連續計數法血小板功能檢測的方法學評價及質量控制研究進展

王崇 王麗嫻 秦娜 秦云靜 袁茵 趙建宏

連續計數法血小板功能檢測(sequential platelet counting method,SPCM)是國內于2012年研發的一種基于庫爾特原理的新型血小板聚集功能評價實驗[2],其檢測原理為:通過連續動態測量全血標本在添加誘聚劑(Agonist)前后血小板數量及體積變化,綜合分析血小板最大聚集率(maximum aggregation rate,MAR)、平均聚集率(average aggregation rate,AAR)、最大聚集時間(maximum aggregation time,MAT)、血小板聚集曲線(platelet aggregation curve,PAC)、血小板抑制率(PLT inhibition rate,INH)、血小板平均抑制率(PLT average inhibition rate,A-INH)、紅細胞最大聚集率(RBC maximum aggregation rate,R-MAR)等參數,對血小板在不同誘聚劑誘導下的聚集功能進行較為全面的評價[2,3],進而指導臨床選擇患者較為敏感的抗血小板藥物。本文擬對連續計數法血小板功能檢測與其他方法進行比較,分析各自優缺點,并對SPCM的影響因素及質量改進提出建議。

1 方法學比較

1.1 SPCM與LTA LTA做為一種傳統的血小板聚集功能實驗,最初由Salzman于1960年提出[4],其原理為通過離心將標本分為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)和貧血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP),用PPP將PRP的血小板計數調整至250×109個/L,在其中加入不同種類的誘聚劑,如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、膠原(Collagen,Col)、腎上腺素(Epinephrine,EPI)等,誘導血小板聚集,引發血漿濁度變化,通過檢測血漿透光率的動態變化,計算血小板聚集率。其優點是:市場應用廣泛,臨床認可度高,試劑價格相對較低;檢測結果準確、重復性好,血漿濁度變化的檢測為不間斷連續線性測定,能準確捕捉到透光率最大、濁度最低、血小板最大聚集的時間點。但亦有明顯的缺點,因其檢測血漿濁度變化,一些影響血漿透光度的因素,均會對檢測結果產生影響;標本檢測前需要離心,會誘導血小板活化,且分離血漿,去除紅、白細胞后,非全血環境,不能準確、全面反應血小板在體內活化、粘附、聚集功能;因實驗前需要對標本進行提取貧、富血小板血漿等手工操作,檢測人員操作的熟練程度對結果會有影響,不利于實驗操作全過程自動化;不同實驗室間、不同實驗操作人員對同一份標本的檢測結果也會有差異。

SPCM與LTA相比較,具有以下優勢:標本不需要離心,沒有實驗前手工操作步驟,減少了手工操作誤差的干擾,容易實現實驗全過程自動化、批量化,提高檢測效率;不分離血漿,不去除紅、白細胞,最大程度還原血小板體內的全血環境,真實反映血小板的活化狀態;SPCM通過對加入誘聚集前、后不同時間點的血小板計數來計算PLT最大聚集率,輕度的溶血、黃疸、脂血、乳糜血對檢測結果無影響。不足之處是SPCM為固定時間點檢測,即在加誘聚劑前進行1～2次血小板計數檢測,以此次血小板測定結果或2次測定結果的平均值為基數;加誘聚劑后300 s、380 s、460 s再進行3次血小板計數,以其中血小板數量最少、聚集程度最大時間點的血小板計數結果計算最大聚集率。不同于LTA的不間斷的連續濁度測定,其所謂的“連續”其實是抓取5個時間“點”對血小板進行測定,不能精確捕捉到血小板“最大聚集”發生的時間點,從實驗設計原理上來講,重復性不如LTA穩定。尤其對于服用抗血小板藥物過量導致的最大聚集時間延遲的患者,因血小板尚未達到最大聚集程度便在460 s結束測定,會導致測定結果偏低。

