鼠李糖脂對梨采后黑斑病的抑制機理

盧玉慧，劉志恬，李永才，畢 陽，楊陽陽

（甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneideri cv. Zaosu） 是1956年由中國農業科學院果樹研究所以“蘋果梨”為母本、“身不知”為父本進行雜交后選育而成的一個新型的梨品種[1]。 因其果肉細膩雪白、酥脆香甜[2]，具有生津止咳、潤肺化痰等保健功效，深受消費者的喜愛，有很高的經濟效益和社會效益[3]。 互隔交鏈孢（Alternaria alternata） 侵染可引起梨、柑橘、甜椒、杏等多種果蔬采后黑斑病害[4]，貯藏后期發病率高達37%[5]。 化學殺菌劑是目前控制采后病害的主要手段，但其殘留量高、降解周期長、毒性大、環境污染嚴重且危害人體健康[6]。 研發安全的采后病害防腐劑或控制手段已勢在必行。

鼠李糖脂（rhamnolipids，RLS）是一種糖脂生物表面活性劑，已有研究表明其對多種作物病原菌具有抗菌活性[7]。 因其無毒、兩親、潛在活性高、可生物降解、在極端條件（溫度、pH 和鹽度）下穩定等性質成為環境友好的“綠色”化學品，其食用安全性已通過美國國家環境保護局（EPA）的食用安全認證[8]。鼠李糖脂是由一個或兩個鼠李糖分子與C8 和C12之間飽和或不飽和烷基鏈上的一個或兩個脂肪酸相 連 形 成 的[9]。 在 對 灰 霉 菌（Botrytis sp.）、絲 核 菌（Rhizoctonia sp.）、鐮 刀 菌（Fusium sp.）、鏈 格 孢 菌（Alternaria sp.）、腐霉（Pythium sp.）等真菌和卵菌的研究中發現，RLS 能夠溶解游動孢子、抑制孢子萌發和菌絲生長等[10-11]。 Varnier 等發現，0.1、1 mg/mL的RLS 對灰霉病菌的孢子萌發和菌絲生長均有明顯的抑制作用，且能有效誘導并增強葡萄的防御反應，保護植物免受灰霉病的侵染[12]。 Jonghe 等發現，在10、20 μg/mL 的RLS 質量濃度下，對菊苣孢子囊的形成、游動孢子的產生具有明顯的影響，當質量濃度達到100 μg/mL 時，對隱孢子菌的菌絲生長影響更顯著[13]。 RLS 在菊苣水培脅迫系統中具有很好的抑制隱孢霉傳播的潛力，可作為防治褐根腐病的有效措施。 劉菊發現1.0 g/L 的RLS 對西瓜枯萎病菌的孢子萌發和菌絲生長均有抑制作用，且隨著RLS 質量濃度的增加，對病原菌的抑制作用越強[14]，鼠李糖脂處理還會影響孢子內部結構，細胞壁出現不同程度的消融，原生質分布不均勻，孢子內部出現泡化現象，且濃度越高，這些現象越明顯。 Yan 等發現500 μg/mL 的鼠李糖脂能顯著抑制致櫻桃番茄腐爛的互隔交鏈孢[15]。Goswami 等發現2 g/L 的鼠李糖脂對甘蔗鐮孢霉菌引起的病害有明顯的抑制作用，且能抑制菌絲生長[16]。 有關鼠李糖脂對梨果黑斑病菌A. alternata 的抑制作用及其機理尚未見報道。 作者研究了鼠李糖脂對A. alternata 生長的抑制作用以及對黑斑病的控制作用，并探討其可能的抑菌機理，為鼠李糖脂替代化學合成藥物在果蔬采后病害控制上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試早酥梨：于2020 年9 月18 日采摘自甘肅省白銀市景泰縣條山農場，挑選無病蟲害、機械損傷，且大小形狀均勻的健康果實，當天下午運至實驗室，去除田間熱后，于4 ℃冷庫中貯藏待用。

