繼代培養對靈芝胞外酶活力及品質的影響

周 州，宋 怡，羅 舒，姚 珂，羅 霞，許曉燕

（四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，始載于《神農本草經》，我國在20 世紀50 年代首先成功實現了野生靈芝的馴化栽培。在栽培過程中，為滿足自身生長發育的需求，靈芝菌絲需將木材等基質中的纖維素、木質素、蛋白質等大分子物質分解為小分子的營養物質，從而進行吸收和轉化，這一分解利用和轉化過程與菌絲分泌的胞外酶活性緊密相關。

近年來，隨著靈芝成為我國受眾最廣、市場接受度最高的食藥用菌之一，靈芝栽培在我國迅速發展，年產量已達約12 萬t，靈芝產業年產值超百億元[1]。 隨著靈芝產業規模化發展，繼代培養在靈芝菌種保藏和擴繁中頻繁使用，導致生產用靈芝菌種退化，造成靈芝減產，質量問題多發。 因此，深入研究菌種繼代培養對靈芝菌絲胞外酶活力變化規律的影響，明確胞外酶活與靈芝產量和品質的相關性非常必要。

目前關于靈芝栽培技術的研究主要集中在高產菌種選育[2-5]、栽培基質篩選[6-8]、栽培技術[9]等方面，尚未見菌種繼代培養對靈芝胞外酶活力及品質影響的深入研究報道。 作者通過靈芝菌種連續繼代培養，研究傳代次數對菌絲胞外酶活力的影響，探討胞外酶活力與子實體產量和品質之間的相關性，為靈芝高產、高質栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

LDZX-30KBS 型立式蒸汽壓力滅菌器：上海申安醫療器械廠產品；RTOP 型人工氣候箱：浙江托普儀器有限公司產品；MODULYOD-230 型冷凍干燥機：賽默飛世爾科技公司產品；AL104 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；5810R 型臺式冷凍離心機：德國艾本德公司產品；2802S 型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；Waters 1525 高效液相色譜儀：美國Waters 公司產品。

1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養基：購自北京奧博鑫生物技術有限責任公司；總蛋白質定量測定試劑盒（考馬斯亮藍法）：購自南京建成生物工程研究所；2，2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和木聚糖：購自Sigma公司；齊墩果酸對照品和D-無水葡萄糖對照品：購自中國食品藥品檢定研究院； 靈芝酸A 對照品、靈芝酸D 對照品：靈芝酸F 對照品、靈芝烯酸A 對照品、靈芝烯酸D 對照品：均購自成都普思生物科技股份有限公司；木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰：購自農資市場；乙腈，色譜純：購自安徽天地高純溶劑有限公司；硫酸、蒽酮等：國產分析純，購自成都科隆化學品有限公司。

1.3 供試菌株

靈芝菌株由四川省中醫藥科學院菌類藥材系統研究與開發實驗室保藏和提供。

1.4 供試培養基

1.4.1 PDA 綜合培養基 PDA 培養基37 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、蒸餾水1 L。

1.4.2 菌袋培養料 木屑質量分數20%、棉籽殼質量分數55%、玉米芯質量分數15%、麥麩質量分數9%、石灰質量分數1%，水質量分數60%~65%，pH 5~6。 棉籽殼和玉米芯預濕24 h 后，加入木屑和麥麩，混合均勻，并堆料發酵3 d，摻入石灰拌勻，選用17 cm× 33 cm×0.05 cm 的聚丙烯袋，每袋裝濕料0.8 kg，121 ℃高壓滅菌3 h。

1.5 方法

1.5.1 菌種繼代培養 將靈芝菌種（F0）接于PDA綜合培養基斜面上，置于24 ℃人工氣候箱中培養至菌絲長滿斜面，記為F1；繼續將菌種F1接于PDA 綜合培養基斜面上，培養至菌絲長滿斜面，記為F2；以此類推繼代接種培養，并依次編號F3、F4、…、F11、F12。

1.5.2 栽培管理 將靈芝菌種F0至F12分別接種于菌袋培養料中，置于25 ℃人工氣候箱中培養，濕度65%，每代菌種接40 個菌袋。

1.5.3 菌絲胞外酶活測定

1）粗酶液制備 靈芝菌絲長滿菌袋后，每代菌種各取20 個菌袋。 取上層5 cm 基質，冷凍干燥后低溫粉碎過20 目篩，混合均勻后取適量基質粉末，按質量體積比1∶10 加入蒸餾水或提取液，40 ℃恒溫水浴浸提2 h，8 000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶液[10]。