吳小利等[2]對以連續測定法為原理的江蘇英諾華醫療技術有限公司生產的PL-11血小板聚集儀的日間、批內、批間的不精密度、準確性、攜帶污染率及線性性能進行了評價,結果顯示:SPCM法與LTA法有一定相關性(r=0.62,P<0.01);各項檢測結果均符合美國《臨床實驗室改進修正法案-88》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88,CLIA’88)的要求,結論為連續測定法血小板功能檢測是一種較理想的、適用于血栓病早期預警和診斷實驗方法,值得推廣應用,與張有濤等[5,6]的研究結果一致。

1.2 SPCM與IPA IPA又稱全血電阻抗法,最早于1980年提出[7],標本不需要離心,全血測定,其原理為在全血樣本中加入誘聚劑,使血小板活化,粘附聚集于電極,使電阻抗增加、電流減小,通過記錄電流的變化曲線來評價血小板聚集功能[7,8]。與SPCM一樣,二者均直接使用抗凝全血,標本不需要離心,避免手工操作干擾,能最大程度反應血小板在全血環境下的功能狀態[9],不同于SPCM的“固定時間點”檢測,IPA可連續監測因血小板聚集導致的電流減少、電阻抗增加,能準確捕捉血小板最大聚集率發生的時間點,重復性優于SPCM;但IPA每次實驗都需要清洗電極,日常維護要求高,且易受血小板數量及紅細胞壓積(hematocrit,HCT)影響,血小板及紅細胞數量偏低的患者,IPA電流變化不明顯,實驗靈敏度偏低。IPA對微小凝集不敏感,對輕度血小板功能障礙敏感度較低,故IPA多用于實驗研究,臨床應用較少[9]。

SPCM日常維護簡單,實驗環境要求不高,對實驗前PLT的微小凝集可通過質控參數“原始血小板平均體積MPV-0”進行預警,當MPV-0≥11 fl時提示有PLT凝集或小紅細胞干擾。HCT對SPCM的影響可通過矯正公式進行調整,當HCT≤20%或HCT≥55%時,按矯正公式:抗凝劑(ml)=(100-HCT)×血液(ml)×0.00185對抗凝劑進行調節[10]。PLT數量明顯減少時,如PLT<50×109/L,會導致SPCM檢測的重復性變差。

1.3 SPCM與TEG TEG是血栓彈力儀描繪出的凝血動態過程曲線,能動態分析血小板、凝血因子、纖維蛋白原等血液成分之間相互作用、血凝塊形成和纖維蛋白溶解全過程的曲線圖[11]。最早由德國人Harret于1948年提出[11],其原理為:體外模擬靜脈血流,全血或血漿復鈣后,激活凝血系統,反應杯中的金屬針感應血栓形成及溶解過程中的應切力,由計算機繪制血栓形成速度、強度及溶解曲線[12],以此反映凝血及纖溶過程的全貌。一般分普通杯檢測、肝素酶杯檢測和血小板功能杯檢測3種檢測方式。主要參數包括:反應時間(R)、凝固時間(K)、兩側曲線最寬距離(MA)、血塊穩定性(LY30)、預測纖溶指數(EPL);MA反應血小板功能,MA≥70 mm表示血小板功能較強,發生血栓的風險較高;MA≤50 mm表示血小板功能較弱,出血的風險較大[12]。但MA除反映血小板功能外,還受纖維蛋白原的影響,反應血小板功能特異性方面不如SPCM。對于低纖維蛋白原血癥患者,不能真實反映血小板功能及活化狀態,可能干擾臨床對抗血小板藥物的使用評價。另外,MA與LTA法檢測血小板聚集率的相關性方面仍存爭議[12]。

TEG的優點是可床旁全血檢測,操作簡單,重復性好,除了可以通過監測MA寬度,評價血小板功能及抗血小板藥物的治療效果外,還可全面檢測患者凝血及纖溶系統是否異常,綜合評估出血和血栓風險[12]。但正因為TEG反映的是凝血、纖溶的全過程,包括纖維蛋白的形成速度、溶解狀態、血栓的堅固性及彈力度等。整個反應過程除血小板外,還有凝血酶、凝血因子、纖維蛋白原、纖溶酶等參與血栓的形成與溶解過程,影響因素較多[13],且凝血酶形成后是血小板的強激活劑,因此,普通杯MA值不能反映抗血小板藥的用藥效果,只能通過血小板杯MA差值對抗血小板藥效進行評估。黃武明[14]比較血栓彈力圖法與比濁法在冠心病患者血小板功能檢測中的應用效果發現,二者相關性較差,檢測一致性也較弱,僅對高血脂患者兩種方法有較好的相關性。

