一株4 型副豬嗜血桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

栗衛東

（濟源市農業綜合行政執法支隊，河南濟源 459000）

副豬嗜血桿菌病是一種由巴氏桿菌科的副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）感染豬引起的以多發性纖維素性心包炎、腦膜炎、關節炎和漿膜炎為病理特征的細菌性傳染病[1]。病豬多表現為發燒，呼吸困難，關節腫脹，皮膚及黏膜發紺，部分豬可見共濟失調、轉圈等神經癥狀。副豬嗜血桿菌病在世界各地的養豬場均有發生，我國豬群的病死率一般為30%～40%，嚴重時可達50%[2]，斷奶仔豬和保育豬多發，給養豬業造成嚴重經濟損失。HPS 通常存在于豬的上呼吸道，為條件致病菌，健康豬并不發病，多在受到應激、感染免疫抑制性豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬瘟等多種疾病影響下，豬機體免疫力降低，繼發HPS 病，加重豬的病情。HPS血清型較多，目前已發現15 個血清型，其他20%以上的分離株血清型未能定型[3]。國內流行較多血清型主要有4、5、13、14。同一地區甚至不同豬場流行菌株血清型存在差異，不同的血清型之間缺乏交叉保護率，目前國內使用的二價菌苗（4、5 血清型）無法對其他血清型起到有效免疫效果[4]。防治HPS 臨床用藥多使用抗生素，然而長期不合理地使用抗生素容易導致菌株耐藥性增強，給養豬場治療該病帶來困難。此外，通過藥敏試驗可以監測HPS 對抗生素的耐藥情況，為臨床合理用藥指明方向。本研究對河南省濟源市某規模化養豬場疑似HPS 病豬進行實驗室診斷，通過對分離菌株純化培養、PCR 擴增和血清分型，鑒定分離菌株為4 型HPS，并對該菌株藥敏性分析，旨在為副豬嗜血桿菌病防治提供精準的科學參考。

1 材料與方法

1.1 HPS 病料

采集河南省濟源市某規模化豬場臨床疑似HPS 病死豬的肺臟、心臟、關節液、胸腹腔液等組織樣品。

1.2 HPS 標準菌株和標準陰、陽性血清

1～15 型HPS 標準菌株，1～15 型HPS 標準陰性血清和陽性血清，均來自河南農業大學動物醫學院微生物實驗室。

1.3 主要試劑和儀器

巧克力培養基、7%綿羊血瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆固體培養基（TSA）固體培養基等購自北京索萊寶科技有限公司；細菌微量生化鑒定管、24 種藥敏紙片購自青島海博生物技術有限公司；細菌DNA 基因抽提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix、10×Buffer、Taq 酶、DL-2 000 Marker，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；多功能梯度PCR 擴增儀由Thermo Fisher 公司生產。

1.4 細菌分離鑒定

1.4.1 細菌純化培養與鏡檢

無菌采集病料接種于7%綿羊血瓊脂培養基，置入恒溫箱，37℃培養24 h，挑取單個菌落接種于巧克力培養基上，37℃恒溫培養24 h，然后挑取單個菌落分別接種于巧克力培養基和TSA 固體培養基上，挑取菌落在TSB 培養基純化生長，7℃恒溫培養24 h 后，制作涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 生化鑒定

分離菌株生化試驗鑒定，按照細菌微量生化鑒定管說明書操作，37℃培養24 h，觀察各生化鑒定管結果。

1.4.3 PCR 鑒定

根據Oystein 等[5]、Howell 等[6]研究方法，針對HPS vanY 基因序列設計1 對用于擴增鑒定HPS 引物P1、P2，P1：5'-ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGAT-3'，P2：5'-TAGCCTCCTGTCTGATATTCCCACG-3'，預期大小276 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分離菌株DNA 模板按照細菌DNA 基因抽提試劑盒說明書操作，無菌接種病料于TSB 培養基，37℃培養24 h，吸取培養菌液裝入1.5 mL 離心管，加20 μL ddH2O，沸水浴10 min，-20℃冰浴10 min，12 000 rpm，離心10 min，取上清液作為分離菌株DNA基因組模板。擴增體系體積為25 μL：10×PBS 緩沖液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DNA 模板1 μL，Taq 酶1 μL，10 μmol/L P1、P2 引物各1 μL，加入ddH2O 至25 μL。擴增程序：94℃5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃45 s，共35 個循環；72℃延伸10 min。取10 μL擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統下觀察結果。

1.5 血清型分型

1.5.1 瓊脂擴散法分型

根據徐引弟等[7]的研究方法，將分離菌株接種于TSB 培養基，37℃培養36 h，挑取菌落加入裝有pH 值為7.2、10 mL 緩沖液的滅菌管，8 000 rpm 離心3 min，棄去上清液，再加入體積為管內沉淀物9 倍的PBS，混勻，120℃高壓2 h，取出后8 000 rpm 離心5 min，上清液即為用作瓊脂擴散試驗的分型抗原。將8.5 g 和1 g瓊脂糖放入100 mL PBS 緩沖液，加熱溶解，倒入平板，用打孔器在平板中央打1 個直徑3 mm 的孔，周圍打5個同樣孔，孔間距4 mm，分型抗原加入中央孔，周圍孔加入1～15 型HPS 標準陰性血清和陽性血清，放入塑料濕盒，37℃36 h，觀察結果。

1.5.2 PCR 擴增分型

根據王同兆等[8]的試驗方法，針對HPS wciP 基因序列設計1 對用于擴增鑒定4 型HPS 的特異性引物P3、P4，P3：5'-GGTTAAGAGGTAGAGCTAAGAATAGAG G3'，P4：5'-CTTTCCACAACAGCTCTAGAAACC-3'，預期大小349 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照1.4.2 中的反應體系和反應條件，用引物P3 和P4 進行分離菌株PCR 擴增，擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，用BLAST 軟件對測序結果與GenBank 中的參考菌株同源性比對分析。