2）酶活測定 采用Bradford 法測定粗酶液中的蛋白質含量[11]；采用ABTS 法測定漆酶活力[12]，將每毫克蛋白質每分鐘氧化1 μmoL 底物ABTS 所需的酶量定義為一個酶活力單位；采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定濾紙酶、纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶活力[13-16]，將每毫克蛋白質每分鐘催化產生1 mg 葡萄糖所需的酶量分別定義為一個濾紙酶、纖維素酶和淀粉酶酶活力單位；每分鐘催化產生1 μmol 木糖所需的酶量定義為一個木聚糖酶酶活力單位。

1.5.4 產量和質量分析

1）出芝管理及子實體采收 靈芝菌絲長滿菌袋后，每代菌種各取20 個菌袋，置于27 ℃人工氣候箱中出芝培養，濕度80%，光照800 lx。 子實體成熟后采收，置于50 ℃干燥箱中干燥，備用。

2）干基生物學效率測定 測定每袋靈芝子實體質量，計算干基生物學效率。

式中：W 為干基生物學效率，%；m1為每袋子實體干品質量，g；m2為每袋干培養料質量，g。

3）品質評價 觀察子實體形態，測定大小；采用熱浸法[17]測定子實體的浸出物質量分數；采用硫酸蒽酮法[18]測定子實體多糖質量分數；采用齊墩果酸法[17]測定子實體三萜及甾醇質量分數；參照張景麗等[19]的方法測定子實體靈芝酸質量濃度。

1.5.5 數據統計 采用SPSS 26.0 軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 繼代培養對菌絲胞外酶活的影響

靈芝菌絲通過分泌纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等降解酶分解基質中的纖維素、木質素等糖類營養物質，用于滿足生長代謝需要。 由圖1 可知，纖維素酶、漆酶、濾紙酶和淀粉酶的活力隨著靈芝菌種繼代培養次數的增加而降低。 由于這些降解酶酶活力的下降，大分子營養物質的分解利用和轉化能力降低，菌絲生長速度減慢，濃密度減弱，對外界環境污染的抵抗力下降。 菌絲胞外木聚糖酶的酶活力未隨菌種繼代培養次數的增加而變化，但整體酶活力較低。

圖1 菌種繼代培養對菌絲胞外酶活力的影響Fig. 1 Effects of subculture on extracellular enzyme activity of mycelium

2.2 繼代培養對靈芝產量、品質的影響

如表1~3，通過干基生物學效率和成分測定可以發現，菌種繼代培養次數不影響子實體三總萜及甾醇質量分數。 但隨著繼代培養次數的增加，靈芝干基生物學效率下降，子實體形態由大變小，出現分枝、原基不開片等現象，多糖和浸出物質量分數降低，靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝烯酸A、靈芝烯酸D 質量濃度降低。 可見，繼代培養對靈芝產量和品質影響較大。

表1 菌種繼代培養對靈芝形態大小與干基生物學效率的影響Table 1 Effects of subculture on morphological size and biological efficiency of G. lucidum

表2 菌種繼代培養對靈芝浸出物、多糖和三萜及甾醇質量分數的影響Table 2 Effects of subculture on contents of extract，polysaccharide，triterpene and sterol of G. lucidum

表3 菌種繼代培養對靈芝酸質量濃度的影響Table 3 Effect of subculture of strain on content of ganoderma acid

2.3 胞外酶活與靈芝產量和質量的相關性分析

為考察不同胞外酶活對靈芝產量和質量的影響，采用SPSS 26.0 軟件對靈芝菌種繼代培養過程中的5 種胞外酶酶活力與所得靈芝子實體的干基生物學效率、 浸出物質量分數、 多糖質量分數等9個指標進行Peaeson 相關性分析。結果如表4 所示，纖維素酶、漆酶、濾紙酶和淀粉酶的酶活力與靈芝子實體干基生物學效率 （產量指標） 及浸出物、多糖、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝烯酸A 和靈芝烯酸D 質量濃度等7 個靈芝質量指標呈極顯著正相關（P<0.01），與三萜及甾醇質量分數的相關性不顯著（P>0.05）。 木聚糖酶酶活力與靈芝子實體質量分數指標和質量指標的相關性不顯著（P>0.05）。

表4 胞外酶活與靈芝產量和質量的Peaeson 相關性分析Tabel 4 Peaeson analysis of correlation between extracellular enzyme activity and yield and quality of G. lucidum

