復合除油微生物菌劑的油脂去除特性

凌 玲，李秀芬*

（1. 江南大學 環境科學與工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省 厭氧生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇省 水處理技術與材料協同創新中心，江蘇 蘇州 215009）

隨著我國國民經濟的快速發展及人們對美好生活的追求，餐飲業規模不斷擴大，同時，餐廚垃圾的產生量也以每年10%的速度持續增長[1]。 餐廚垃圾含有高濃度的有機質、油脂和鹽，且含水率較高，若不及時處理，易腐敗酸化，滋生蚊蠅，污染周邊環境[2]。 目前，餐廚垃圾的處理以生物方法為主，主要包括厭氧消化和好氧堆肥兩種。 與好氧堆肥技術相比，餐廚垃圾厭氧消化的周期較長、啟動較慢、衛生環境條件較差，且會產生大量溫室氣體，因此餐廚垃圾好氧堆肥處理近年來引起了研究人員的廣泛關注[3]。 好氧堆肥過程不僅可消除餐廚垃圾帶來的環境污染，所得堆肥產物還可用作土壤有機肥，實現餐廚垃圾的無害化、資源化和減量化，同時還能減少處理過程中的碳排放，有利于固體廢物處理向碳中和模式演變，有助于生態文明建設，具有較為重要的現實意義。

油脂是餐廚垃圾的主要組成成分之一，在好氧堆肥過程中較難降解/轉化，添加微生物菌劑可大大提高其轉化效果，有利于提高堆肥產品的腐熟度及品質。 有研究人員在25 ℃條件下，從皮革廢水中篩選得到了4 株油脂降解菌，將其固定化后，該菌劑最高除油率可達86.1%[4]。王亞軍等將銅綠假單胞菌以體積分數6%接種到含油脂3 g/L 的培養基中，30 ℃條件下培養3 d，發現油脂去除率達到55.37%[5]。 盧永昌等發現，萵苣不動桿菌對體積分數2%花生油的去除率可達95.7%，此后，隨著油脂質量濃度的升高，油脂降解率降低[6]。 Awasthi 等將短芽芽孢桿菌、農業短桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌進行復配，其對油脂的去除率為65.47%[7]。肖翰等將黏至沙雷氏菌接種到病死豬堆肥的堆體中，發現接種體積分數1.0%和1.5%的效果優于0.5%，最終油脂體積分數可降低到15%[8]。

作者以所在實驗室自行保藏的4 個微生物菌株為油脂降解菌，通過等比例復配獲得了所用復合除油微生物菌劑，研究了溫度、pH、含鹽量、油脂質量濃度及接種體積分數對除油菌生長及除油效果的影響，進一步研究了組成菌株產脂肪酶的能力，以期擴大油脂降解的菌種庫資源，提高餐廚垃圾或餐廚廢水中油脂的生物轉化效率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

復合除油微生物菌劑的組成菌株：均為作者所在實驗室保藏菌株，編號分別為005、009、B409 和B501。 其中菌株005 細胞呈桿狀，革蘭氏陽性，好氧或兼性厭氧，在營養肉湯培養基（LB）上的菌落呈淡黃色，表面光滑濕潤凸起，邊緣光滑，易挑起；菌株009 細胞呈棒狀，革蘭氏陽性，產芽孢，兼性厭氧，在LB 培養基上的菌落呈乳白色，表面粗糙擴展干燥，邊緣假根狀，不易挑取；菌株B409 細胞呈棒狀，革蘭氏陽性，產芽孢，好氧，菌落呈乳白色，半透明顆粒狀，邊緣整齊，表面光滑濕潤；菌株B501 細胞呈短桿狀，革蘭氏陽性，產芽孢，好氧，菌落呈淡黃色，不透明，表面光滑濕潤，邊緣整齊，凸起，易挑起。

1.2 實驗方法

將上述4 個菌株分別接種至裝有牛肉膏蛋白胨培養基的搖瓶中，pH 7.0、30 ℃和160 r/min 的條件下振蕩培養，每隔12 h 測定一次OD600，待OD600不再變化時，即分別獲得4 個菌株的種子液，將4個菌株的種子液按體積比1∶1∶1∶1 比例混合，即獲得本研究用復合除油菌劑。

