西索米星生產菌株的誘變選育及工藝優化

沈淑琳，李 會，張曉梅，徐建國，史勁松，許正宏*

（1. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；4. 無錫福祈制藥有限公司，江蘇 無錫 214122）

西索米星（sisomicin）是一種含有雙鍵的多元弱堿性第二代氨基糖苷類抗生素，中文別名西蘇霉素和紫蘇霉素等，為小單孢菌的次級代謝產物[1-2]，它對大多數革蘭氏陽性和部分如金黃色葡萄球菌等的革蘭氏陰性菌有很強的抗菌作用。 以西索米星為前體可以合成抗菌活性強、毒性小、抗耐藥性的奈替米星和plazomicin 等，市場需求較大。西索米星最先由美國先令公司Weinstein 等在1970 年從伊尼奧 小 單 孢 菌 （Micromonospora inyoensis，M.inyoensis）中取得[3]。小單孢菌是其主要產生菌[4-5]，但由于其野生菌株發酵西索米星效價低 （最高只有400 U/mL），國內外研究者一直嘗試采用不同的誘變方法來選育西索米星高產菌株，以滿足抗生素市場需求。 Testa 等用亞硝基胍、硫酸二乙酯和紫外復合誘變處理西索米星產生菌（M. inyoensis），得到一定條件下能合成西索米星的菌株[6]。廖愛芳等對伊尼奧小單孢菌澄江變種T-125（M. inyoensis var.dengjiangensis T-125） 進行紫外和亞硝基胍誘變[7]，獲得一株比原始菌株效價提高了17 倍的高產菌株NS8-30。趙敏等用紫外結合氯化鋰和甲胺等誘變棘孢小單孢菌JIM-202 變株，得到一株西索米星單組分阻斷型新菌株JIM-121[8]。利用紫外誘變和化學誘變等傳統誘變選育方法可有效提高西索米星的效價，但由于長期重復地使用相同誘變因子，誘變效果降低，而且由于小單孢菌細胞壁結構特殊，誘變研究進展不大，迫切需要尋找一種提高西索米星效價的有效誘變方法。

伊尼奧小單孢菌屬于放線菌的小單孢菌屬[9]，其形態為菌絲體，無氣生菌絲，其菌絲分散不均勻，直接誘變處理效果不佳。 此外，孢子壁結構致密牢固，不利于誘變劑進入核內起作用，進而導致孢子誘變假陽性較多，給后期誘變菌株的篩選帶來干擾。 原生質體作為單個的分散細胞，接觸誘變劑的面積更大，有利于誘變劑向核內滲透，而且誘變后稀釋涂布于培養基能形成單個菌落，有利于分離篩選。 管玉霞等對慶大霉素產生菌絳紅色小單孢菌的原生質體進行紫外和硫酸二乙酯誘變和融合[10]，結合慶大霉素抗性篩選獲得一株效價較原始菌株提高了73.49%的高產菌株。洪文榮應用單親滅活種內原生質體融合技術[11]，并施加西索米星壓力的篩選手段，從伊尼奧小單孢菌細胞融合研究中篩選到菌株S96，西索米星效價達到1 600 U/mL，較原始菌株提高了近30 倍。 因此，采用原生質體選育方法是解決誘變效率低的有效方法之一[12]。

常壓室溫等離子體 （atmospheric and room temperature plasma，ARTP） 是一種新開發的誘變工具，其致突變效率高于紫外線或化學誘變劑[13-14]。ARTP 誘變除誘變率高外，還有操作簡單、安全且對環境無污染等優點。 鄭明坤等利用ARTP 誘變結合巴龍霉素抗性篩選，獲得一株比原始菌株西索米星效價提高38.18%的高產菌株M.inyoensis SAAP22[15]。余飛對新霉素產生菌弗氏鏈霉菌進行6 輪ARTP 誘變，結合鏈霉素抗性篩選，最終獲得一株新霉素高產菌株，搖瓶效價比原始菌株高出1.45 倍[16]。 因此ARTP 誘變成為工業微生物的菌種選育的一種有效且常用的方法[17-18]。 M. inyoensis OG-1 是無錫福祈制藥有限公司保藏的一株能夠生產西索米星的菌株，但其生產西索米星的效價偏低（約1 026 U/mL），制約著其進一步工業利用，作者采用ARTP 對伊尼奧小單孢菌原生質體進行誘變以取得西索米星生物效價提高的菌株；進而對篩選獲得的高效菌株進行發酵優化并初步探究其高產西索米星的機制，為西索米星生產條件的進一步優化和工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原始菌伊尼奧小單孢菌（Micromonospora inyoensis OG-1）和指示菌短小芽孢桿菌：由無錫福祈制藥有限公司保存；溶菌酶（20 000 U/mg）：購于麥克林生化科技有限公司。