2.4 胞外酶活與靈芝品質的通徑分析

相關性分析可以解釋胞外酶活與靈芝品質之間的直接關系，但對不同胞外酶之間相互作用對靈芝產量和質量的影響沒有直觀表現。 作者在分析胞外酶活與靈芝品質相關性基礎上，采用通徑分析進一步研究不同胞外酶活的相互作用對靈芝品質的效應大小。

分別以靈芝品質指標——干基生物學效率、浸出物質量分數、多糖質量分數、三萜和甾醇質量分數、靈芝酸A 質量濃度、靈芝酸D 質量濃度、靈芝酸F 質量濃度、靈芝烯酸A 質量濃度和靈芝烯酸D 質量 濃 度 為 因 變 量Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8和Y9，纖維素酶、漆酶、濾紙酶、淀粉酶和木聚糖酶酶活力為自變量X1、X2、X3、X4和X5，采用偏回歸分析法建立Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8和Y9的最優多元回歸方程 （剔除偏回歸系數不顯著的自變量），分別為Y1=2.803+0.007X2+4.159X3（F=424.148，P<0.001），Y2=3.022+0.001X2+0.010X2+1.523X4（F=156.063，P<0.001），Y3=-0.022-0.004X2+5.425X3（F=135.340，P<0.001），Y4=-0.650-5.886×10-5X1+0.010X2-2.510X5（F=3.734，P<0.1），Y5=-13.221+0.042X2+4.999X4+81.230X5（F=82.850，P<0.001），Y6=-1.665+0.015X2+0.861X4（F=89.848，P<0.001），Y7=-0.468-0.001X1+0.003X2+4.578X3（F=217.878，P<0.001），Y8=-0.164+0.001X1+0.004X2（F=102.328，P<0.001），Y9=-1.717+0.004X2+0.605X4+7.487X5（F=169.466，P<0.001），除Y4（三萜和甾醇質量分數）外，其余8 個方程的顯著性檢驗表明具有顯著差，進一步做通徑分析。

由表5 可見，與干基生物學效率（Y1）的簡單相關性中，自變量濾紙酶（X3）大于漆酶（X2），直徑和間接通徑作用X3＞X2，同時兩個變量的直徑和間接通徑系數均為正值，說明漆酶和濾紙酶對靈芝干基生物學效率均表現為正效應，栽培基質中的漆酶和濾紙酶活力高時，將增加靈芝干基生物學效率。 決策系數是通徑分析中的決策指標，用于自變量對因變量的綜合作用進行排序，確定主要決策變量和限制變量[20-21]。 自變量X3對Y1的決策性大于X2，說明濾紙酶變量對Y1的綜合作用是最大的，這種影響效應包括直接作用以及與其他胞外酶的協同作用。

表5 以干基生物學效率為因變量的通徑分析Tabel 5 Path analysis with biological efficiency of fruiting body as dependent variable

由表6 可見，與浸出物質量分數（Y2）的簡單相關性中，3 個自變量與Y2的相關性系數X1＞X4＞X2，直徑通徑作用的系數X4＞X1＞X2；分析各間接通徑系數可知，3 個變量的間接通徑系數均為正值，且X4＞X1＞X2（0.791＞0.653＞0.377），同時，X4對Y2的決策系數最高為0.895，由此可知X4對Y2的綜合作用最大，說明淀粉酶對靈芝浸出物質量分數有最大影響。

表6 以浸出物質量分數為因變量的通徑分析Tabel 6 Path analysis with extract content as dependent variable

由表7 可見，與多糖質量分數（Y3）的簡單相關性中，2 個自變量與Y3的相關性系數X3＞X2（0.966＞0.791），直徑通徑作用的系數X3＞X2，其中X2與Y3的直接通徑系數和間接通徑系數分別為-0.436、-0.391，X2對Y3綜合作用表現抑制；濾紙酶對靈芝多糖質量分數的綜合影響最大。

靈芝酸類成分是靈芝的主要功效成分，其中靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝烯酸A、靈芝烯酸D 是常見的靈芝酸，常用于靈芝質量檢測[22-26]。 由表8 可知，與靈芝酸A 質量濃度（Y5）的簡單相關性中，3 個自變量與Y5的相關性系數X2＞X4＞X5；直接和間接通徑作用的系數X4＞X2＞X5； 決策系數X4＞X2＞X5，表明X4對Y5的綜合作用影響較大。 對間接通徑作用 分 析 可 知，X4通 過X2、X5分 別 對Y5的 作 用 為0.494、-0.051，表明淀粉酶與漆酶的交互對提升靈芝酸A 具有正相關影響，淀粉酶通過木聚糖酶的間接作用對靈芝酸A 質量濃度有抑制作用。

