結腸炎模型［6］。健康對照組小鼠（正常組）正常飼養，自由飲用滅菌礦泉水；余下2組小鼠自由飲用含3% DSS的滅菌礦泉水7天以誘導急性DSS腸炎模型，在飲用DSS水的同時急性腸炎模型組（DSS+PBS）予磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）灌腸，五味苦參組（DSS+FSEC）用膠囊中五味苦參粉末溶于PBS中制成FSEC灌腸液，終濃度為每只小鼠予含0.728 g/（kg·d）的FSEC灌腸液灌腸。模型組和五味苦參組均予等容量溶液灌腸，均為0.2 mL/d，連續干預7天。藥物劑量換算是基于2005年7月美國FDA官網發布了關于“健康成年志愿者首次臨床試驗藥物最大推薦起始劑量的估算指導原則”的文件，采用了體表面積折算法進行動物與人類等效劑量的換算［7］。具體換算如下，按照體表面積法，不同動物與人類之間的換算系數各不相同。人的體質量設為60 kg，小鼠給藥劑量約為人的9.1倍。UC患者服用FSEC方式為：0.4 g/粒，每次口服4粒，每日3次，則每天的總劑量為4.8 g/d。則每只小鼠每日給藥劑量為4.8（g/d）/ 60 kg×9.1= 0.728 g/（kg·d）。灌腸前予0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，手指按摩肛門部，用灌腸器輕柔緩慢插入肛門，深度為3 cm時推注0.2 mL灌腸液并倒立2分鐘。

1.3.2 觀察指標 每天觀察并記錄小鼠的一般精神狀態、體質量、大便性狀及血便情況。實驗終點（第8天）予1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后處死小鼠。收集小鼠腸組織、血清等標本，測量結腸長度，炎癥結腸組織多聚甲醛浸泡，隨后包埋，進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和組織病理評分，余下結腸組織立即凍存于-80 ℃，后續取部分組織行實時定量PCR。

1.3.2.1 疾病活動度評分 疾病活動度評分（disease activity index，DAI）分為體重減輕程度、大便性狀（干燥或稀便）、血便情況（隱血/肉眼血便）。每項最高分為4分，DAI為三項相加，最高分為12分，分數越高代表小鼠腸炎越嚴重［6］。

1.3.2.2 結腸組織學病理評分 小鼠炎癥結腸組織用預冷0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，取1 cm靠近肛門的直腸組織進行多聚甲醛浸泡24 h，脫水，石蠟包埋，切片及HE染色。請教兩名病理科醫師分別獨立進行組織病理學評分，使用0～3分制來描述炎癥的嚴重程度，將3個參數相加，最高得分為9。評分表見表1。

1.3.2.3 結腸組織炎癥因子及屏障因子qPCR檢測 使用Trizol試劑從小鼠結腸炎癥組織中提取總RNA。嚴格按照制造商提供的方案，進行定量PCR。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 統計學方法

所有統計分析均使用SPSS 23.0進行統計學處理和分析。每個分組均重復3～5次，所有數據符合正態分布，結果以（±s）表示，采用兩兩比較，獨立樣本t檢驗分析兩組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 8 繪圖軟件。

2 結 果

2.1 FSEC灌腸改善小鼠體質量

與健康對照組相比，小鼠自由飲用含3% DSS飲用水后第3天開始出現進食明顯減少、體質量下降、懶動，且隨著飲用DSS水時間逐漸加重，在第8天體質量降到最低。與PBS灌腸組相比，FSEC灌腸組小鼠體質量下降不如PBS組明顯，FSEC灌腸在第6、7、8天中有明顯改善小鼠體質量下降趨勢，且差異有統計學意義。見圖1。