供試鏈格孢A. alternata（JT-3）：分離自條山農場自然發病的早酥梨果實，在PDA 培養基中純化3代后保存待用；鼠李糖脂（純度≥95%）：購于西安瑞捷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司產品；CX21FSIC 光學顯微鏡：奧林巴斯工業有限公司產品；1510-0408 型酶標儀：美國賽默飛世爾科技有限公司產品；U-LH100-3 型熒光顯微鏡：上海永科光學儀器公司產品；JEM-1400FLASH 透射電子顯微鏡：日本電子有限公司 （JEOL） 產品；Inspect 掃描電子顯微鏡：美國FEI 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 A. alternata 孢子懸浮液的配制 參照高春麗等的方法[17]，并略做修改。 在無菌條件下將10 mL無菌水注入培養5 d 后的A. alternata 菌落中，用無菌涂布器輕刮后用4 層紗布過濾到三角瓶中，無菌水稀釋、混勻后，用血球計數板計數，配制成1×106個/mL 孢子懸浮液。

1.3.2 RLS 對A. alternata 生長的影響

1）RLS 對A.alternata 孢子萌發的影響 將上述濃度為1×106個/mL 的A. alternata 孢子懸浮液準確吸取1 mL 于2 mL 無菌離心管，在5 000 g 條件下離心5 min 后棄上清液，向沉淀中加入1 mL 質量濃度分別為0、10、20、30 mg/mL 的鼠李糖脂溶液，28 ℃溫育，分別在0、2、4、6、8 h 取出，加20 μL 藥處理后的孢子懸浮液于9 mm 的質量濃度2 g/dL 無菌水瓊脂上，然后與蒸餾水潤濕的濾紙同時放置于培養皿中，28 ℃恒溫培養，在光學顯微鏡下觀察A. alternata 的孢子萌發率。 孢子萌發率計算公式如下：

式中：Y 為孢子萌發率，%；A 為孢子萌發數；B 為孢子總數。

2）RLS 對A. alternata 菌落生長的影響 參照岑春藝等的方法測定鼠李糖脂的抑菌效果[18]，并略做修改。無菌條件下將質量濃度為10、20、30 mg/mL的鼠李糖脂加入無菌融化的PDA 培養基中，混勻，倒入直徑為7 cm 的培養皿中。 吸取2 μL 的1×106個/mL A. alternata 孢子懸浮液滴到培養基中，28 ℃恒溫培養。通過十字交叉法分別測量第3、5、7、9天的菌落直徑，以無添加RLS 的PDA 組作為對照組。

3）RLS 對A. alternata 生物量的影響 分別將0、10、20、30 mg/mL 的鼠李糖脂溶液加入無菌融化的PDA 培養基中混勻，待其凝固后在培養基表面鋪一層無菌玻璃紙，然后在培養基表面接種培養5 d的1×106個/mL A. alternata 孢子懸浮液2 μL 于28 ℃恒溫培養箱中培養，4 d 后取下玻璃紙，稱質量并記錄數據。

1.3.3 RLS 對早酥梨黑斑病的控制 參照Moscoso-Ramírez 等的方法[19]，并略做修改。 果實用質量分數2%的次氯酸鈉溶液消毒處理好后用無菌鐵釘（直徑3 mm）在果實赤道部位均勻地打3 個孔（深3 mm），待其晾干后接種1×106個/mL 的A. alternata 孢子懸浮液，待孢子懸浮液晾干后向各個孔中接入20 μL 質量濃度為30、40、50 mg/mL 的鼠李糖脂溶液。無菌水處理作為對照。室溫晾干后，置于規格為45 cm×31 cm×16.5 cm 的市售保鮮盒，在保鮮盒4 個角落放浸濕蒸餾水的濾紙，以保證環境濕度。通過十字交叉法，每3 d 測量一次果實的病斑直徑，并記錄數據，測量至第12 天。 每個處理為9 個梨。