1.2 培養基

斜面、分離培養基（組分g/L）：可溶性淀粉10，蔗 糖 5，KNO31，NaCl20.5，K2HPO40.5，CaCO33，FeSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20，麩皮30；pH 7.2~7.3。

種子培養基（組分g/L）：玉米淀粉30，經熱處理的黃豆餅粉20，玉米漿1，CaCO33，MgSO4·7H2O 1；pH 7.2~7.4。

發酵培養基（組分g/L）：玉米淀粉20，白糊精40，黃豆餅粉40，玉米漿干粉6，DL-蛋氨酸2.5，MgSO4·7H2O 0.3，CoCl2·6H2O 0.02，K2HPO40.5，CaCO33；pH 7.0~7.2。

肉湯培養基（組分g/L）：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0。

再生培養基（組分g/L）：可溶性淀粉10，蔗糖68.46，KNO31，NaCl20.5，K2HPO40.5，CaCO33，FeSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 3.67，MgCl2·6H2O 5，瓊脂粉20。

西索米星鑒定培養基（組分g/L）：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0。

P 緩沖液：蔗糖103 g、K2SO40.25 g 和MgCl2·6H2O 2.02 g 加入800 mL 的水中，分裝成10 等分樣品，然后高溫滅菌。 使用前加入質量分數0.5%的KH2PO41 mL，質量分數3.68%的CaCl2·2H2O 10 mL，質量分數5.73%的TES 緩沖液10 mL。

1.3 方法

1.3.1 原生質體ARTP 誘變 原生質體的制備[19]：按體積分數10%將菌液接種到含質量分數0.3%的甘氨酸的肉湯培養基中，在260 r/min、34 ℃的條件下培養48 h。 培養好的菌液轉移至離心管中于3 000 r/min 離心10 min，收集菌體。用0.3 mol/L 的蔗糖溶液和P 緩沖液分別洗滌菌體2 次，3 000 r/min 離心5 min。 收集菌體并加入一定濃度的溶菌酶（用P 緩沖液配制）重懸，將重懸液放置在水浴鍋中恒溫酶解一定時間，4 000 r/min 離心10 min，收集原生質體，洗滌重懸于P 緩沖液中。

取10 μL 伊尼奧小單孢菌的原生質體懸浮液均勻涂布于金屬載片上，采用氦氣作為ARTP 的工作氣體，設置處理參數：電源的功率為100 W，照射距離為2 mm，通氣量為10 L/min。 選擇不同的處理時間（0、30、60、120、150、180、210 s），誘變結束后將金屬載片放入盛有1 mL P 緩沖液的1.5 mL 無菌離心管中，充分振蕩洗脫1 min，將洗脫液稀釋涂布于含1 mg/mL 西索米星抗性的再生培養基，34 ℃培養14 d，計算致死率，繪制致死率曲線[20-21]。

1.3.2 誘變株的篩選 瓊脂擴散法初篩：選取再生的單菌落轉接到發酵培養基加瓊脂配制成的固體培養基平板上進行密集劃線培養，待菌體長滿區域后，分別用5 mm 的打孔器挑取相同大小的菌塊進行瓊脂擴散實驗，將菌塊轉接到帶有短小芽孢桿菌孢子液的篩選培養基平板上，在37 ℃培養箱中培養14~16 h 后，測量抑菌圈直徑大小。

搖瓶復篩：選取初篩中抑菌圈相對較大的菌株接種到種子培養基中，并進行揺瓶水平的西索米星發酵，用生物鑒定法測定效價[22]。

1.3.3 遺傳性穩定性驗證 將復篩中獲得的高產菌株進行斜面保藏，經過連續5 代搖瓶發酵，檢測西索米星生物效價，考察高產菌株的遺傳穩定性。

1.3.4 碳氮源優化 在原始發酵培養基的基礎上，使用等量（40 g/L）碳源（可溶性淀粉、玉米淀粉、蔗糖和葡萄糖）分別代替白糊精制備發酵培養基，其他成分不變，考察不同碳源對西索米星發酵的影響。

在原始發酵培養基的基礎上，使用等量（6 g/L）氮源（牛肉粉、蛋白胨、酵母粉和花生餅粉）分別代替玉米漿干粉制備發酵培養基，其他成分不變，考察不同氮源對西索米星發酵的影響。

