瓊脂糖粉的質量對PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳的影響

蘭柳波 張志珍 李彩虹 張海濤 林小聰 劉勇軍 馬衛列 丁航

摘?要：目的：研究瓊脂糖粉的質量對聚合酶鏈式反應（PCR）產物瓊脂糖凝膠電泳的影響。方法：PCR產物瓊脂糖凝膠電泳中分別使用不同牌子的瓊脂糖粉，同時跑膠圖像。結果：質量差的瓊脂糖粉電泳結果有明顯彌散現象，而更換高質量的瓊脂糖粉，未見彌散現象。結論：瓊脂糖粉質量在分子生物學PCR產物瓊脂糖凝膠電泳實驗中扮演重要角色，使用高質量的瓊脂糖粉對實驗的成功至關重要。

關鍵詞：瓊脂糖粉；PCR；擴增產物；瓊脂糖凝膠電泳

Effect?of?the?Quality?of?Agarose?Powder?on

Agarose?Gel?Electrophoresis?of?PCR?Products

Lan?Liubo1，2?Zhang?Zhizhen1，2?Li?Caihong?1，2?Zhang?Haitao1，2?Lin?Xiaocong1，2

Liu?Yongjun1，2?Ma?Weilie1，2?Ding?Hang1，2*

1.Department?of?Biochemistry?and?molecular?biology，Guangdong?Medical?University?GuangdongDongguan?523808；

2.Laboratory?of?Modern?Biochemistry?and?Molecular?Biology，Guangdong?Key?Laboratory?of?Higher?Education

GuangdongZhanjiang?524023

Abstract：Objective?To?study?the?effect?of?the?quality?of?agarose?powder?on?agarose?gel?electrophoresis?of?polymerase?chain?reaction（PCR）products.Methods?High?quality?agarose?powder?and?low?quality?agarose?powder?were?used?in?PCR?product?agarose?gel?electrophoresis.Results?The?agarose?powder?with?poor?quality?showed?obvious?dispersion，while?the?agarose?powder?with?high?quality?did?not.Conclusion?The?quality?of?agarose?powder?plays?an?important?role?in?the?experiment?of?molecular?biological?PCR?product?agarose?gel?electrophoresis.The?use?of?high?quality?agarose?powder?is?very?important?for?the?success?of?the?experiment.

Keywords：agarose?powder；PCR；amplification?products；agarose?gel?electrophoresis

生物化學與分子生物學是目前自然科學中進展最迅速、最具活力的前沿領域，是一門研究核酸等生物大分子的功能、形態結構特征及其重要性和規律性的科學，是人類從微觀即分子的角度來研究生物世界的奧秘、闡明生命現象本質的基礎學科［1］。生物化學與分子生物學作為連接基礎醫學和臨床醫學的橋梁，是每一名醫藥專業學生的必修課，主要為從分子水平解釋疾病發生的作用機制，快速、精準地找到治療靶點，為疾病診斷和治療提供理論支撐［2］。而實驗教學是生物化學與分子生物學課程的一個非常重要的組成部分，對提高課程教學效果起到最直接和重要的作用［24］，我們必須重視實驗教學。為了提高生物化學與分子生物學教學質量，我們開設了兩個綜合性提高型實驗項目：

（1）總RNA提取和反轉錄（RT）、PCR擴增；

（2）質粒DNA的轉化、制備及DNA的限制性內切酶酶切分析，幫助學生更加直觀地了解生物化學與分子生物這門微觀的課程，掌握分子生物學研究技術和方法。

通過對科研思維和創新能力的培養，全方位提升學生分析問題和解決問題的能力，從而掌握生命科學研究的主要途徑。

為了讓學生在實驗中得到更好的效果，我們通過研究瓊脂糖粉的質量對PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳的影響，提示學生在做PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳應注意的相關事宜。

1?方法

1.1?樣品的制備

所有樣品是我們實驗中所獲得的PCR擴增產物。DNA模板：重組人蛋白激酶CK2β亞基cDNA重組質粒（pTCKB，3087bp）。PCR反應：引物（上海生工合成）：上游引物：5AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT3，下游引物：5AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG3。反應條件：94℃預變性5分鐘，擴增25個循環（變性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃30s），72℃再延伸5min，4℃保存。PCR反應體系如表1。

1.2?制膠

0.8%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）：取2個200mL錐形瓶，分別稱取0.32g不同品牌瓊脂糖凝膠粉末，倒入裝有40mL1×TBE電泳緩沖液的錐形瓶，搖勻；置微波爐中加熱至瓊脂糖粉末完全溶解，液體清澈透明；待冷卻到約50℃時分別加入2μL的SYBR?Green?I核酸熒光染料，搖勻后傾倒至膠模中，冷卻［5］。

1.3?電泳、染色及拍照

用移液器分別取20μL染色后的PCR樣品及15μL?DNA?Marker，垂直加入凝膠的加樣孔里，恒壓150V電泳30min，電泳完畢后分別在電泳槽中及凝膠成像系統中觀察，拍照。