1.3.4 RLS 對A. alternata 膜完整性的影響

1） PI 染色檢測對A. alternata 孢子細胞膜完整率的測定 參照董玉鵬等的方法[20]，并略做修改。準確吸取1 mL 的1×106個/mL A. alternata 孢子懸浮液于2 mL 無菌離心管中，離心棄上清液后，加入1 mL 質量濃度分別為0、10、20、30 mg/mL 的鼠李糖脂溶液，28 ℃溫育2 h，離心，棄上清液，向孢子沉淀中加入1 mL PBS（pH 7.0）溶液，室溫下避光靜置30 min 后，繼續離心，棄上清液，加入1 mL PBS（pH 7.0） 溶液洗滌2 次，接著加入20 μL 的PI（20 ng/mL） 染液，振蕩15 s，28 ℃溫育15 min，離心，棄上清液，同樣再加入1 mL PBS（pH 7.0）溶液洗滌2 次，最后加1 mL PBS （pH 7.0） 溶液制片，Olympus 熒光顯微鏡下進行觀察拍照并統計染色率。

2）RLS 處理對A. alternata 細胞膜電導率的影響 細胞膜電導率參照劉志恬等的方法[21]，并略做修改。取1 mL 孢子懸浮液（1×106個/mL）于100 mL無菌PDB 培養基中，（25±1） ℃恒溫振蕩36 h（150 r/min），過濾收集1 g 菌絲，分別加入0、10、20、30 mg/mL 鼠李糖脂溶液8 mL 至15 mL 無菌離心管中，28 ℃溫育，等梯度測定30~180 min 內6 個時間段的電導率。

3）RLS 處理對A. alternata 線粒體的影響 線粒體測定參照Shi 等的方法[22]，并做修改。 孢子培養同1.3.4 節。 28 ℃溫育后，分別在第2、4 小時取出，離心5 min，用1 mL PBS（pH 7.0）溶液洗滌3 次，加入20 μL JC-1（10 μg/mL）染料工作液，室溫下避光靜置30 min，離心，加入1 mL PBS（pH 7.0）溶液洗滌2 次，離心，最后加入1 mL PBS（pH 7.0）溶液制片，立即置于上述熒光顯微鏡下觀察拍照。

4）RLS 處理對A. alternata 核酸滲漏的影響參照Carson 等的方法[23]，并略做修改。 在PDB 中培養菌絲后過濾收集1 g 于2 mL 無菌離心管中，加入劑量為0、10、20、30 mg/mL 鼠李糖脂溶液，分別處理0、1、2、3、4 h 后取樣，離心收集上清液，檢測波長260 nm，對照組用PBS（pH 7.0）溶液進行校正。

5）RLS 處理對A. alternata 蛋白質滲漏的影響蛋白質含量測定方法同文獻[23] ，加入劑量為0、10、20、30 mg/mL 鼠李糖脂溶液，分別處理0、1、2、3、4 h后取樣，離心收集上清液，檢測波長280 nm，并記錄吸光度值。

6）RLS 處理對A. alternata 可溶性糖的影響參照Dubois 等的方法[24]，并略做修改。 可溶性糖測定方法同文獻[23] ，加入0、10、20、30 mg/mL 鼠李糖脂溶液，分別處理0、1、2、3、4 h 后取樣，離心收集上清液0.5 mL，依次加入1.5 mL 蒸餾水、1 mL 苯酚溶液（90 g/L）和5 mL 濃硫酸，室溫下反應30 min，檢測波長485 nm。

1.3.5 RLS 對A. alternata 活性氧的影響 參照劉佳怡等的方法[25]，并略做修改。孢子培養同1.3.4 節。2 h 后8 000 g 離心3 min，加入PBS（pH 7.0）溶液1 mL 洗滌3 次，加30 μL，10 μg/mL DCFH-DA 染色液，28 ℃溫育15 min，離心，棄上清液，再次加入PBS（pH 7.0）溶液1 mL 洗滌2 次，立即置于熒光顯微鏡下觀察拍照并統計染色率。