1.6 藥敏試驗

挑取分離菌株HPS 放入滅菌生理鹽水，渦旋振蕩混勻，調整濃度至0.5 個麥氏比濁度。用棉拭子將菌懸液均勻涂布于TSA 培養基，自然晾干，藥敏紙片平貼培養基上，37℃培養36 h，測量藥物的抑菌圈直徑大小。按照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI M100—S25，2015 版）標準判耐藥結果。

2 結果與分析

2.1 細菌純化培養和鏡檢

在7%綿羊血培養基上可見邊緣整齊、圓形、灰白色菌落；在TSA 培養基上可見光滑濕潤、邊緣整齊、灰白色的菌落，直徑為1～2 mm；在巧克力培養基上可見表面隆起、圓形、光滑整齊、灰白半透明的菌落。鏡檢結果，菌體為細絲狀、球狀、短桿狀等多種形態。

2.2 生化鑒定結果

分離菌株接觸酶試驗呈陽性，氧化酶、脲酶、吲哚、鳥氨酸脫氫酶均呈陰性，不分解甘露醇，能分解蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和阿拉伯糖。生化特性符合副豬嗜血桿菌，初步鑒定分離菌株為副豬嗜血桿菌。

2.3 PCR 鑒定結果

細菌PCR 擴增獲得1 條目的基因條帶，長度為276 bp，符合預期大小，結果判定為副豬嗜血桿菌，見圖1。

圖1 分離菌PCR 鑒定結果

2.4 血清型分型

2.4.1 瓊脂擴散法分型結果

中央孔內的分型抗原和4 型HPS 標準陽性血清之間有沉淀線出現，而其他型血清無沉淀線，證實分離菌株為4 型HPS。

2.4.2 PCR 血清型鑒定結果

用4 型HPS 特異性引物P3、P4 對分離菌的DNA進行PCR 擴增，獲得1 條目的條帶，長度為349 bp。對擴增結果進行測序，并應用BLAST 生物軟件，與GenBank 中4 型HPS 參考菌株SW124（登錄號：KC795356）基因序列同源性比對，同源性為100%，證實該分離菌株為4 型HPS。見圖2。

圖2 分離菌PCR 分型鑒定結果

2.5 藥敏試驗結果

由表1 可知，分離的4 型副豬嗜血桿菌菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、氨芐西林、阿莫西林敏感；對環丙沙星、阿米卡星、鏈霉素、多西環素、卡那霉素、慶大霉素等產生耐藥性。

表1 副豬嗜血桿菌耐藥性分析結果

3 討論

豬的副豬嗜血桿菌廣泛存在于我國各地養豬場中，成為重要的細菌性疫病，其防控仍具有挑戰性。HPS 是一種非溶血性、多形態、無芽孢、不運動的革蘭氏陰性菌，兼性厭氧和依賴V 因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）生長[9]。由于其生長繁殖對環境條件要求高，在采集病料和分離純化培養中應注意采集部位、抗生素使用、培養基選擇等因素對該細菌生長的影響。有報道，HPS 主要侵染上呼吸道和肺部，且長時間使用抗生素的豬難以分離出病原菌，因此，病料采集重點在鼻腔、呼吸道和肺部，并結合豬的臨床表現采集相應的組織器官，以提高檢出率[10]。傳統的細菌分離培養比較繁瑣，耗時較長，且準確率不高，采用分子生物技術PCR 可以提高檢測效率和準確性，并能對細菌進行進一步血清分型[11]。本試驗采用傳統細菌分離培養和生化試驗的同時，利用PCR 擴增技術對病原菌進行檢測和血清分型，找到本次疫情的致病菌HPS 的主要血清型，為下一步有效防控提供了明確方向。

在HPS 標準血清型中，1、5、10、12、13 和14 被認為是強毒性毒株，2、4、15 和8 被認為是弱毒性毒株，血清型3、6、7、9 和11 被認為是無毒性毒株。血清型4 和5 在我國最流行，其次是血清型7、12、13 和14[12]。HPS 血清型的存在具有地區差異性，不同地區甚至不同豬場由于用藥習慣、飼養管理等不同，其血清型也不同[13]。其流行特點與不同血清型菌株毒力、豬群免疫、抗生素使用、應激和疫苗接種程序等有直接關系[14,15]。本研究分離菌株為4 型HPS，屬于弱毒性菌株，也是我國流行菌株，本次樣本來源于一個豬場，對于濟源市其他養豬場中存在的HPS 血清型是否為4-HPS，需要進一步檢測。抗生素依然是有效防控和治療該病的首選藥物，但由于耐藥性成為阻礙抗生素發揮治療效果的棘手難題，使得開展耐藥性監測成為必要。通過藥敏試驗能夠為臨床用藥提供參考，避免盲目濫用，導致細菌耐藥性擴大。

本次藥敏結果顯示，在10 種抗生素種，分離的副豬嗜血桿菌菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、氨芐西林、阿莫西林敏感，其他表現為耐藥。因此，臨床防治要選擇敏感藥物，并交叉輪換用藥，提高治療效果。

4 小結

綜上所述，副豬嗜血桿菌在豬場中都有存在，而有的豬場豬群會發病，有的豬群則不發病。且發現HPS 的致病機制尚不清楚，且存在多種血清型，各血清型之間缺乏免疫保護，發病菌血清型與疫苗血清型不同，造成疫苗免疫失敗。因此，針對本場疫情，應通過實驗室診斷找到具體的血清型，或者應用自家苗預防副豬嗜血桿菌感染。