不同養殖模式克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）游離氨基酸的主成分分析及綜合評價

李鵬鵬，溫麗敏，呂經秀，卞 歡，諸永志,*，王道營,4，耿志明，徐為民，張鳳翔，姚田玉

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；3.西藏農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；4.農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，江蘇 南京 210014；5.興化市現代農業發展服務中心，江蘇 泰州 225700）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），又稱小龍蝦，隸屬節肢動物門，甲殼綱，原螯蝦屬。克氏原螯蝦原產于美洲，19世紀初傳入我國后在長江流域擴散，近年已成為重要的淡水經濟養殖動物[1-2]。克氏原螯蝦以其鮮美的口感和豐富的營養，成為中國消費者最喜愛的水產之一[3]。2021年我國小龍蝦養殖面積2600萬 畝、產量263.36萬 t[4]。

水產養殖對世界糧食供應和人類營養安全起著至關重要的作用。目前，我國已經發展了多種生態友好的水產養殖模式，其中水稻-水產（魚、蝦、蟹等）共養系統符合我國的基本農田政策，且由于能合理利用土地空間、作物和水產養殖之間的互惠共生以及滿足對食物來源的需求而被公認為可持續的有機農業系統，在農業活動中越來越重要，并在很多地區得到實踐[5]。全國稻漁一體化共養殖面積超過200萬 公頃，水產品產量超過290萬 t[5]。在不同的共養模式中，水稻-魚共養模式已有1200 a的歷史[6]。水稻-克氏原螯蝦共養模式是近年發展起來的共養模式[7]，被認為是一種高效的種植養殖生態模式，并被農業農村部作為養殖核心技術在全國推廣應用。2021年，該模式的種養面積2100萬 畝，占全國稻漁綜合種養面積的52.95%[4]。水稻-克氏原螯蝦共養模式產出的克氏原螯蝦產量占全國克氏原螯蝦總產量的70%以上[7]。混合養殖模式有多種優勢，例如提高農業經濟效益[8]、改善生態系統功能[9]、改善稻田土壤環境[9-10]、減少雜草和農作物害蟲[11]、降低農藥化肥使用量及抗性基因的產生機率[12]等。王曜等[3]研究發現養殖克氏原螯蝦的游離氨基酸（free amino acids，FAA）總量大于野生克氏原螯蝦。Liu Qiao等[13]在研究四川地區克氏原螯蝦腸道微生物的功能時發現，與水稻共養的克氏原螯蝦蝦尾中的鮮味氨基酸含量高于池塘養殖的克氏原螯蝦。除此之外，江蘇興化地區目前還存在多種克氏原螯蝦的共養模式，如蝦蟹共養、藕蝦共養及水稻的一稻兩蝦和一稻一蝦等，對多種共養模式影響克氏原螯蝦的氨基酸品質的綜合評價尚未報道，高品質克氏原螯蝦的共養模式對克氏原螯蝦品質影響的內在機制也有待研究。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種通過正交變換將一組可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量，用簡化的數據反映原始數據的多元統計分析方法[14]。PCA已被廣泛用于食品品質的綜合評價，范婷婷等[15]利用PCA對不同省份人工種植和野生羊肚菌的FAA進行分析，發現特征性FAA的含量高低直接影響羊肚菌的風味，區分效果較好。克氏原螯蝦的品質中，滋味品質是決定克氏原螯蝦被消費者喜愛程度的重要指標，而FAA是一類重要的味覺活性成分，是決定克氏原螯蝦滋味的關鍵因子。每種FAA具有獨特的滋味，如鮮味、甜味、苦味等，其含量會直接影響食物的鮮美程度[16]。甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）等是甜味氨基酸[16-18]，其中Gly和Ala對蟹、蝦等水產品的滋味有重要貢獻[14-15]。魚、蝦、貝等水產動物中各種FAA含量豐富，谷氨酸（Glu）等鮮味氨基酸對水產動物的鮮美滋味有決定性作用[19]。精氨酸（Arg）是克氏原螯蝦蝦尾肉中含量最高的氨基酸，且呈味貢獻也最大[3,13]。天然Arg呈苦味，但有助于食物呈愉悅的滋味而非苦味，有提高味道的豐富性和鮮度的作用[17]。克氏原螯蝦蝦頭因含有肝胰臟、性腺等器官，其FAA的含量高于蝦尾肉[3]。利用PCA法對克氏原螯蝦中FAA的呈味氨基酸進行綜合評價，有助于篩選出呈味氨基酸含量高的克氏原螯蝦的養殖模式。FAA對克氏原螯蝦的鮮美滋味有重要貢獻，本研究擬通過對江蘇興化地區不同共養模式的克氏原螯蝦肉中FAA的組成和含量及氨基酸的滋味活性值（taste active value，TAV）進行分析，并采用PCA法和聚類分析法進行綜合評價，建立綜合評價模型，以期為克氏原螯蝦的特征風味研究、克氏原螯蝦特征風味品質的養殖模式篩選提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦于2022年8月取樣于江蘇興化。