SPCM是在全血樣本中加入誘聚劑后,通過比較加入誘聚劑前后血小板數量的變化來計算血小板最大聚集率,不受凝血因子、纖維蛋白原、凝血酶及纖溶酶等因素影響,在評價血小板功能的特異性方面優于TEG;但血小板膜上有多種活化通路受體,SPCM僅適合對AA、ADP、Col、EPI等特定誘聚劑類藥物的治療效果進行評價,不能代表PLT整體功能水平,尤其是長期服用抗血小板藥物的患者,因此,在綜合評估患者出血和血栓風險方面TEG優于SPCM。

1.4 SPCM與VASP VASP為血小板內蛋白,在基礎狀態下處于非磷酸化狀態,當P2Y12受體被ADP激活后,VASP被蛋白激酶磷酸化,在對血小板膜通透化處理后,加入抗VASP磷酸化熒光抗體,采用流式細胞術對VASP進行定量分析[15]。優點是P2Y12信號通路特異性強,實驗結果與LTA相關性較好,但不能檢測其他血小板活化通路;SPCM除可檢測ADP誘導的P2Y12信號通路外,還可對AA、Col、EPI活化的其他通路進行檢測;VASP流式法操作較為復雜,費用較高,多用于實驗研究,臨床應用較少。

1.5 SPCM與VerifyNow VerifyNow快速血小板功能檢測儀于2006年由美國食品藥品管理局批準,用于血小板功能檢測,由美國Accumetrics公司生產,其原理為:反應杯中含有血小板激活劑(AA、ADP、凝血酶受體激活肽)及纖維蛋白原包被的微粒,加入全血后,血小板被激活劑活化,其表面的糖蛋白IIb/IIIa受體與微粒表面的纖維蛋白原結合,血小板吸附于微粒表面,使反應杯透光率增加,根據濁度的下降來評價血小板功能。其優點為全血檢測,標本用量少,操作簡單,可床旁測定,可評價AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[16],歐美國家應用較多。但其以凝血酶作為聚集基線,干擾了血小板其他的聚集通路,不能代表血小板的最大聚集能力。SPCM也是全血檢測,根據加入誘聚劑前后血小板計數的減少為依據,來進行血小板最大聚集率的計算,不激活凝血系統,不受凝血酶的影響,操作也較簡單,更有利于臨床應用。

1.6 SPCM與PFA-200 PFA-200是德國SIEMENS公司生產的一款血小板功能分析儀,其檢測原理為:根據血液動力學原理,在體外模擬體內血管損傷后血小板的粘附與聚集過程,利用小孔閉合時間來反應血小板的功能狀態[17]。具體過程為:將全血標本吸入富含膠原纖維、腎上腺素或ADP等血小板誘聚劑的孔隙中,在剪切力的作用下,測定血栓封閉孔隙的時間,以反應血小板的最大聚集率,多用于檢測先天性或獲得性血小板聚集、粘附功能障礙性疾病,也可用于抗血小板藥物療效監測。其優點為標本用量少、檢測時間短、可床旁檢測,可檢測血小板的粘附功能[18];但標準化差,對血流動力學的過度依賴影響檢測的準確性。

SPCM相對PAF-200更易全流程標準化,標本采集后,直接全血上機檢測,無中間手工操作環節,不受血流動力學影響,但僅能對血小板的聚集功能進行評價,無法監測PLT的粘附功能。

1.7 SPCM與流式細胞術 流式細胞術利用熒光標記抗體可檢測單個血小板上的不同標記物,對全血標本中懸浮血小板快速進行表型分析[19],相較于其他血小板功能檢測方法有如下優點:全血檢測、標本用量少、可檢測PLT表面不同受體表達及對PLT反應性進行測試,尤其對于血小板減少癥患者,檢測結果準確可靠,明顯優于其他血小板功能檢測方法;但溶血產生的RBC碎片會干擾PLT的識別,影響檢測結果[20]。SPCM同樣是全血檢測,可對不同誘聚劑下血小板功能進行檢測,但不能對PLT表面受體進行分析,對PLT數量較少的標本,實驗結果的重復性差。

