番茄發酵液中乳酸桿菌的分離鑒定及對模擬胃腸液耐受性研究

覃志成，周笑犁*，吳承木，管慶林，耿瑞鴻，施英群

（1. 貴陽學院 食品科學與工程學院，貴州 貴陽 550005； 2. 貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州 貴陽 550005）

通過微生物發酵水果、蔬菜或其汁水制成的食用酵素產品，在能保留其原有的營養物質的基礎上，還能產生一些具有特定保健功能的活性物質[1]。目前食用酵素產品的生產主要有接種益生菌發酵和自然發酵兩種方式，其中，自然發酵利用果蔬本身附著及自然環境中的優勢菌進行發酵，雖然產生的風味更好，但發酵時間長，且參與菌種復雜難以掌控[2]。 因此，近年來從果蔬自然發酵液中分離并篩選具有益生活性的優勢菌種成了研究熱點，但根據原料選擇，其優勢乳酸菌菌種可能存在一定差異。如Taoxiong 等在酸菜中分離得到植物乳桿菌[3]；焦媛媛等從蘋果和梨的混合發酵液中分離得到植物乳桿菌和副干酪乳酸菌[4]；劉文俊等從自然發酵的橄欖汁中分離得到乳酸乳球菌[5]。 此外，趙山山等發現植物乳桿菌A50f7 和副植物乳桿菌A50b9 的耐膽鹽和耐鹽性能優良，且人工接種后能夠改善泡菜品質[6]。 因此，乳酸菌作為果蔬發酵過程的優勢菌群，對于提升果蔬發酵制品的品質及發揮益生功能具有較大的潛力。

番茄原產于南美洲，是全球種植最為普遍的果蔬之一，現在我國南北方均有廣泛種植。 研究發現，番茄及其制品中含有氨基酸、有機酸、礦物質、酚類化合物、 類胡蘿卜素和維生素等多種營養成分，具有降低血脂、降低膽固醇和抗氧化等功效[7-9]。 前期實驗發現，自然發酵后的番茄液具有良好的抗氧化活性，且總酚和番茄紅素等生物活性物質隨著發酵時間的延長而增加[10]，但細菌的多樣性卻逐漸減小，其中乳球菌豐度顯著減少，而乳酸桿菌的豐度顯著增加，到發酵60 d 時成為發酵液中主要優勢菌群[11]。乳桿菌作為一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌[12]，在各類發酵食品的品質形成中具有重要作用，在肉制品、乳制品及果蔬發酵食品領域中有著廣泛應用，也常被用作益生菌篩選的候選菌群。 但是，人體胃腸道的極端環境在很大程度上會影響乳酸菌的活性[13]，如果這些乳酸菌能夠通過腸胃消化系統，定植在人體的腸道中，才能真正發揮其生理功能[14]。因此，為了深入挖掘番茄自然發酵液中乳酸桿菌菌種資源并提高番茄等果蔬發酵液的穩定性，作者以乳酸桿菌為優勢菌的60 d 自然發酵番茄液為對象，對其中乳酸桿菌進行分離、鑒定，并研究其生長特性，模擬其對胃腸道環境的耐受性、高溫及高鹽的耐受性，以期為乳酸菌資源庫擴充以及果蔬酵素的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以新鮮番茄為原料，番茄與白砂糖質量比3∶1混勻后置于1 000 mL 已滅菌的玻璃瓶中，封口，發酵初期每隔1 d 排氣，發酵10 d 后每隔3 d 排氣，室溫發酵60 d 后制成發酵液[11]。

氯化鈉：購于江蘇強盛功能化學股份有限公司；磷酸二氫鉀：購于成都金山化學試劑有限公司；膽鹽、胰蛋白酶、胃蛋白酶：購于合肥博美生物科技有限責任公司；鹽酸：購于國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉：購于天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；MRS 培養基：購于杭州百思生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-1508BII 生化培養箱：天津市泰斯特儀器有限責任公司產品；CX21 顯微鏡、恒溫搖床：上海澤仕光電科技有限公司產品；UV2700 紫外分光光度計：日本島津儀器有限公司產品；DYY-8C 穩壓穩流電泳儀、T100 梯度PCR 儀、Biorad chemidoc XRS凝膠成像分析儀：美國BIO-RAD 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸桿菌的分離純化 取番茄發酵液樣品10 mL 溶解于100 mL 無菌生理鹽水中，并按10 倍梯度稀釋法制成6 個濃度稀釋液。取稀釋10-4，10-5，10-6倍的稀釋液0.1 mL 接種于MRS （含碳酸鈣）培養基中，37 ℃倒置培養24～36 h，挑取菌落劃線2~3次至菌落一致。