1.2.1 溫度對除油菌生長及油脂去除的影響 取體積分數5%的上述復合除油菌劑，投加至裝有100 mL 模擬含油廢水的三角瓶中，在溫度為25、35、45、55 ℃的條件下，研究溫度對模擬含油廢水的OD600、菌體質量濃度、乳化油脂能力和油脂去除率的影響。 模擬含油廢水的組成為：（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5.0 g，酵母提取物1 g，蒸餾水1 000 mL，大豆油10 g。

1.2.2 pH 對除油菌生長及油脂去除的影響 取體積分數5%的上述復合除油菌劑，投加至裝有100 mL 模擬含油廢水的三角瓶中，用0.1 mol/L 的HCl 和NaOH 調節pH 分別至4、5、6、7、8、9，研究pH 對模擬廢水的OD600、菌體質量濃度、乳化油脂能力和油脂去除率的影響。

1.2.3 NaCl 質量濃度對除油菌生長及油脂去除的影響 取體積分數5%的上述復合除油菌劑，投加至裝有100 mL 模擬含油廢水的三角瓶中，調整NaCl 質量濃度分別至10、30、50、70、90 g/L，研究NaCl 質量濃度對模擬廢水的OD600、菌體質量濃度、乳化油脂能力和油脂去除率的影響。

1.2.4 油脂質量濃度對除油菌生長及油脂去除的影響 取體積分數5%上述復合除油菌劑，投加至裝有100 mL 模擬含油廢水的三角瓶中，用大豆油調整油脂質量濃度分別至10、20、30、40、50 g/L，研究油脂質量濃度對模擬廢水的OD600、 菌體質量濃度、乳化油脂能力和油脂去除率的影響。

1.2.5 接種體積分數對除油菌生長及油脂去除的影響 取體積分數分別為1%、3%、5%、7%、9%的上述復合除油菌劑，接種至裝有100 mL 模擬含油廢水的三角瓶中，研究菌劑接種體積分數對模擬廢水的OD600、菌體質量濃度、乳化油脂能力和油脂去除率的影響。

1.2.6 配方菌株的產酶能力研究 在上述最佳條件下，研究配方菌株所產脂肪酶活性隨處理時間的變化情況。

1.3 分析測試項目與方法

1.3.1 模擬廢水的OD600測定含菌溶液在波長為600 nm 處的吸光度。

1.3.2 菌體質量濃度 取兩支無菌離心管，稱質量后，加入一定體積的含菌溶液，8 000 r/min 離心后，棄去上清液，再次稱質量后，由式（1）計算菌體質量濃度ρ（g/L）：

式中：m1為無菌管質量，mg；V 為含菌溶液體積，mL；m2為離心后無菌管質量，mg； w 為離心沉淀物的含水率，%。

1.3.3 乳化油脂能力 取1 mL 含菌溶液加入大豆油質量分數為2%的發酵培養基中，30 ℃、160 r/min培養72 h 后，在10 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液1 mL，加入磷酸鉀緩沖液 （pH 7.0）5.2 mL，與0.2 mL 大豆油混合，振蕩2 min 后，靜置10 min，測540 nm 處的吸光度，即得菌劑的乳化油脂能力。

1.3.4 除油率 油脂質量濃度采用紫外分光光度法測定[9]。 除油率Q（%）通過式（2）計算：

式中：ρ0為初始油脂質量濃度，g/L； ρR為反應后油脂質量濃度，g/L。

1.3.5 脂肪酶的酶活 采用《脂肪酶制劑》中的檢測方法測定[10]。 脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油，由于生成的脂肪酸使酶反應液變酸，用NaOH 標準溶液滴定，滴定至微紅色保持30 s 不褪色，記錄NaOH 消耗體積[11]。酶活E（μ/mL）由式（3）計算：