2?結果

2.1?品牌A瓊脂糖粉

PCR擴增產物條帶均有彌散現象，DNA?Marker分不開，見圖1、圖2。

2.2?品牌B瓊脂糖粉

PCR擴增產物條帶亮度適中、無“拖尾”或彌散現象、條帶單一，見圖3、圖4。

3?討論

PCR技術是1985年，美國PE2cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等人發明的［6］。PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點［7］。PCR技術無疑給分子生物學帶來了革命，它使擴增和克隆基因成為常規操作程序，目前，在基因定點突變、c?DNA文庫構建、基因測序、基因克隆、載體構建以及人類基因組計劃等領域PCR技術得到廣泛應用并發揮著重要作用［8］，也為DNA指紋鑒定、親子和親緣關系的鑒定和那些遺傳和病原菌引起的疾病的診斷成為可能［910］。在今天的“基因大戰”中，新基因的發現與克隆已成為研究的熱點［11］。而PCR的結果準確性如何？是否可靠？產物是否為特異性擴增？這些都必須通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳對其進行分析和鑒定，才可以有正確的結論。

瓊脂糖凝膠電泳主要是采用瓊脂糖作為支持介質的電泳方法，瓊脂糖凝膠電泳技術的分析原理與其他支持物電泳的最主要的區別是它具有電荷效應和分子篩效應雙重作用，但主要是分子篩效應［11］。DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，混懸于溶液中的樣品電荷顆粒在電場影響下向著與自身相反電荷的電極移動，DNA片段因其分子量或者分子形狀的不同，泳動速度有差異而達到分離效果［11］。瓊脂糖凝膠電泳是DNA片段分離、檢測最常用的技術之一［12］，也是高校生物化學與分子生物學實踐教學的重要環節。核酸染料與瓊脂糖凝膠中DNA片段結合后，從紫外分析儀下可觀察染料發出的熒光，并根據Marker條帶的分子量標準判斷PCR產物的位置和大小。DNA瓊脂糖凝膠電泳所需要的試劑包括瓊脂糖粉、核酸染料、電泳緩沖液等，瓊脂糖粉溶解的質量、電泳緩沖液的質量、電壓的大小、PCR產物的質量、加樣孔的大小以及上樣過程等都可以影響DNA電泳條帶的質量［5，13，14］。

本實驗過程中發現，品牌A瓊脂糖粉加熱完全溶解后液體不夠透明，含的雜質比品牌B的多，而品牌B瓊脂糖粉溶解后液體透明清澈。結果也顯示，用品牌A瓊脂糖粉跑出的帶有彌散、拖尾的現象，而用品牌B瓊脂糖粉跑出的帶無“拖尾”或彌散現象、條帶單一。質量不好的瓊脂糖粉雜質多，影響瓊脂糖的分子篩效應，所以在核酸電泳時若出現DNA或RNA分子條帶扭曲或出現“拖尾”后，在排除電壓過高、電泳液離子強度不適中、PCR產物本身質量、核酸染料質量的前提下［5］，應該考慮到瓊脂糖粉的質量問題，更換瓊脂糖粉或可解決。

參考文獻：

［1］劉向華，袁櫟，劉志軍，等.CBL在生物化學與分子生物學教學中的作用探討［J］.基礎醫學教育，2017，19（06）：420422.

［2］金亮.基于科研思維+實踐能力培養的分子生物學實驗教學改革探究［J］.創新創業理論研究與實踐，2022，5（08）：165167+181.

［3］張亞琴，王力冉，陳芳.PBL教學模式在生物化學與分子生物學實驗課教學中的應用［J］.西部素質教育，2022，8（18）：149151.

［4］吳遠雙，宋玉竹，韓芹芹，等.本科生物化學與分子生物學實驗改革研究［J］.實驗科學與技術，2020，18（06）：5660+70.

［5］馬強，蔡燕，徐磊，等.核酸染料GeneGreen可影響DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶的質量［J］.國際檢驗醫學雜志，2018，39（11）：12861288.

［6］王韻.PCR技術在DNA片段擴增的應用與意義［J］.世界最新醫學信息文摘，2016，16（88）：80.

［7］郭慧.論新技術在食品微生物檢驗檢測中的應用［J］.食品安全導刊，2018（12）：119120.

［8］王景雪，孫毅，梁愛華.擴增未知序列DNA片段的PCR技術研究進展［J］.生物工程進展，2001（01）：5157+41.

［9］呂蓓，程海榮，嚴慶豐，等.體外核酸快速擴增技術的發展和不斷創新［J］.中國生物工程雜志，2011，31（03）：9196+2.

［10］方斌.情報生成范式下系譜偵查的新工具：DNA遠程家族搜索［J］.證據科學，2022，30（01）：4769.

［11］韓陽，何佳夢.瓊脂糖凝膠電泳的理論技術和應用［J］.科協論壇（下半月），2012（06）：9899.

［12］楊萍，陸嘉偉，李翠環.高效安全的核酸染料在瓊脂糖凝膠電泳中的應用［J］.實驗室研究與探索，2022，41（07）：6064.

［13］戴劍，張云輝.SSR擴增產物檢測方法比較及其實驗操作注意事項［J］.種子，2013，32（09）：120123.

［14］張總超，林元清，傅義娟，等.食源性大腸桿菌flic基因的克隆與分析［J］.山東畜牧獸醫，2020，41（12）：610.

基金項目：廣東省本科高校教學質量與教學改革工程建設項目（粵教高函〔2021〕29號）；2022年度廣東省教育科學規劃課題（2022GXJK207）；2022年廣東省研究生教育創新計劃項目（2022SFKC061）；廣東醫科大學2022年度校級本科教學質量與教學改革工程項目（1JG22145）

作者簡介：蘭柳波（1975—?），男，漢族，廣西柳州人，碩士，講師，研究方向：中草藥的生化藥理學。

*通訊作者：丁航（1968—?），女，漢族，海南文昌人，本科，高級實驗師，研究方向：天然藥物活性分析。