豬流行性腹瀉病毒RT-PCR 診斷方法的建立和應用

陳能安

（廣西容縣石頭鎮水產畜牧獸醫站，廣西容縣 537519）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種急性腸道傳染病[1-3]，該病發病率高、傳染性強，各個年齡段的豬都可以感染，仔豬感染后死亡率較高，本病一年四季都可以發生，給我國養豬業帶來巨大的經濟損失，尤其是2010 年以來PEDV出現變異毒株，進一步增加了PEDV 對我國養豬業的威脅，也增加了PEDV 的防控難度[4,5]。為了加強PEDV 的臨床診斷，本研究根據GenBank 上的PEDV 保守區N基因序列設計特異性檢測引物，建立了PEDV 一步RT-PCR 診斷方法，該方法對經典毒株及變異毒株都可以檢出，將為PEDV 的早期診斷和分子流行病學調查提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 毒株

PEDV 經典株、PEDV 變異株、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2 型（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（PRRSV）均由本實驗室保存。

1.2 試劑與試劑盒

BamHI 和XholI 限制性內切酶、pMD18-T 載體、一步法RT-PCR 擴增試劑盒均為TaKaRa 公司產品；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒為AXYGEN 公司產品；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品。

1.3 引物設計與合成

參考文獻[6]，根據GenBank 中登錄的PEDV 經典株和變異株保守區N 基因組序列，用Oligo 6.0 生物學軟件設計1 對特異性檢測引物，上游引物F：5’-CAACAGAGGCAATAAC-3’；下游引物 R：5’-CGCTAGCTCACGAAC-3’，預期擴增片段大小為541 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA/RNA 的提取

按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒的使用說明書，依次提取PEDV 經典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA。

1.5 一步RT-PCR 擴增與測序鑒定

將提取的PEDV 經典株和變異株基因組RNA，參照一步法RT-PCR 擴增試劑盒說明書進行擴增，擴增體系為：2×Buffer 12.5 μL、酶0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 3 μL、H2O 8 μL。擴增程序為：50℃30 min；95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，30 個循環；72℃10 min。一步法RT-PCR 擴增結束后，經瓊脂糖凝膠電泳觀測擴增片段大小。將擴增片段用膠回收試劑盒回收純化后連接至pMD18-T 載體，連接產物轉化DH5α 感受態細胞，挑取單菌落增菌培養，用質粒提取試劑盒提取重組質粒，將重組質粒用BamHI 和XholI 雙酶切進行酶切鑒定，酶切鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。

1.6 特異性試驗

分別對PEDV 經典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 進行檢測，確定檢測方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

根據辛忠昊[7]、丁光明[8]的研究基礎，將提取的PEDV 經典株和變異株基因組RNA 等量混合，測定混合基因組RNA 濃度，將混合基因組RNA 依次進行10 倍倍比稀釋，依次對各稀釋度進行檢測，確定檢測方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

參考張夢巖[9]的研究，分別對PEDV 經典株、PEDV變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 及3 份PEDV 陽性樣品和3 份PEDV 陰性樣品進行3 次重復檢測，確定檢測方法的重復性。

1.9 臨床應用

利用建立的RT-PCR 檢測方法對廣西容縣及周邊地區送檢的264 份臨床腹瀉腸道組織樣品或新鮮糞便樣品進行檢測，掌握廣西容縣及周邊地區PEDV 的感染情況。

2 結果與分析

2.1 一步RT-PCR 擴增與測序鑒定結果

RT-PCR 擴增結束后，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，PEDV 經典株和變異株均可見541 bp 的特異性片段。將擴增片段用膠回收試劑盒回收純化后連接至pMD18-T 載體，雙酶切鑒定正確的重組質粒經測序鑒定分別為PEDV 經典株和變異株特異性序列。

圖1 PEDV 經典株和變異株的RT-PCR 擴增結果

2.2 特異性試驗結果

PEDV 經典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 經RT-PCR檢測后結果如圖2 所示，PEDV 經典株、PEDV 變異株均可擴增出541 bp 的特異性片段，而TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 經一步RT-PCR 檢測后擴增結果為陰性，說明該檢測方法有很好的特異性。

圖2 PEDV 經典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的特異性試驗結果

2.3 敏感性試驗結果

PEDV 經典株和變異株混合基因組RNA 濃度為1.56 mg/mL，混合基因組RNA 依次進行10 倍倍比稀釋后經RT-PCR 檢測，結果如圖3 所示，混合基因組RNA 在10-4倍稀釋后擴增結果依然為陽性，由于RT-PCR 擴增體系中RNA 的用量為3 μL，說明該檢測方法對PEDV的最低檢測下線為0.47 ng RNA，該檢測方法有很好的敏感性。

圖3 敏感性試驗結果

2.4 重復性試驗與臨床應用結果

3 次重復檢測的結果均完全一致，說明該檢測方法有很好的重復性。264 份臨床腹瀉樣品中共檢出陽性樣品56 份，陽性率為21.21%，廣西容縣地區豬場中，豬的臨床腹瀉病例中普遍存在PEDV 的流行。

3 討論

引起豬病毒性腹瀉的病原很多，包括PEDV、TGEV、PCV-2、PRV 等，其中以PEDV 的感染最常見[10,11]，PEDV 的準確診斷是有效防控豬病毒性腹瀉疫病的關鍵。當前針對PEDV 的病原學診斷方法應用較多的是RT-PCR 方法和熒光RT-PCR 方法，熒光RT-PCR 方法存在檢測成本高、操作復雜等缺點，而RT-PCR 方法操作簡單、檢測成本低，比較適合于基層實驗室應用[12]。鑒于此，本研究在常規RT-PCR 方法的基礎上，應用一步法RT-PCR 檢測試劑盒，使RNA 的反轉錄過程和PCR 過程一步完成，操作更加簡單、檢測更加快速。試驗結果表明建立的一步法RT-PCR 診斷方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和適用性，可以用于臨床樣品快速檢測和分子流行病學調查。

當前PEDV 流行廣泛，對我國養豬業危害很大，周宇駿等[13]2021 年從湖南省不同地區213 個豬場采集疑似感染PEDV 樣品共1 406 份，采用熒光RT-PCR 方法對采集樣品進行PEDV 病原檢測，平均陽性檢出率為21.55%。陳勝男等[14]將2021 年采集的來自廣東省主要地市養豬場的379 份樣品進行PEDV 病原檢測，PEDV陽性率為13.19%。王妍等[15]于2021 年3 月至2022 年2 月，從湖北地區共收集臨床具有腹瀉癥狀的糞便—肛門棉拭子1 580 份，采用PCR 法進行PEDV 病原檢測，平均陽性率為20.13%。本研究采用RT-PCR 檢測方法對廣西容縣及周邊地區送檢的264 份臨床腹瀉樣品進行PEDV 病原檢測，平均陽性率為21.21%，本研究檢測結果與周宇駿等[13]、陳勝男等[14]、王妍等[15]的檢測結果基本持平，表明廣西容縣存在PEDV 的流行，且流行陽性率與國內其他地區基本一致，廣西容縣應加強對PEDV感染情況的重視，加強對PEDV 的監測，逐步完善和提高PEDV 的綜合防控措施。

4 小結

研究發現，PEDV 經典株和變異株均可擴增出541 bp 特異性片段，而檢測TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因片段均為陰性，說明廣西容縣地區的豬場主要流行PEDV。通過靈敏檢測發現對PEDV 的最低檢測下限為0.47 ng RNA。