2 SPCM檢測影響因素分析

2.1 校準品與溯源 連續計數法血小板功能分析儀生產廠家較少,沒有統一規范的校準品生產及使用標準,多為各公司專用校準品,一般分低(≤100×109/L)、中[(130～240)×109/L]、高(≥330×109/L)3種不同濃度水平,無明確溯源鏈,部分生產廠家用美國伯樂公司的全血質控品進行替代;除新裝機時要求必須進行校準外,在使用過程中并未規定校準周期,只有當質控結果發生明顯偏離時,才進行校準,校準的目的也是對儀器的檢測系統、電子系統進行補正,保證系統精度,而對靶值的偏差要求不高,一般在±10%左右即可接受,這可能與檢驗結果為“血小板聚集率”,報告以比值形式體現有關,對檢測的準確度要求不高,而對檢測的穩定性要求較高。但對于血小板減少癥患者,血小板絕對數測量不準會嚴重影響實驗結果的穩定性。

檢驗科血常規分析儀血小板校準品多溯源到國際血液學標準委員會(international council for standardization in heamatology,ICSH),溯源鏈明確,結果可靠,重復性好。在日常工作中經常遇到連續計數法血小板功能分析儀與血常規分析儀對同一患者的血小板測定結果不同,給臨床帶來困擾。當二者結果不一致時,建議以血常規分析儀結果為準,原因如下:血常規分析儀血小板校準品有明確的溯源鏈,每天進行室內質控,按要求參加室間質評,檢測結果有保證;連續計數法血小板功能分析儀關注的是血小板功能,檢測結果是以最大聚集率來表達,對血小板計數的絕對值要求并不高。故在日常工作中遇到血小板功能分析儀與血常規分析儀對同一患者的血小板測定結果不同時,應以血常規分析儀結果為準。血小板校準品的溯源性是保證檢測結果準確的基礎,建議生產廠家參考血常規分析儀,使用有溯源性的校準品對血小板功能分析儀進行校準,減少與血常規血小板的計數誤差。

2.2 質控品 連續計數法血小板功能分析儀質控品多為各生產廠家配套質控品,非第三方質控,一般為經特殊處理的動物細胞顆粒,不同廠家所生產的質控品技術要求、生產工藝、添加物及基質效應不同,無統一標準,僅供其自身檢測系統使用,決定了不同品牌儀器的血小板最大聚集率檢測結果只能相互參考,無法互認。建議統一使用第三方質控品,增加檢測結果的準確度及穩定性,促進不同品牌間檢測結果互認。

2.3 誘聚劑效能對檢測結果的干擾 要保證檢測結果準確,除血小板計數穩定外,檢測前必須對誘聚劑效能進行驗證,即檢測健康志愿者新鮮血漿時,最大聚集率應不低于30%,否則誘聚劑失效。但目前尚無廠家在試劑說明書中明確要求每批測定前都要進行誘聚劑效能監測,在日常工作中,操作人員經常不進行誘聚劑效能檢測就直接測定患者標本。

誘聚劑性質不穩定或部分失效會導致檢驗結果偏低[21],最常見的是花生四烯酸復溶后效能損失,花生四烯酸在復溶后2～8℃密封存放可穩定3 d,但常溫8～30℃僅可穩定8 h,超出保存穩定期,誘聚劑效能會明顯下降,影響誘聚效果,導致血小板最大聚集率結果偏低。建議各廠家規范說明書實驗操作流程,在檢測前對誘聚劑效能進行驗證。

2.4 小紅細胞或紅細胞碎片的干擾 連續監測法將MPV-0做為一個質控指標,當MPV-0明顯超出正常范圍,如MPV-0≥11 fL時,提示在誘聚劑加入前已經發生血小板聚集,需重新采樣。但在使用過程中發現部分黃疸患者,紅細胞膜硬度增大,溶血劑不能完全溶解紅細胞,儀器對部分未充分溶解的小紅細胞或紅細胞碎片會誤計為血小板,導致MPV-0明顯增大,影響結果判斷。當儀器發出MPV-0異常提示時,建議檢查患者其他血清或血漿標本,查看是否有溶血、黃疸、脂血、乳糜血等干擾,也可查看患者血常規結果是否有小紅細胞及紅細胞碎片等異常提示。