式中：Vs為NaOH 初始體積，mL；Vb為NaOH 滴定后體積，mL； ρNaOH為NaOH 質量濃度，g/L； Df為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 溫度對除油菌生長及油脂去除的影響

油脂在水中的溶解度很小，這是油脂很難被微生物降解利用的主要原因。 油脂的溶解度與溫度基本呈線性關系，溫度越高，溶解度越高，越有利于油脂降解[12]。 溫度對除油菌生長及油脂去除的影響如圖1 所示。

圖1 溫度對菌體質量濃度和油脂去除率的影響Fig. 1 Influence of temperature on cell concentration and oil removal rate

由圖1（a）可見，隨溫度升高，菌體生長情況略有改善后轉而下降，當溫度為35 ℃時，OD600和菌體質量濃度均最高，分別為2.71 g/L 和4.40 g/L，其中，OD600與25 ℃相比提高了5.6%，提高幅度不大。當溫度繼續升高時，OD600和菌體質量濃度明顯下降，到55 ℃時分別下降了84.9%和77.3%。 該結果與Ke 等的研究結果相符[13]，即隨著溫度升高，除油菌OD600降低。

由圖1（b）可以看出，油脂乳化能力和除油率與菌劑的生長情況變化一致。 隨著溫度的升高，復合除油菌劑的乳化油脂能力和除油率均先升高后明顯降低，35 ℃時的油脂乳化能力及除油效果最佳，分別為0.567 和82.59%，這與Nayak 等的研究結果相似[14]。 溫度升高到55℃時，乳化油脂能力和除油率分別降低了46.6%和31.46%，降幅較大，說明盡管溫度升高有利于油脂溶解，高溫對菌體生長的抑制是油脂降解的限制條件，同時說明復合除油菌劑的耐高溫能力有一定局限，若后續將該復合除油菌劑應用到好氧堆肥中，有必要進一步提高耐高溫菌的復配比例，以提高高溫階段復合除油菌劑的除油能力。

2.2 pH 對除油菌生長及油脂去除的影響

pH 對除油菌生長及油脂去除的影響情況如圖2 所示。

圖2 pH 對菌體質量濃度和油脂去除率的影響Fig. 2 Influence of pH on cell concentration and oil removal rate

可見，在pH 5~9 時，OD600和菌體質量濃度分別保持在2.5 g/L 和4.0 g/L 左右，該復合菌劑對pH 的適應性范圍較廣，生長較為穩定。 當pH 降低至4時，OD600下降較為明顯，從pH 為5 時的2.504 降低至1.997，菌體質量濃度也呈現相同的變化趨勢，降低至2.5 g/L。 微生物表面電荷受pH 影響，低pH 降低了微生物對營養物質的吸收進而影響其生長[15]。此外，低pH 條件不利于脂肪酶發揮水解作用。在堆肥發酵過程中，可采取一定措施避免體系pH 低于5.0 的情況出現，否則有可能導致酸化，影響微生物活性，甚至導致發酵停止。

從圖2（b）可以看出，隨著pH 升高，乳化油脂能力和除油率升高，分別從pH 為4 時的0.300 和54.%升高到pH 為7 時的0.606 和79.41%，進一步升高pH 至9 時，乳化油脂能力和除油率分別為0.680 和81.26%。堿性條件下，脂肪在水中的溶解度增大，有利于微生物對油脂的吸收利用[16]，脂肪水解產生的脂肪酸可被堿中和，生成脂肪酸鹽，使得該過程持續進行，因此pH 為9 時的乳化油脂能力最強。 綜上所述，pH 為7~9 時，菌劑的除油率均在80%以上，該結果與Wu 等和Joo 等學者的研究結果基本一致[17-18]，說明中性偏堿的環境有利于油脂的乳化和降解。

2.3 NaCl 質量濃度對除油菌生長及油脂去除的影響

微生物細胞壁可承受的滲透壓為1×104~1×106Pa，相當于氯離子質量濃度2 g/L。 當氯離子質量濃度超過5 g/L 時，滲透壓增大，細胞因失水發生質壁分離，活性降低，嚴重時微生物死亡。NaCl 質量濃度對除油菌生長及油脂去除的影響如圖3 所示。