1.3.2 乳酸桿菌的鑒定

1）形態學觀察及革蘭氏染色 將所分離的菌株分別接種到MRS 瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養48 h。觀察菌株的菌落形態，白色、乳白色或淡黃色，中間隆起，菌落呈圓形，邊緣整齊，表面濕潤，易于挑起的菌株。 將分離得到的細菌進行革蘭氏染色實驗，觀察菌體顏色及形態，具有革蘭氏染色陽性、不運動、無芽孢、桿狀等特征的初步鑒定為乳酸桿菌[15]。

2）16S rDNA 序列分析 將疑似乳酸桿菌的菌株活化2 次至穩定期，送武漢天一輝遠生物科技有限公司進行菌株DNA 提取、PCR 擴增及16S rDNA序列測序。

3）系統發育樹構建 將測序得到的基因序列登錄NCBI 進行BLAST 同源性比對，并在MEGA7軟件中Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，應用自展法（bootstrap）檢驗系統發育樹，自展數據集為1 000 次。

1.3.3 乳酸桿菌的生長特性分析

1）最適生長溫度實驗 將體積分數1%的菌液接種到MRS 液體培養基中，搖勻，分別在26、30、34、38、42 ℃下培養12、24 h，測菌懸液OD600值，設置3 個平行，以未接種的培養基做對照。

2）最適生長pH 值實驗 將體積分數1%菌液接種至pH 值分別為5.4、6.0、6.6、7.2、7.8 的MRS 肉湯中，置于37 ℃下培養12、24 h，以未接種的培養基做對照，測定菌懸液的OD600值。

1.3.4 乳酸桿菌的耐受性分析

1）高溫耐受性實驗[16]將體積分數1%菌液接種到MRS 液體培養基中，搖勻，分別在42、46、50 ℃下培養12、24 h，以未接種的培養基作為對照，測定菌懸液OD600值，設置3 個平行，計算菌株存活率。

2）高鹽耐受性實驗[17]將體積分數1%菌液分別接種到鹽質量濃度分別為0、15、30、45、60 mg/mL的MRS 培養基中，37 ℃培養24 h，以未接種的培養基為空白對照，測定菌懸液OD600值，設置3 個平行，計算菌株存活率。

3）人工胃液耐受性實驗[18-19]配制胃蛋白酶濃度為10 mg/mL 的人工胃液，分別調節pH 值為2.0和3.0，0.22 μm 濾膜過濾除菌后備用。 然后取二次活化的菌液種，4 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液，用等體積無菌水重懸。 以體積分數10%分別接種至pH 2.0 和pH 3.0 的人工模擬胃液中，37 ℃下培養，分別于0、1、2 h 時取樣測定菌懸液OD600值，設置3 個平行，并計算菌株存活率。

4）人工腸液耐受性[18-19]取經人工胃液處理后的菌液，以體積分數10%接種至人工腸液中（3.4 g K2HPO4充分溶于250 mL 蒸餾水中，調節pH 值為7.6，稀釋后加入胰蛋白酶使其質量濃度達到10 mg/mL，最后0.22 μm 濾膜過濾除菌），37 ℃下培養，分別于0、1、2、4、6 h 時取樣測定菌懸液OD600值，設置3 個平行，計算菌株存活率。

5）膽鹽耐受性實驗[20]取用二次活化的菌種，將種子液以體積分數5%分別接種至不同膽鹽質量濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/dL）的MRS 液體培養基中，于37 ℃培養24 h，測定菌懸液OD600值，設置3 個平行，并計算菌株存活率。

式中：Y 為菌株存活率，%；A1為處理后菌懸液吸光度；A0為處理前菌懸液吸光度。

1.4 數據統計分析

每組試驗重復3 次，采用IBM SPSS 22.0 進行統計分析，數據用平均值±標準差表示，使用Duncan等多重方法對數據進行比較，以P<0.05 作為差異顯著性判斷標準，最后用Graph pad Prism v8.0 進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 乳酸桿菌的分離鑒定

2.1.1 形態學觀察和革蘭氏染色 從番茄自然發酵液中分離得到3 株疑似乳酸桿菌的菌株，分別命名為L1、L2 和L3。3 株菌的菌落均突起，呈圓形，濕潤光滑，邊緣齊整，見表1。 對菌株分別進行革蘭氏染色，均為陽性（G+），無芽孢。 L2 呈短桿狀，成對或堆狀排列；L1 和L3 均為單生或鏈狀排列。圖1 中分別顯示了3 株菌的菌落及菌體形態。