1.3.6 RLS 對A. alternata 菌絲形態的影響 在掃描電子顯微鏡下，樣本用刀片挑取部分菌絲，將樣本輕輕粘在導電膠上，臨界點干燥，真空噴鍍，最后在鏡下選擇合適位置，調整到適當倍數，在掃描電鏡下進行觀察。

1.3.7 RLS 對A. alternata 孢子顯微結構的影響取于20、30 mg/mL 的RLS PDA 培養基上培養5 d的A. alternata，無菌水作為對照。 樣品分別經體積分數3%戊二醛和質量分數1%四氧化鋨固定。 丙酮逐級脫水。 脫水后將樣品進行處理。 將處理后的樣品進行包埋，緊接著進行切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網。 醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色15~20 min后，于透射電鏡下觀察。

1.3.8 數據處理 數據采用Microsoft Excel 2013計算，并用Origin 2017 制圖，用SPSS 26.0 軟件對得到的數據進行方差分析，采用Duncan’s 多重差異顯著分析。以上實驗均做3 個平行實驗，重復3次。

2 結果與分析

2.1 RLS 對A. alternata 生長的影響

2.1.1 RLS 對A.alternata 孢子萌發的影響 外源RLS 處理顯著抑制了A. alternata 孢子萌發 （P<0.05），見圖1，其抑制效果具有濃度效應，其中30 mg/mL RLS 處理6 后A. alternata 孢子萌發較對照組降低了88.69%。

圖1 RLS 對A.alternata 孢子萌發的影響Fig. 1 Effect of Rhamnolipids treatment on spore germination

2.1.2 RLS 對A. alternata 菌落生長的影響 RLS處理對A. alternata 的菌絲生長有明顯的抑制作用（P<0.05） ，且抑制效果隨處理質量濃度的增加而顯著增強（圖2）。如圖2（a），RLS 不僅抑制了菌絲的擴展，而且只形成白色菌落，菌絲隆起，不形成孢子。其中30 mg/mL RLS 處理7 d 后，其菌落直徑僅為對照組的19.22%。

圖2 RLS 處理對A.alternata 菌絲形態和菌落直徑的影響Fig. 2 Effect of RLS treatment on mycelium morphology and colony diameter of A. alternata

2.1.3 RLS 對A. alternata 生物量的影響 RLS 處理對A. alternata 的生物量有顯著的抑制作用（P<0.05），其生物量隨著處理質量濃度增加呈現下降趨勢（圖3）。 培養4 d 后用30 mg/mL RLS 處理A.alternata 的生物量較對照降低了86.67%。

圖3 RLS 處理對A.alternata 生物量的影響Fig. 3 Effect of RLS treatment on biomass of A. alternata

2.2 RLS 對早酥梨黑斑病的控制

外源RLS 處理顯著抑制了早酥梨黑斑病的擴展，且隨著濃度的增加，抑制效果越明顯，見圖4（a），貯藏到12 d 時，50 mg/mL 的RLS 處理組果實的病斑直徑是對照組的21.42%，見圖4（b）。

圖4 RLS 處理對早酥梨黑斑病擴展及病斑直徑的影響Fig. 4 Effects of RLS treatment on the development of black spot disease and lesion diameter of Zaosu pear

2.3 RLS 對A. alternata 膜完整性的影響

2.3.1 RLS 改變A. alternata 孢子細胞膜完整性由圖5 可知，對照組中極少A. alternata 孢子的細胞膜發出較弱的紅色熒光，而RLS 處理質量濃度增加時，其熒光強度隨之增強，30 mg/mL RLS 處理組是對照的7.2 倍，說明RLS 處理會嚴重破壞A.alternata細胞膜的通透性。

圖5 RLS 處理后PI 染色檢測細胞膜完整性Fig. 5 Examination of cell membrane integrity after RLS treatment by propidium iodide（PI） staining and PI staining percentage

2.3.2 RLS 對A. alternata 細胞膜電導率的影響RLS 處理顯著提高了A. alternata 細胞膜的電導率，且處理質量濃度越大，其電導率增加越明顯，見圖6，尤其在處理前30 min 變化最為明顯，30 mg/mL RLS 處理30 min 后其電導率為對照37.37 倍，隨后各處理A.alternata 細胞膜電導率雖顯著高于對照，但變化平穩。