1.3.5 響應面實驗設計優化發酵培養基組分 在碳氮源優化的培養基組分基礎上，利用Design-Expert 8.0 軟件，設計Plaekett-Burman 實驗，篩選重要影響因素[23]，根據PB 實驗結論，進行最陡爬坡實驗，確定西索米星發酵效價最高范圍后，采用中心復合實驗設計（central composite design，CCD）方法設計響應面實驗，并對所得數據進行統計分析，擬合得到一個二次模型，并預測和驗證西索米星發酵最優培養基組分。

1.3.6 實時熒光定量PCR 收集不同發酵時期的發酵液，收集菌絲體，分別提取RNA，進行濃度測定并 稀 釋 至40 ng/μL 備 用。 利 用 軟 件Beacon Designer 7 設計用于RT-qPCR 的引物，見表1。 以16s rDNA 為管家基因，以RNA 逆轉錄所得cDNA為模板，檢驗引物特異性，結果顯示特異性良好后可繼續進行后續RT-qPCR 研究。 將上述逆轉錄所得cDNA 進行RT-qPCR，實驗步驟及結果的計算方法參考文獻[24] 。 每次實驗各組設3 個平行樣，實驗重復3 次。

1.3.7 西索米星生物效價的檢測 用質量分數98%的濃硫酸調節發酵液pH 至1.5~2.0，靜置20 min 后過濾取濾液，參照中國藥典[22]，采用管碟法測定西索米星的生物效價。

2 結果與分析

2.1 ARTP 誘變選育

2.1.1 最佳ARTP 誘變時間的確定 將伊尼奧小單孢菌OG-1 的原生質體進行不同時間的ARTP 誘變，然后稀釋涂布于再生培養基計算其致死率。 由圖1 可見，隨著ARTP 誘變時間的增長，致死率逐漸升高，當誘變時間為210 s 時，致死率達100%。當致死率在80%~90%時，更容易發生正向突變[24]，因此選擇處理時間為150 s（致死率為85%）的誘變菌株進行后續誘變研究。

圖1 ARTP 不同處理時間的致死率曲線Fig. 1 Lethality curve of ARTP for different treatment time

2.1.2 ARTP 誘變菌株的選育 將ARTP 誘變處理后的原生質體懸液稀釋涂布于再生培養基上，34 ℃培養14 d。 挑選300 多株誘變菌株單菌落進行瓊脂擴散法初篩，挑選抑菌圈相對較大的14 株突變菌株進行復篩。 如圖2 所示，在14 株突變株中，M.inyoensis I4-10 的西索米星生物效價最高，達到（1 389±32） U/mL，較原始菌株提高了35.4%。

圖2 ARTP 誘變菌株與對照菌株的搖瓶復篩結果對比Fig. 2 Comparison of shake flask rescreening results between ARTP mutagenic strain and control strain

2.1.3 高產菌株的遺傳穩定性研究 為了檢驗突變菌株I4-10 的遺傳穩定性，采用斜面傳代的方法，連續進行5 次傳代，檢測每代搖瓶發酵的西索米星效價,結果如圖3 所示。 突變菌株I4-10 株經5 次傳代后的西索米星搖瓶發酵效價基本穩定，生物效價穩定在（1 389±67） U/mL，表明突變菌株I4-10 遺傳穩定性良好，最終將其命名為M. inyoensis I4-10。

圖3 突變菌株I4-10 的遺傳穩定性Fig. 3 Genetic stability of mutant strain I4-10

2.2 碳源氮源的優化

2.2.1 碳源種類對西索米星發酵的影響 發酵培養基中的碳源為伊尼奧小單孢菌的生長以及產物代謝提供能量，為西索米星的合成輸送碳骨架。 采用不同的碳源，對西索米星的效價具有較大影響。 因此篩選了不同種類的碳源如白糊精、 玉米淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖對伊尼奧小單孢菌發酵產西索米星生物效價的影響進行研究。 如圖4 所示，當采用可溶性淀粉作為伊尼奧小單孢菌的碳源時，西索米星的生物效價最高，達到（1 476±38） U/mL。

圖4 不同碳源對西索米星發酵的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources on the fermentation of sisomicin