表1 菌體及細胞形態特征Table 1 Colonies and cell morphological characteristics

圖1 細胞形態特征Fig. 1 Cell morphological characteristics

2.1.2 16S rDNA 序列分析 對分離并經過形態學初步鑒定疑似乳酸桿菌的菌株進行DNA 提取，然后對16S rDNA 基因序列進行PCR 擴增。 如圖2 所示，3 株菌株的瓊脂糖電泳條帶明亮且無明顯拖尾，相對分子質量均在1 500 bp 左右，符合測序要求。

圖2 16S rDNA 擴增電泳圖Fig. 2 Amplification of 16SrDNA

將測序結果輸入NCBI 中進行BLAST 同源性比對，結果如圖3。 L1 和L3 均為植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus），其中L1 與Lactiplantibacillus plantarum Heal19 菌 株 同 源 性 為100% ，L3 與Lactiplantibacillus plantarum SRCM100440 菌株同源性為100%。L2 為乳桿菌屬（Lactobacillus brevis），且與Lactobacillus brevis LMT1-73 菌株同源性為100%。國立東等從東北酸菜中分離篩選到1 株乳酸菌，經分析鑒定為植物乳桿菌，并命名為HUCM115[21]。焦媛媛等從梨和蘋果混合發酵液中分離得到植物乳桿菌ZG2 和副干酪乳桿菌，從梨和香蕉混合發酵液和木瓜發酵液中分離出魏斯氏菌，在檸檬中分離出明珠串菌[4]。 趙山山等以貴州遵義市11 份不同家庭自制的發酵泡菜制品分離得到5 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），6 株 副 植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus paraplantarum）[6]。 說明在果蔬發酵過程中，乳酸菌為主要菌種，且隨著發酵原料的不同，其種屬存在一定差異。

圖3 基于16S rDNA 序列系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence

2.2 乳酸桿菌的生長特性分析

2.2.1 最適生長溫度 乳酸菌的生長受環境中溫度影響較大，且不同乳酸菌的最適生長溫度存在一定差異。 圖4~5 中不同小寫字母表示同一菌株不同生長溫度之間存在顯著性差異（P＜0.05）。 如圖4，在不同溫度下分別培養12 h 和24 h 后，3 株受試菌的OD600均隨著溫度的增加呈現先增加后降低的趨勢，且3 株菌變化趨勢相似，均在30~38 ℃生長較好。其中，L3 培養12 h 和24 h 最適生長溫度均為38℃；L1 培養12、24 h 時最適生長溫度分別為34 ℃（P>0.05）和38 ℃（P<0.05）；而L2 培養12、 24 h 時分別為38 ℃（P>0.05）和34 ℃（P<0.05）。 楊英歌等發現自然發酵泡菜中的副干酪乳桿菌HLAB0143的最適生長溫度在35~37 ℃[22]，與本實驗結果相近，本實驗中分離得到的3 株菌的適宜生長范圍更寬，但各自最適生長溫度略有差異，當溫度超過38 ℃后，菌液OD600均顯著下降（P<0.05），這可能是由于菌體蛋白質等受到破壞或菌體對營養物質的吸收能力下降所致。

圖4 乳酸桿菌在不同溫度下12 h 后的生長情況Fig. 4 Growth of Lactobacillus at various temperature

2.2.2 最適生長pH 微生物在最適pH 其新陳代謝可處于最佳狀態，并促進代謝產物的積累[22]。如圖5 所示，3 株菌株在不同pH 下培養12 h 和24 h 后，OD600隨pH 的增加呈現先增加后顯著減少的趨勢，且3 株菌的變化趨勢相近。 其中，L1 在pH 6.6 條件下培養12 h 和24 h 后，其OD600顯著高于其他各組（P<0.05）；L2 在pH 6.6 條 件 下 培 養12 h 和24 h后，其OD600最高，但與pH 6.0 組差異不顯著（P>0.05）；L3 仍然是在pH 6.6 條件下，OD600達到最大（P<0.05），但在培養初期（12 h）時，其OD600與pH 6.0 組差異不顯著（P>0.05）。 因此，3 株乳酸桿菌生長的最適pH 均為6.6，說明弱酸性環境適宜番茄發酵液中分離的乳酸桿菌生長，pH 過高可能會影響菌體的酶活、細胞膜穩定性等，進而阻礙菌體的生長。 儲徐建等從青貯玉米中分離出植物乳桿菌的最適生長pH 為6.5[23]；楊靜等人的乳酸菌生長實驗表明，植物乳桿菌在pH 為5.5~7.0 時生長較好[24]。