圖1 體質量變化情況

2.2 FSEC灌腸減輕小鼠DAI評分

與健康對照組相比，小鼠自由飲用含3% DSS飲用水后第3天開始出現稀便、體質量減輕、進食減少，隨著時間延長，小鼠出現精神萎靡、懶動，進食明顯減少，逐漸出現水樣便，甚至血便，體質量出現斷崖式下降。與PBS灌腸組相比較，從第3天開始FSEC灌腸組DAI評分低于PBS灌腸組，第6、7、8天FSEC灌腸組DAI評分降低尤為顯著，且第3天到第8天DAI評分下降均差異有統計學意義。見圖2。

圖2 DAI評分

2.3 FSEC灌腸改善小鼠結腸長度

正常組小鼠平均結腸長度為9.50 cm，PBS灌腸組小鼠平均結腸長度為6.73 cm，與健康對照組相比，飲用DSS飲用水7天后的小鼠結腸長度明顯縮短。FSEC灌腸可一定程度改善結腸縮短，予7天FSEC灌腸小鼠平均結腸長度為7.45 cm，但比較差異未見有統計學意義。結腸長度大體圖見圖3A，結腸長度統計柱狀圖見圖3B。

圖3 結腸長度

2.4 FSEC灌腸改善小鼠組織學表現

小鼠結腸組織HE染色鏡下觀察，正常組小鼠結腸組織黏膜上皮層完整，腺體排列整齊，可見散在分泌黏蛋白的杯狀細胞。DSS模型組鏡下可見黏膜上皮層完整性破壞，杯狀細胞明顯減少甚至消失，腺體結構破壞，隱窩膿腫，黏膜固有層和黏膜下層較多炎癥細胞浸潤。FSEC組可明顯改善結腸組織病理學表現，黏膜上皮部分恢復，杯狀細胞數量明顯多于PBS組，腺體及隱窩結構部分恢復，炎癥細胞數量及浸潤范圍減少。小鼠組織學評分可觀察到FSEC組分數明顯低于PBS灌腸組，見圖4。

圖4 結腸HE染色（100X）

2.5 FSEC灌腸減輕小鼠結腸炎癥

小鼠結腸炎癥組織充分研磨后提取總RNA，進行qPCR檢測。結果發現急性腸炎模型組結腸組織IL-1β的mRNA相對表達高于正常組，給予FSEC灌腸治療7天后，炎癥因子mRNA相對表達量下降。IL-6和TNF-α相對表達量在各組中變化趨勢一致。見圖5。簡而言之，FSEC灌腸可降低小鼠結腸炎癥因子表達。

圖5 qPCR結果——炎癥細胞因子

2.6 FSEC灌腸有利于小鼠結腸上皮屏障恢復

結腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達是檢測上皮屏障功能的重要指標［8-10］。我們通過檢測結腸組織Occludin和ZO-1 mRNA的相對表達量，進一步評估FSEC灌腸對結腸上皮屏障的影響。觀察到3% DSS腸炎組小鼠結腸組織Occludin和ZO-1 mRNA的相對表達量明顯少于健康對照組，FSEC灌腸能明顯增加結腸組織Occludin和ZO-1 mRNA的相對水平。見圖6。

圖6 qPCR結果——屏障因子

3 討 論

IBD的發病機制很復雜，尚不明確。目前普遍達成一致的意見是IBD被認為是遺傳易感、某種環境、微生物、腸道屏障破壞以及免疫紊亂在易感宿主中相互作用，最終導致腸道非特異性腸道炎癥的結果［11-14］。臨床上常用藥物治療如水楊酸制劑、激素等效果有限，長期服用也可能出現消化道出血、股骨頭壞死等不良反應。盡管生物制劑的出現使療效提高［15］，展現了較好的前景，然而抗 TNF-α單克隆抗體，抗 IL-12 和 IL-23 生物制劑，以及靶向NF-κB治療等價格高昂，并非大部分患者的經濟能力所能長期獲取。反復復發、遷延不愈的疾病，嚴重影響患者生活質量的疾病，探索其他藥物治療的需求呼之欲出。從中醫辨證角度，UC臨床中常見類型是大腸濕熱型，又稱濕熱內蘊型UC。五味苦參腸溶膠囊為中藥復合制劑，由5種中藥組成，具有清熱燥濕，涼血止血，適應證為腹瀉、黏液膿血便、腹痛等。其治療輕、中度活動期UC的療效與美沙拉嗪相當［16-18］。基于國內外前期研究背景，本研究選用五味苦參腸溶膠囊灌腸液治療實驗性小鼠結腸炎，能有效減輕小鼠結腸炎和改善腸道屏障功能，為五味苦參腸溶膠囊的臨床用藥提供理論基礎及數據支撐。