2.5 標本放置時間 朱遠等[22]通過研究發現標本不同放置時間對連續計數法血小板功能檢測結果有影響,以花生四烯酸為誘聚劑時影響較小,但以ADP 或膠原為誘聚劑時,隨著標本放置時間的延長,血小板聚集率降低。因此,建議以花生四烯酸為誘聚劑時,血小板功能檢測應在采血后4 h內完成;以ADP或膠原為誘聚劑時,應在采血后 2 h內完成檢測。Zhu等[23]以LTA方法檢測血小板功能,建議標本檢測時間最好控制在采血后30 min至2 h,不宜超過4 h。程衛紅[24]用全自動血細胞分析儀對70名健康人血小板參數進行分析,發現隨著放置時間的延長,血小板的各項參數隨之升高,采集4 h后影響更加明顯。

2.6 采血不暢和標本運輸過程中震蕩 無論采血不暢還是標本運輸過程中震蕩,均可刺激血小板體外激活,導致血小板最大聚集率和平均聚集率測定結果偏高,差異有統計學意義[25]。為避免采血對血小板活化的干擾,應合理進行采血排序,避免血小板功能檢測排采血第一管。血小板功能檢測結果是臨床上判斷抗血小板藥物療效的重要指標,故在標本采集及運輸過程中應保證采集順暢,避免劇烈的震蕩,以免影響臨床對抗血小板藥物療效的評估。

3 小結與展望

急性血栓性疾病是臨床多發病,具有突發性強、致殘率高、致死率高等特點[26]。當血管破裂或內皮損傷時,內皮下膠原蛋白、組織因子、血管性血友病因子(von Willebrand disease factor,vWF)暴露,在激活內、外源凝血系統的同時,也激活靜息狀態下的血小板,活化的血小板通過vWF粘附到受損的血管內皮,實現一期止血。活化血小板表面豐富的磷脂提供了催化凝血瀑布級聯反應的場所,導致大量凝血酶生成,水解纖維蛋白原為纖維蛋白,實現二期止血。活化血小板還可釋放血栓烷(TXA2)、二磷酸腺苷(ADP)及炎性因子[27],通過第二信使刺激更多血小板吸附、聚集,促進凝血酶的生成,放大凝血作用,形成血栓[28]。因此,臨床及時的抗血小板藥物干預,對抑制及預防血栓形成有重要意義。

臨床上通常用抗血小板藥物來降低血小板反應性,阻止血栓形成,減少和預防心、腦血管卒中事件的發生;根據藥物作用靶點不同,臨床常用抗血小板藥物分為:環氧酶抑制劑,代表藥物為阿司匹林、吲哚布芬;二磷酸腺苷受體拮抗藥,代表藥物為氯吡格雷、替格瑞洛;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑,代表藥物為替羅非班[29]。抗血小板藥存在個體差異,即血小板反應多樣性[30],根據患者服用抗血小板藥物后的反應,分為血小板高反應性(high platelet reactivity,HPR)和血小板低反應性(low platelet reactivity,LPR),HPR指患者對該抗血小板藥物不敏感,或用藥量不夠,血小板活性抑制不足,發生血栓風險較高;LPR指患者對該抗血小板藥物敏感,或用藥過量,血小板活性過度抑制,出血風險較高[31]。臨床醫生必須根據血小板功能檢測結果進行用藥調整,以減少多種強效抗血小板藥物聯合使用導致的出血不良事件[32]。2011年美國心臟病學會基金會(American College of Cardiology Foundation,ACCF)及美國心臟學會(American Heart Association,AHA)提出對不穩定型心絞痛(Unstable angina,UA)及非ST段抬高心肌梗死(Non-st-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)患者在服用抗血小板藥物治療時要進行血小板功能檢測的建議[33]。