圖5 乳酸桿菌在不同pH 值的生長情況Fig. 5 Growth of Lactobacillus at various pH

2.3 乳酸桿菌的耐受性分析

2.3.1 高溫耐受性 如圖6 所示，3 株菌在高溫環境下培養12 h 和24 h 后，存活率隨培養溫度的持續升高呈現快速下降的趨勢（P<0.05）。圖6~10 中大寫字母不同表示同一條件下不同株菌之間存在顯著性差異；小寫字母不同表示同一株菌在不同條件下存在顯著性差異（P＜0.05）。當溫度超過46 ℃時，3株菌的存活率受到顯著抑制（P<0.05），說明溫度升高對3 株菌的生長均起到了顯著的抑制作用；尤其L2 生長受到的抑制最強，說明L2 對該溫度具有較強的敏感性，而L3 仍能保持一定的存活率，說明L3比其他2 株菌具有更好的高溫耐受性。 方芳等在內蒙古傳統發酵乳及酸菜湯中分離出一株乳腸球菌WH29-3-1，發現其在45 ℃下仍能保持較高活性，并產生具有較高活性的耐熱蛋白酶[25]；李志忠等從玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離出的類干酪副乳桿菌LB-3 對50 ℃的高溫有一定耐受能力[16]。 本實驗中L1 和L3 對46~50 ℃高溫的耐受能力強于L2，說明不同乳酸桿菌的高溫耐受能力存在一定的差異，可能與不同菌株的生理功能差異有關。

圖6 乳酸桿菌的高溫耐受性Fig. 6 High temperature tolerance of Lactobacillus

2.3.2 高鹽耐受性 在傳統的發酵生產中，為了保證產品的安全性和貨架期，往往需要加入大量的食鹽。 因此，乳酸菌需要對發酵過程中的高鹽環境具有一定的耐受能力。如圖7 所示，3 株菌在不同鹽質量濃度下培養24 h 后，存活率隨著鹽質量濃度的增加而逐漸較少。 當鹽質量濃度超過15 mg/mL 后，3株菌的存活率明顯下降（P<0.05），當鹽質量濃度達到60 mg/mL 時，L1 和L3 的存活率分別為75.84%和71.92%，而L2 的生長受到了顯著的抑制，其存活率僅有11.34%。說明3 株乳酸桿菌對高鹽質量濃度均具有一定的耐受性，其中L1 的耐受性在鹽質量濃度超過15 mg/mL 時最好 （P<0.05），L3 的耐受性也顯著優于L2（P<0.05）。 付文雯等發現發酵乳中分離出的2 株乳酸桿菌均能在40 mg/mL 的高鹽質量濃度下生長[17]，本實驗中3 株菌的耐受性與之相似，但L1 和L3 還能耐受60 mg/mL 的高鹽質量濃度；但L2 的耐受力低于楊靜等發現的植物乳桿菌D28，其在0~80 mg/mL 的高鹽環境下仍可生長[24]。

圖7 乳酸桿菌高鹽耐受性Fig. 7 High salt tolerance of Lactobacillus

2.3.3 人工胃液耐受性 人的胃液pH 值在1.5～4.5，且其pH 因食物攝入不同而波動。 乳酸菌只有具備良好的胃腸道環境耐受性能，才能更好地發揮其益生功能[26]。 如圖8 所示，在人工胃液pH 2.0 條件下培養2 h 后，3 株菌的存活率均不低于96%，且與培養1 h 后各組的存活率差異不顯著 （P>0.05）；而在pH 值3.0 的條件下培養2 h 后，3 株菌的存活率均大于100%，其中L3 顯著高于培養1 h 后的存活率 （P<0.05），并且顯著高于L1 和L2 的存活率（P<0.05）。 說明3 株菌對人工胃液環境中較低pH值、胃蛋白酶等具有一定的適應能力，為其益生功能特性的研究提供了可能。 研究者發現從香腸中分離出的植物乳桿菌對人體胃消化液3 h 后具有良好的耐受性，與本實驗結果類似[26-27]；而楊靜等發現植物乳桿菌D28 在人工胃液（pH 2.0）消化2 h 后存活率低于60%[24]，較本實驗結果低；說明本實驗從番茄發酵液中分離得到的乳酸桿菌，尤其是L3 具有較好的人工胃液耐受能力。