圖6 RLS 處理對A. alternata 細胞膜電導率的影響Fig. 6 Effect of the RLS on treatment on cell membrane electrical conductivity of A. alternata

2.3.3 RLS 對A. alternata 核酸滲透的影響 由圖7可知，RLS 處理顯著加速了A. alternata 核酸外滲，處理質量濃度越高培養液中核酸質量濃度越高（P<0.05），表明細胞膜被破壞后核酸外滲。 30 mg/mL 的RLS 處理4 h 后，A. alternata 培養液中核酸質量濃度為對照組的1.1 倍。

圖7 RLS 處理對A. alternata 核酸滲漏的影響Fig. 7 Effect of the RLS treatment on leakage of nucleic acid from A. alternata

2.3.4 RLS 對A. alternata 蛋白質滲漏的影響 由圖8 可見，RLS 處理前1 h 培養液中蛋白質質量濃度明顯增加，隨后變化逐漸平穩，30 mg/mL 的RLS處理4 h 后，A. alternata 后蛋白質質量濃度為對照組的1.16 倍。而對照組培養后期蛋白質質量濃度雖略有增加，但隨培養時間不存在顯著性差異 （P<0.05）。

圖8 RLS 處理對A. alternata 蛋白質質量濃度的影響Fig. 8 Effect of the RLS treatment on protein content from A. alternata

2.3.5 RLS 對A. alternata 可溶性糖滲漏的影響由圖9 可知，隨著RLS 質量濃度增加，處理組的可溶性糖質量濃度明顯增加，1 h 后對照組與處理組的差距明顯，30 mg/mL RLS 處理A. alternata 4 h后，可溶性糖質量濃度為對照組的6.1 倍。

2.3.6 RLS 對A. alternata 線粒體的影響 由圖10可見，對照組線粒體大小形態正常、結構完整、具有較強的熒光強度。 而處理組的熒光強度明顯減弱，質量濃度越高，破壞越嚴重，線粒體分解越快，且隨著處理時間的延長，線粒體形態逐漸變模糊。

圖10 RLS 處理對線粒體形態的影響Fig. 10 Effect of RLS treatment on mitochondrial morphology of A. alternata

2.4 RLS 對A. alternata 活性氧的影響

采用DCFH-DA 探針對A. alternata 細胞內活性氧進行染色，見圖11。 培養2 h 后，細胞內熒光強度隨著處理質量濃度增加而增強，染色率也隨之逐漸增大，30 mg/mL RLS 處理的A. alternata細胞染色率較無菌水處理增加了55.96%。

圖11 RLS 處理后DCFH-DA 染色情況Fig. 11 Staining after RLS treatment and DCFH-DA staining percentage

2.5 RLS 對A. alternata 菌絲形態的影響

掃描電鏡觀察發現未經RLS 處理的A.alternata的菌絲粗細均勻、表面光滑，菌絲較為稀疏，而RLS處理后部分菌絲變細，且相互纏繞、卷曲，表面凹凸不平，有斷裂現象，見圖12。

圖12 RLS 處理對菌絲形態的影響Fig. 12 Effect of RLS treatment on mycelium morphology

圖13 RLS 處理后對孢子結構的影響Fig. 13 Effect of RLS treatment on spore structure

2.6 RLS 對A. alternata 孢子顯微結構的影響

透射電鏡觀察發現對照組A. alternata 細胞壁結構均勻連續，胞內隔膜清晰可見，染色質分布均勻，胞漿內可見清晰完整的線粒體和核糖體等細胞器。 20 mg/mL RLS 處理的A. alternata 菌體型較小，且胞體內無明顯分隔，部分菌體已畸變，呈不規則多邊形，但細胞壁和細胞膜結構依舊連續，細胞壁外還附著有一層絮狀物，部分A. alternata 胞漿內容物外滲，菌體內部結構模糊不清。 30 mg/mL RLS 處理的A. alternata 胞漿內容物丟失嚴重，多數菌體已接近空泡化，細胞壁結構變薄，細胞膜嚴重破壞。