目前,臨床實驗室血小板功能檢測方法主要包括光電比濁法(light transmittance aggregometry,LTA)、電阻抗法(impedance platelet aggregometry,IPA)、血栓彈力圖法(thromboelastography,TEG)、血管舒張劑刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)測定法、VerifyNow測定法、PAF-200小孔閉合時間測定法、流式細胞術測定法等,以LTA法應用最為廣泛,被認為是血小板功能檢測的“金標準”[34]。其他實驗方法的檢驗結果也多與LTA進行比較,但因原理及操作程序不同,不同方法學測定結果之間缺乏可比性[35]。如王曦[36]研究了各種方法之間的相關性,LTA 與血栓彈力圖的相關系數為 0.6(P<0.05),LTA 與Verify-Now 的相關系數為0.693,血栓彈力圖與 Verify-Now的相關系數為 0.564(P<0.05),實驗結果之間雖有相關性,但相關系數均不高。各種血小板功能檢測方法總體臨床預測價值不高,各方法的ROC曲線下面積為0.5～0.63,敏感度及特異性均<65%,且不能預測患者出血風險[37]。

綜上所述,盡管血小板功能檢測有多種方法,但因實驗設計原理不同,各有優缺點。LTA應用最廣,因排除了RBC干擾,通過動態監測血漿濁度的變化反映PLT聚集功能,實驗結果重復性好,但影響血漿透光率的因素,如溶血、脂血、黃疸、乳糜血會干擾檢測結果,且離心會誘導PLT活化,在非全血環境下,不能準確、全面反映PLT在體內活化、粘附、聚集、釋放功能;因操作熟練程度的不同,手工提取貧、富血小板血漿也會對實驗結果產生一定的影響。IPA具有操作簡單、全血檢測、無需離心、標本用量少等優點,能最大程度反應血小板在全血環境下的功能狀態,但電極日常維護要求高,易受PLT數量及HCT影響,對輕度血小板功能障礙敏感度較低,多用于科研,臨床應用較少。TEG通過對凝血纖溶過程曲線分析,可動態反映血栓形成及溶解整個過程,PLT只是參與因子之一,對PLT功能的評價受其他因素,如纖維蛋白原、凝血因子等的影響[38]。VASP對PLT膜表面P2Y12信號通路特異性強[39],但不能檢測其他PLT活化通路,不能全面、完整反映PLT功能,多用于實驗研究。VerifyNow快速血小板功能檢測儀操作簡單,標本用量少,可評價AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[40],但其實驗原理以凝血酶作為聚集基線,檢測結果受纖維蛋白原及凝血酶影響較大。PAF-200利用小孔閉合時間來反應PLT的功能狀態,標本用量少、檢測快速、可同時檢測血小板粘附功能,但受血流動力學的影響較大,重復性差。流式細胞術利用熒光標記抗體對PLT進行表型分析,干擾因素少,特異性好,特別適用于血小板減少癥患者,但溶血產生的RBC碎片干擾實驗結果。因此,為臨床提供一種檢測結果準確、重復性好,能真實反映體內血小板活化狀態的實驗方法,尤為重要。

連續計數法血小板功能檢測是近年來開展的一項評價血小板聚集功能的新技術,操作簡單,易于自動化,與傳統“金標準”光電比濁法有較好的相關性。楊雅薇等[41]的研究顯示,SPCM、Verify-Now、血栓彈力圖、VASP檢測的血小板抑制率結果有一定的相關性,但SPCM在實驗設計及質量控制方面還需改進與完善,比如可以通過增加“固定時間點”檢測次數提高檢測結果的穩定性;在明確校準品溯源路徑、在說明書或SOP文件中規范誘聚集效能評價標準、合理應用第三方質控品進行日常室內質控監測、減小與血常規分析儀PLT計數誤差、增強不同實驗室間結果互認等方面,需要進一步規范與完善。除以上影響因素外,血小板聚集功能檢測還受血小板自身不穩定的影響,標本采血是否順暢、震蕩、存放時間及溫度、臨床用藥等均可導致血小板功能變化,對異常結果的判讀一定要結合臨床,與臨床醫生、采血護士充分溝通,了解臨床用藥、排除采血干擾后才能正確審核。