2.2.2 氮源種類對西索米星發酵的影響 培養基的氮源對于微生物生長和產物合成具有較大影響。作者篩選了不同種類的氮源如玉米漿干粉、 牛肉粉、蛋白胨、酵母粉、花生餅粉對伊尼奧小單孢菌發酵產西索米星生物效價的影響進行研究。 如圖5 所示，當采用花生餅粉作為氮源時西索米星的生物效價最低，蛋白胨作為氮源時西索米星的生物效價也較低。 當采用牛肉粉替代玉米漿干粉作為伊尼奧小單孢菌的氮源時，西索米星的生物效價最高，達到（1 419±60） U/mL，說明牛肉粉作為氮源可以滿足伊尼奧小單孢菌的生長所需及合成西索米星的需要。

圖5 不同氮源對西索米星發酵的影響Fig. 5 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of sisomicin

碳源和氮源單因素優化實驗結果表明，突變菌株I4-10 發酵培養基的最適碳源、 氮源分別為可溶性淀粉和牛肉粉。 優化后的發酵培養基發酵西索米星效價為（1 597±48）U/mL，較對照提高了15%。 菌種選育和發酵工藝優化是提高抗生素效價的重要手段，在選育得到的高產菌株的基礎上對其進行發酵工藝的優化可明顯提高效價[25-26]。

2.3 響應面法優化發酵培養基

2.3.1 Plackett-Burman 實驗 以優化后發酵培養基組分為基礎，對玉米淀粉（A）、可溶性淀粉（B）、黃豆餅粉（C）、牛肉粉（D）、DL-蛋氨酸（E）、MgSO4·7H2O （F）、CaCO3（G）、K2HPO2（H） 和CoCl2·6H2O（I）9 個因素進行考察，選用N=12 的PB 實驗設計，每個因素取高、低兩個水平，響應值為西索米星生物效價。PB 實驗具體設計和各因素水平與效應見表2 和表3。由表3 中顯示的P 值大小可知，黃豆餅粉（熱）和DL-蛋氨酸質量濃度是對西索米星生物效價有顯著影響的兩個重要因素，兩者皆存在顯著的負效應。 在西索米星發酵工藝優化的相關文獻中可以看出選用優質的黃豆餅粉對西索米星的發酵至關重要[27]，DL-蛋氨酸也是影響西索米星發酵的重要因素。 陳劍鋒等發現蛋氨酸在西索米星發酵中處于高消耗狀態[28]，其具有作為甲基化輔因子的特殊作用，所以添加適量蛋氨酸有助于提高西索米星效價。

表2 Plackett-Burman 實驗與結果（N=12）Table 2 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 12 trials

表3 Plackett-Burman 設計各因素水平及效應Table 3 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design

2.3.2 最陡爬坡實驗 在以上PB 實驗結果基礎上，進行最陡爬坡實驗，確定黃豆餅粉和DL-蛋氨酸的最優質量濃度。 由PB 實驗結果可知，黃豆餅粉和DL-蛋氨酸質量濃度對西索米星的效價具有顯著影響，兩者質量濃度過高時西索米星的生物效價反而下降，故應降低發酵培養基中兩者的質量濃度。 根據表3 中設計的這兩個顯著影響因素的水平和西索米星效應值，實驗設計及結果見表4。 實驗4中西索米星效價最高，為1 728 U/mL，此時黃豆餅粉和DL-蛋氨酸的質量濃度為30 g/L 和1.5 g/L，因此選取第4 組實驗為中心點設計下一步實驗。

表4 最陡爬坡實驗設計及結果Table 4 Experimental design of steepest ascent and the corresponding results

2.3.3 響應面設計優化培養基組分 根據最陡爬坡實驗結果，選取第4 組實驗為中心點進行二因素五水平的中心復合法實驗方案設計，表5 是具體實驗設計方案及響應值。 根據研究結果，用Design-Expert 8.0 軟件進行擬合獲得黃豆餅粉 （熱）（A）、DL-蛋氨酸（B）和西索米星生物效價（Y）間二次回歸方程為Y =1 811 +59.67A -2.21B +41.00AB -90.00A2-23.50B2。 利用軟件對二次回歸方程進行方差分析：該模型P 值小于0.001，說明該模型顯著性好，具有統計學意義；校正決定系數Radj2=1，表示該模型能較準確反映西索米星的響應值變化；相關系數R2=1，說明該模型的擬合度好。綜上所述，該模型可以用來預測西索米星的生物效價。 利用Design-Expert 8.0 軟件分析可知，當黃豆餅粉質量濃度為32.78 g/L、蛋氨酸質量濃度為1.75 g/L 時，西索米星的生物效價的理論預測值最高，為1 834 U/mL。 圖6 是黃豆餅粉（熱）和DL-蛋氨酸影響西索米星生物效價的響應面及等高線圖。