3 討 論

已有報道稱鼠李糖脂具有明顯的抑菌活性，包括對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的抗菌作用，但其抑菌濃度在不同菌株中存在較大差異，其對幾乎所有的革蘭氏陰性菌均有良好的抗菌活性，包括粘質沙雷氏菌、肺炎克雷伯氏菌和產氣腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為4、0.5、8 μg/mL[26]，而對革蘭氏陽性菌包括枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌的MIC分別高達16 μg/mL 和32 μg/mL。Siddhartha 等發現RLS 對黃色微球菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌也具有抗菌活性[27]，而對病原真菌辣椒疫霉、黑曲霉、青霉菌、灰霉菌和球毛殼菌，RLS 的MIC 分別為10、16、16、18、32 μg/mL[26]。 作者發現鼠李糖脂處理能顯著抑制A. alternata 的孢子萌發以及菌絲生長，30 mg/mL 的RLS 處理培養7 d 時菌落直徑僅為對照組19.22%，表明不同病原物對RSL 的敏感性存在差異，其具體機理尚需進一步闡明。 同時還發現RSL 能夠有效控制梨果黑斑病的擴展，這一結果與Jiumoni 等在生物防治辣椒炭疽病中的研究結果一致，其發現500 mg/L 的RLS 處理可以顯著降低辣椒炭疽病的發病率，同時對病原菌也有明顯的抑制作用[28]。Borah 等也發現50 mg/L 的RLS 可以完全抑制由輪狀鐮刀菌引起的玉米莖腐病和穗腐病[29]。 可見RLS 具有廣譜的抑菌活性，但其控制作用因病原物和寄主而異。

細胞膜是保證細胞內環境相對穩定的屏障，大多數抑菌活性物質的靶點為細胞膜。 肖鵬飛等發現0.1 g/L 的RLS 破壞了細胞質膜的結構并使其裂解，還可通過引起膜活性的改變，干擾微生物正常的攝取同化功能[31]。Stanghellini 等研究發現30 μg/mL 的RLS 能使辣椒疫霉病和黃瓜腐霉病孢子在1 min 內水解完全[32]。 本研究中30 mg/mL 的RLS 處理嚴重破壞了A. alternata 細胞膜，改變膜通透性，提高細胞膜電導率，并導致蛋白質、核酸、可溶性糖的滲漏，誘導產生大量活性氧。 同樣，Yan 等研究發現RLS 能有效抑制菌絲生長，改變細胞形態，破壞細胞膜磷脂雙層結構，顯著影響A. alternata 菌絲體的細胞通透性，使上清液電導率增加，大量DNA 和蛋白質從細胞質中滲出，原生質體收縮，細胞膜和細胞壁發生了改變[33]，這與本實驗的結果相似。Sotirova等還發現RLS 通過破壞微生物細胞膜、減少孢子移動和導致孢子破潰來抑制病原體，從而保護植物宿主免受進一步入侵[34]。 鼠李糖脂的分子結構具有親水性頭部和親脂性尾部，其可能會插入細胞（沒有細胞壁）的外膜而直接裂解游動孢子[35]。同時根據膜的脂質成分和濃度的不同，鼠李糖脂也能夠透過膜而導致其溶解[36-37]。 鼠李糖脂與其他表面活性劑一樣也能增溶和降低界面張力，改變細胞表面性質，介入或溶解細胞膜的磷脂層，誘導細胞膜組成和結構變化[38]。 另外，作者還發現RLS 處理會促進A.alternata 胞內活性氧的積累，但RLS 的具體抑菌機理尚需進一步揭示。

4 結 語

RLS 能顯著抑制A. alternata 孢子萌發和菌絲生長，并有效控制梨果黑斑病的擴展，且其作用效果存在濃度依賴性。 RLS 處理嚴重破壞了A.alternata細胞膜的完整性，提高了膜電導率，增加了細胞膜透性，導致核酸、蛋白質、可溶性糖等細胞內容物外滲，誘導孢子內活性氧的產生與積累，破壞了A. alternata 的形態結構。