之前已有研究探討五味苦參腸溶膠囊口服治療UC的療效研究，兩項研究均為復方苦參腸溶膠囊聯合美沙拉嗪 vs 美沙拉嗪單用治療UC的療效研究，焦英偉等［4］觀察到其有效率為95% vs 81%（P＜0.05）；另一項研究刁凌云等［19］發現其總有效率有95% vs 75%（P＜0.05）。趙軍［17］則單用復方苦參腸溶膠囊治療UC，結果發現與美沙拉嗪相比，單用復方苦參腸溶膠囊能有效改善UC患者濕熱內蘊證，總有效率為95% vs 86.67%。以上結果表明口服復方苦參腸溶膠囊在治療UC中的積極作用。考慮到對于病變局限于遠端結腸甚至直腸的UC患者，藥物灌腸直接作用于病灶的療效會明顯優于口服藥物。在此背景下，本研究針對五味中藥復合物灌腸液即五味苦參灌腸液對小鼠腸炎的療效研究。

盡管羅丹［20-21］的研究探討了五味苦參腸溶膠囊灌腸液對結腸炎小鼠的影響，其主要結果集中在小鼠結腸組織中視黃酸受體相關孤兒受體γt（RORγt）、IL-17、Caspase-1、IL-1β等的蛋白水平。然而，本研究五味苦參腸溶膠囊灌腸液治療小鼠急性腸炎效果顯著，主要表現在以下幾個方面。首先從大體上，觀察到五味苦參腸溶膠囊可改善小鼠的體質量，腹瀉、便血的次數，降低了DAI，有利于改善小鼠結腸縮短。進一步從組織學層面觀察五味苦參腸溶膠囊對小鼠結腸的影響，結果顯示五味苦參腸溶膠囊有利于結腸上皮細胞屏障修復，增加了杯狀細胞數量，一定程度修復隱窩結構，并減少了炎癥細胞浸潤。隨后從RNA層面定量檢測小鼠結腸組織炎癥因子及屏障因子的表達，結果也證實了五味苦參腸溶膠囊治療明顯降低幾種炎癥因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α的相對表達，增加了屏障因子Occludin和ZO-1 mRNA的相對表達量（圖5-6）。總之，本研究相較于其他已有文獻，優勢在于從組織病理學、RNA水平評估五味苦參腸溶膠囊灌腸液治療小鼠急性腸炎的療效，包括降低炎癥因子及增加腸道屏障因子兩個方面起作用。

目前國內外大量研究發現腸道炎癥是IBD的常見表型，先天性免疫和適應性免疫通過多種機制參與IBD的發病，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間免疫失衡是IBD的機制之一［22］。在活動期UC患者的腸組織中，觀察到炎性細胞，如巨噬細胞、T淋巴細胞等在腸黏膜中聚集，導致炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌增加，增加的促炎細胞因子進一步加劇了腸道炎癥以及腸黏膜屏障的破壞［23］。本研究用五味苦參腸溶膠囊灌腸液治療急性腸炎的相關機制可能在一定程度上抑制了過激的免疫反應，導致促炎細胞因子表達減少，減緩腸屏障的損害，一定程度改善了腸道黏膜免疫和有利于腸道屏障功能修復。綜上所述，五味苦參腸溶膠囊灌腸可減輕DSS誘導的小鼠急性結腸炎。