圖8 乳酸桿菌人工胃液耐受性Fig. 8 Artificial gastric juice tolerance of Lactobacillus

2.3.4 人工腸液耐受性 小腸內的pH 一般在7.6左右，食物在小腸內會停留3~8 h[28]，因此益生菌要發揮益生功能，需要能耐受腸液中胰蛋白酶、膽鹽等。 作者分離所得的3 株乳酸桿菌對腸液的耐受能力見圖9。 隨著3 株菌在人工腸液中培養時間的延長，其存活率逐漸下降，其中L1 和L2 在腸液環境4 h 內的存活率差異不顯著 （P>0.05）；6 h 時，L1、L2和L3 存活率下降，但仍不低于90%。 劉珊娜等從酸菜中分離5 株乳桿菌在腸液中培養4 h 的存活率為89%~100%[29]，與本實驗結果相似；龍峻瑤等探究六堡茶渥堆發酵過程中乳酸菌多樣性發現，戊糖乳桿菌L131 在人工腸液中的存活率為77%[30]，較作者分離得到乳酸桿菌的存活率低；可能是由于原料的不同，對菌株的種屬和耐受特性也會有差異。 證明3株乳酸桿菌具有較好人工腸液耐受性，可能在與食物一同食用后能夠保持一定的存活率并發揮其益生功能。

圖9 乳酸桿菌人工腸液耐受性Fig. 9 Tolerance of Lactobacillus in artificial intestinal fluid

2.3.5 膽鹽耐受性 機體腸道中膽鹽質量濃度一般為0.03~0.30 g/dL，因此乳酸菌等菌株要進入腸道定殖并發揮作用，除要具有良好的耐胃腸道酶系消化能力外，還應具有一定的膽鹽耐受能力[26]。 如圖10所示，3 株菌的存活率均隨膽鹽質量濃度的增加而呈顯著下降（P<0.05）。 當膽鹽質量濃度為0.03 g/dL時，L1、L2 和L3 的存活率分別為59.55%、85.31%和44.45%； 膽鹽質量濃度為0.03~0.12 g/dL 時，L2 的存活率均顯著高于L1 和L3（P<0.05）；而膽鹽質量濃度達到0.15 g/dL 時，3 株菌的存活率≤3.3%，這說明高質量濃度的膽鹽顯著抑制了乳酸桿菌的生長。 這同王翔宇等的研究相似，菌株的存活率均隨著膽鹽質量濃度的增加而下降[17]。 而從發酵牦牛乳中分離的植物乳桿菌在膽鹽濃度濃度0.15 g/dL 以內均保持了較高的存活率[18]；發酵香腸源乳酸菌在5 mg/mL 的高膽鹽環境中培養4 h 后的存活率可高達91.45%[26]； 自然發酵泡菜中分離的乳酸菌在0.3%膽鹽溶液培養3 h 后其存活率依然可維持在60%[12]。 本實驗分離得到的3 株乳酸桿菌具有一定的膽鹽耐受性，其中L2 的耐受性更好，但都弱于泡菜、 發酵香腸或牦牛乳中乳酸桿菌的膽鹽耐受力，這可能與菌株功能特性及種類有關，本實驗為后續乳酸菌的功能特性及生產應用研究提供了理論基礎。

圖10 乳酸桿菌膽鹽耐受性Fig. 10 Bile salt tolerance of Lactobacillus

3 結 語

作者從60 d 自然發酵的番茄液中分離得到3株乳酸桿菌，其中L1 和L3 株菌均為植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）：L1 與Lactiplantibacillus plantarum Heal19 的 菌 株 同 源 性 為 100% ，L3 與Lactiplantibacillus plantarum SRCM100440 的菌株同源性為100%； 而L2 為乳桿菌屬（Lactobacillus brevis），且與Lactobacillus brevis LMT1-73 的菌株同源性為100%。生長特性實驗表明，L3 最適生長溫度是38 ℃； 培養12 h 和24 h 時，L1 最適生長溫度分別為34 ℃和38 ℃，而L2 分別為38 ℃和34 ℃；3株菌的最適生長pH 值均為6.6。耐受性研究發現，3株菌對高溫、高鹽及人工胃腸環境均具有一定的耐受性，其中，L2 具有較好的膽鹽耐受性，L1 和L3 具有較好的高鹽耐受性，L3 具有良好的高溫耐受性；3株乳酸桿菌尤其是L3 對人工胃液環境具有良好的耐受能力，存活率均高于96%，在人工腸液環境下3株菌的存活率超過90%，尤其L1 表現出更好的穩定性。 這對它們益生功能的發揮具有潛在影響，研究結果可為果蔬發酵劑的研制及其發酵制品的開發提供參考。 此外，后續實驗還需進一步關注真實胃腸環境中還存在的基礎代謝、腸道菌群和腸道蠕動等多方面復雜因素的影響及益生功能的特性，以期為可定植胃腸環境的功能乳酸桿菌資源開發提供理論支撐。