圖3 NaCl 質量濃度對菌體質量濃度和油脂去除率的影響Fig. 3 Influence of NaCl content on cell concentration and oil removal rate

隨著NaCl 質量濃度升高，OD600和菌體質量濃度分為2 個階段：當NaCl 質量濃度從5 g/L 升高到20 g/L 時，OD600和菌體質量濃度逐漸下降，但變化幅度不大，分別從2.710 和4.40 g/L 降低至2.578和4.10 g/L，降低了4.9%和6.8%；其中NaCl 質量濃度為10 g/L 時，OD600和菌體質量濃度最高，說明10 g/L 的NaCl 質量濃度有利于微生物的生長繁殖。 當NaCl 質量濃度逐漸升高時，OD600和菌體質量濃度下降幅度增大，NaCl 質量濃度為30 g/L 時，OD600為2.274，菌體質量濃度為2.05 g/L，與NaCl 質量濃度為20 g/L 相比，分別下降了16.1%和53.4%；當NaCl 質量濃度增大到90 g/L 時，OD600和菌體質量濃度分別下降了51.7%和70.5%。 可見NaCl 質量濃度或滲透壓過高或過低，微生物的生長活性均受到抑制[19]。

2）在含水土體中進行隧洞施工前，地質勘探尤為重要。土質、含水（尤其是水量、水壓力）狀況等應作為重點指標進行勘察。對水量豐富、滲流穩定的地下水處理往往選用洞內排水措施是不明智的。

由圖3（b）可以看出，NaCl 質量濃度對乳化油脂能力和除油率的影響與菌體生長情況相近，即NaCl 質量濃度為5~20 g/L 時，乳化油脂的能力和除油率先升高后降低，并在10 g/L 時取得最大值，為0.567 和84.75%；當NaCl 質量濃度超過30 g/L 時，隨著NaCl 質量濃度升高，乳化油脂能力和除油率明顯降低；當NaCl 質量濃度為90 g/L 時，乳化油脂能力和油脂去除率分別降低至0.313 和43.87%，與NaCl 質量濃度5 g/L 時相比，降低了41.7%和46.49%。 屈瑾等的研究表明當NaCl 質量濃度過高時，外界滲透壓高會抑制微生物活性[20]，使得微生物產酶能力下降、脂肪酶活性降低、除油效果變差。

2.4 油脂質量分數對除油菌生長及油脂去除的影響

圖4 為油脂質量分數對除油菌生長及油脂去除的影響。

圖4 油脂質量分數對菌體質量濃度和油脂去除率的影響Fig. 4 Influence of oil concentration on bacterial cell concentration and oil removal rate

可以看出，隨著油脂質量分數升高，OD600和菌體質量濃度先升高后緩慢降低。 當油脂質量分數從1%升高到2%時，菌體生長情況得到改善，OD600和菌體質量濃度分別為2.442 和4.30 g/L，提高了15.5%和87%。 此后隨著油脂質量分數升高，OD600和菌體質量濃度逐漸降低，至5%時，分別降低了10.6%和48.8%。 該體系中，油脂是微生物生長的唯一碳源，質量分數過低或過高均不利于微生物生長，復合除油菌劑在油脂質量分數為2%的條件下，生長最好；當油脂質量分數為1%時，提供的碳源不足以滿足除油菌的生長需要，當油脂質量分數高于3%時，油脂質量分數過高，其在液體表面形成油膜，阻礙了微生物生長所需氧氣的傳遞，微生物生長受到一定程度的抑制。

從圖4（b）可以看出，除油菌乳化油脂能力和除油率的變化趨勢與菌劑生長特別是OD600的變化情況一致，即當油脂質量分數為2%時，乳化油脂能力和除油率最佳，達0.567 和84.49%；油脂質量分數為1%時，乳化油脂能力和除油率大大降低，高于2%時，也出現不同程度的下降。 通常隨著油脂質量分數升高，水中溶解氧質量濃度降低，微生物生長和活性受到抑制、產酶能力下降、乳化能力降低，不利于油脂的降解去除，該結果與柯霞等的研究結果一致[21]。