由表9 可見，與靈芝酸D（Y6）的簡單相關性中，自變量漆酶（X2）大于濾紙酶（X4），直接和間接通徑作用均X2＞X4，同時兩個變量的間接通徑系數均為正值，說明漆酶和淀粉酶對靈芝酸D 質量濃度均有影響。其中漆酶對靈芝的靈芝酸D 質量濃度的綜合影響最大，表明提高栽培基質中的漆酶活力，能夠提升靈芝酸D 質量濃度。

表9 以靈芝酸D 質量濃度為因變量的通徑分析Tabel 9 Path analysis with ganoderic acid D content as dependent variable

由表10 可見，與靈芝酸F（Y7）的簡單相關性中，3 個自變量與Y7的相關性系數X3＞X2＞X1，直徑通徑作用的系數X3＞X2＞X1，其中X1對Y7直接通徑作用和間接通徑作用均為負值，這表明X1對Y7的直接通徑作用和間接通徑作用呈現負影響，而X2和X3對Y7的綜合影響呈正向性。

表11 表明纖維素酶對靈芝烯酸A 質量濃度的綜合影響最大。

表11 以靈芝烯酸A 質量濃度為因變量的通徑分析Tabel 11 Path analysis with ganoderentic acid A content as dependent variable

由表12 可見，與靈芝烯酸D 質量濃度（Y9）的簡單相關性中，3 個自變量與Y9的相關性系數、直接通徑和間接通徑作用的系數排序均為X4＞X2＞X5。其中X2對Y5的綜合作用呈正相關，表明漆酶可能是影響靈芝烯酸D 的重要因素，在提高以靈芝烯酸D 為品質提升的目標中應著重把握； 間接通徑作用分析可知，X4通過X2、X5分別對Y5的作用為0.405、-0.042，表明淀粉酶與漆酶的交互對提升靈芝烯酸D 具有正相關影響，淀粉酶通過木聚糖酶的間接作用對靈芝烯酸D 質量濃度有呈抑制作用，但負影響較小，同時由決策系數大小為X4＞X2＞X5可知，X4對Y5的綜合作用影響較大，表明淀粉酶對提升靈芝的靈芝烯酸D 質量濃度具有重要影響。

表12 以靈芝烯酸D 質量濃度為因變量的通徑分析Tabel 12 Path analysis with ganoderentic acid D content as dependent variable

3 結 語

食藥用菌在菌絲生長階段，通過分解基質內的纖維素、木質素等來合成、儲存子實體發育所需的能量物質[27]，胞外酶酶活力的強弱常能反映出菌絲生理生化的活躍程度，影響食藥用菌生長發育[21]。通過對靈芝菌種繼代培養過程中胞外酶活力、靈芝子實體產量與質量的測定，發現菌種連續繼代培養會引起漆酶、濾紙酶、纖維素酶和淀粉酶的酶活力降低，進而減少靈芝子實體產量，引起靈芝品質下降，與斑玉蕈[28]、真姬菇[29]、草菇[30]、蠶花[31]等食藥用菌的研究結果相似。

為進一步研究胞外酶酶活力與靈芝子實體品質之間的關系，作者在分析漆酶、濾紙酶等胞外酶酶活力與靈芝干基生物學效率、浸出物、多糖等品質指標的相關性基礎上，采用逐步線性回歸法進行通徑分析。 結果發現，纖維素酶、漆酶、濾紙酶和淀粉酶的酶活力與靈芝子實體產量及浸出物、 多糖、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝烯酸A 和靈芝烯酸D 質量濃度呈極顯著正相關，但與三萜及甾醇質量分數相關性不顯著；通徑分析進一步表明，濾紙酶是影響靈芝產量及多糖質量分數、靈芝酸F 質量濃度的關鍵胞外酶，纖維素酶是影響靈芝烯酸A 質量濃度的關鍵胞外酶。

綜上所述，隨著靈芝菌種繼代培養次數的增加，基質中主要胞外酶酶活力降低，進而降低靈芝子實體產量和品質。 因此，在實際生產中，為獲得高產、優質的靈芝子實體，應將靈芝菌種繼代培養次數控制在5 代以內。 同時，鑒于濾紙酶、纖維素酶等胞外酶與靈芝品質之間的相關性，還可以通過調節栽培溫度、改良基質配方等技術手段，提升濾紙酶、纖維素酶等胞外酶酶活力，以達到提產增質的目的。