圖6 黃豆餅粉和DL-蛋氨酸對西索米星生物效價影響的響應面及等高線圖Fig. 6 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna Ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the titer of sisomicin

表5 中心復合實驗設計及其響應值Table 5 Experimental design and the actual and predicted values of sisomicin by CCD

進一步對響應面實驗設計優化得到的最適發酵培養基配方進行驗證，以最適發酵培養基組分重復實驗3 次。 在此條件下實際西索米星的平均生物效價達到（1 849±61） U/mL，與理論預測值99%符合。 驗證該模型準確性較好，可用于西索米星發酵工藝優化。 鄭明坤等將伊尼奧小單孢菌（M.inyoensis-12）作為出發菌株，經誘變后西索米星在搖瓶水平的生物效價達到1 658 U/mL[15]。 洪文榮應用單親滅活種內原生質體融合技術篩選到突變菌株S96，使西索米星在搖瓶水平的生物效價由52 U/mL 提高到1 600 U/mL[11]。 本研究中篩選獲得的誘變菌I4-10 產西索米星的生物效價在國內外同類研究報道中處于較高水平。

2.4 突變株高產西索米星的機制探索

為了探究誘變菌株高產西索米星的機理，以原始菌株伊尼奧小單孢菌OG-1 為對照，采用RT-qPCR 法對表6 所示的西索米星合成途徑相關的酶基因及菌株生長代謝相關的關鍵酶基因進行轉錄水平差異分析。 分別在發酵過程的48、72、96、120 h 時取樣提取菌株RNA，逆轉錄成cDNA，將其作為RT-qPCR 的模板，以16s rDNA 為管家基因，使用表1 中各酶基因引物進行RT-qPCR 研究。

表6 西索米星代謝途徑轉錄水平差異分析相關基因Table 6 Genes of sterol metabolism pathways of sisomicin metabolic pathway

圖7 是突變菌與原始菌西索米星代謝途徑相關酶的轉錄水平分析熱圖。與原始菌OG-1 相比，在高產菌株I4-10 發酵西索米星過程中，2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶、 甲基轉移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉移酶、SAM 依賴性N-甲基轉移酶等西索米星合成途徑關鍵酶基因轉錄水平明顯上調。其中2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶基因sis10 在發酵中的轉錄水平上調最顯著。 而戊糖磷酸途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd 在發酵過程中轉錄水平明顯下調，表明在高產菌株中此途徑減弱。 2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶具有相同的底物葡萄糖-6-磷酸，推測磷酸戊糖途徑的減弱使更多的葡萄糖-6-磷酸用于次級代謝產物西索米星的合成，繼而在2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶催化作用下產生更多的西索米星合成前體2-脫氧青蟹肌糖，這可能是突變菌株高產西索米星的原因。此外突變菌中TCA 循環的兩個關鍵酶基因idh1 和kgdh 均表現為轉錄水平上調，該途徑的增強可能加快了高產菌株的生長，進而促進了西索米星的合成。 基于以上分析，推測2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶、甲基轉移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉移酶、SAM 依賴性N-甲基轉移酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和ɑ-酮戊二酸脫氫酶可能是影響菌株合成西索米星的關鍵酶。

圖7 突變菌與原始菌西索米星代謝途徑相關酶的轉錄水平分析熱圖Fig. 7 Heat map of transcription levels of enzymes related to metabolic pathways of mutant and original sisomicin

3 結 語

作者以M. inyoensis OG-1 為原始菌株，對其原生質體進行ARTP 誘變及工藝優化。 結果表明，當ARTP 誘變的處理時間為150 s 時，誘變效果最好。經過多輪篩選獲得了高產且遺傳穩定性良好的菌株M. inyoensis I4-10，西索米星的生物效價達到（1 389±67） U/mL，較原始菌株提高了34.7%。 進一步通過對高產菌株的發酵培養基組分優化，西索米星在搖瓶水平上的生物效價得到明顯提高，最終達到（1 849±61）U/mL。本研究中獲得的菌株M.inyoensis I4-10 在西索米星高效合成方面呈現出了較大潛力，今后可繼續對該菌株進行發酵罐規模放大研究，以促進其在工業生產中的應用。 此外，原始菌和高產菌株中西索米星合成及與菌株生長相關酶基因轉錄水平差異分析表明，2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉移酶、 甲基轉移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉移酶、SAM 依賴性N-甲基轉移酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和ɑ-酮戊二酸脫氫酶可能是影響菌株合成西索米星的關鍵酶，未來可基于這些關鍵酶對突變菌株I4-10 進行代謝工程改造，從分子水平提升菌株的西索米星合成能力。