另外，當油脂質量分數升高到5%時，OD600和菌體質量濃度分別為2.181 和2.2 g/L，乳化油脂能力和除油率分別為0.501 和55.07%，均高于油脂質量分數為1%時的情況，說明該復合除油菌劑對油脂質量濃度的適應范圍較廣，可在較寬的油脂質量濃度范圍內穩定生長，可用于油脂質量濃度較高的餐廚垃圾或廢水的發酵過程。

2.5 接種體積分數對除油菌生長及油脂去除的影響

復合除油菌劑的接種體積分數對其生長情況及油脂去除的影響見圖5。

圖5 接種體積分數對菌體質量濃度和油脂去除率的影響Fig. 5 Influence of inoculation amount on cell concentration and oil removal rate

可以看出，隨著菌劑接種體積分數的增加，菌體生長情況先得到改善而后轉而下降，當菌劑接種體積分數為5%時，生長情況最好，OD600和菌體質量濃度分別為2.632 和7.45 g/L。當菌劑接種體積分數低于5%時，一定培養時間內，相對較少的除油菌無法較好乳化和降解相對較多的油脂，OD600和菌體質量濃度下降明顯，當菌劑接種體積分數為1%時，分別降低了7.4%和17.4%。 菌劑接種體積分數高于5%時，體系內提供碳源不足，同時前期菌體快速生長引起溶解氧不足，菌體生長情況由此受到不同程度的抑制。

由圖5（b）可以看出，該菌劑的乳化油脂能力及除油率的變化與其生長情況一致，接種體積分數為5%時，菌體質量濃度高，產生的脂肪酶多，乳化油脂能力和除油率最高，分別為0.539 和81.78%。 在菌劑接種體積分數為1%~9%時，最終油脂去除率都可以達到70%以上，當接種體積分數大于5%時，除油率下降，可能是由于可利用的總溶解氧不足及營養物質被消耗所致[22]。

2.6 單一菌株的產脂肪酶能力

微生物降解油脂的能力與脂肪酶的酶活有關，隨酶活升高，油脂降解能力提高。 各除油菌株所產脂肪酶的酶活及除油率隨處理時間的變化情況見圖6。

圖6 除油菌所產脂肪酶的酶活隨時間的變化情況Fig. 6 Changes of lipase activity produced by degreasing bacteria over time

隨著處理時間的延長，脂肪酶的酶活先升高后降低。 處理至36 h 時，菌株B501、菌株009、菌株005 和菌株B409 所產脂肪酶的酶活均達到最高，分別為6.58、6.28、5.58、4.92 U/mL，其中，菌株B501 的產脂肪酶能力最強。 處理至48 h 時，菌株009 所產脂肪酶的酶活最高，為6.18 U/mL，且遠高于其他3株微生物，說明菌株009 持續產脂肪酶的能力較強。 各單菌株除油結果表明，與其他3 株微生物相比，菌株009 的除油率最高，為70.98%，這與其持續產脂肪酶能力較強有關。 菌株B501 和005 的除油率分別為63.58%和66.03%，菌株B409 的除油率最低，為44.56%。

3 結 語

所得復合除油微生物菌劑的除油效果受溫度、pH、NaCl、油脂質量濃度和接種體積分數的影響較大，較佳除油條件為：溫度35 ℃，pH 9，含鹽量10 g/L，油脂質量分數2%，菌體接種體積分數5%，除油率最高可達84.75%。單一菌株產脂肪酶的酶活及除油率的研究結果表明，各菌株在36 h 時的產脂肪酶能力較強，此時菌株B501 的脂肪酶酶活最高，為6.58 U/mL，而菌株009 所產脂肪酶處于高酶活的持續時間較長，因此除油率最高，達70.98%。與單一菌株相比，復合除油微生物菌劑的除油率有所提高。