樣品信息：一稻兩蝦（RC1），興化市萬顆子糧食種植家庭農場；一稻兩蝦（RC2），興化市香湖糧食種植家庭農場；一稻一蝦（不開溝）（RC3），興化市谷滿倉家庭農場；蝦蟹混養（CC1），興化市七里八鄉水產生態養殖專業合作社；蝦蟹混養（CC2），興化市銀桂水產品養殖專業合作社；藕蝦模式（LC），興化市沙溝鎮克氏原螯蝦協會。

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸混合標準溶液、茚三酮顯色液（色譜純）日本Wako公司；純凈水娃哈哈集團；0.22 μm濾膜 美國Merck Millipore公司。

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；5424R高速低溫離心機 德國Eppendorf公司；T25高速勻漿機、Kylin-Bell Vortex-5渦旋混勻器 德國IKA公司；HI-9025酸度計 意大利Hanna公司；-40 ℃冰箱中國海爾集團；Alpha1-2LDplus實驗室型凍干機 德國Chris公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 中國寧波新芝公司；上海精宏DHG-9036A恒溫干燥箱 中國光明公司；ME104E電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

剝取出蝦尾肉，進行真空冷凍干燥：將蝦肉（5 只）放入平皿中，在-40 ℃冰箱中冷凍24 h，取出放置于凍干機中真空冷凍干燥48 h，取出后利用小型粉碎機粉碎成粉后保存于-40 ℃冰箱。稱取0.05 g樣品，加入5 mL TCA（0.1 g/mL），樣品渦旋混勻，采用超聲波處理15 min后，4 ℃靜置2 h，4 ℃、10000×g離心10 min后取2 mL上清液，調pH值至2.0，最后用pH 2.0的TCA溶液定容至5.0 mL，經0.22 μm濾膜過濾后用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量。蝦肉中水分含量采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法，利用恒溫干燥箱烘干稱質量結果進行計算。

1.3.2 檢測方法

使用L-8900氨基酸自動分析儀測定氨基酸，利用優化過的離子交換-茚三酮柱后衍生法：陽離子交換柱（4.6 mm×60 mm）；分離柱溫度57 ℃，檢測器溫度135 ℃；流動相流速0.40 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長：570 nm（17 種氨基酸），440 nm（脯氨酸）；結果用儀器自帶軟件EZChrom Elite分析。

1.3.3 TAV分析

TAV是呈味物質的測定值與其滋味閾值之比，TAV=C1/C2，其中，C1為呈味氨基酸的測定值/（mg/g）；C2為該氨基酸的滋味閾值/（mg/g）[20]。

1.3.4 PCA及綜合評價

采用SPSS 18對數據進行因子分析，得到原始數據相關矩陣的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率、成分矩陣等，根據所得信息對本研究的數據作綜合評價，分析中提取特征值大于1.00的因子作為PC。以每個PC所對應特征值的方差貢獻率λi（i=1，2，3，…，k）為權重數，由各PC得分Xi與對應的權重相乘得到最終的綜合評價模型：PC=λ1X1+λ2X2+…+λkXk[14]。

1.3.5 聚類分析

采用OriginPro 2018C對各養殖模式的克氏原螯蝦肉中FAA的測定結果作聚類分析（Ward最小方差和歐氏距離法）。

1.4 數據處理

通過單因素方差分析（SPSS Statistics 18）對數據作顯著性分析，分析方法為Duncan多重范圍檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同養殖模式克氏原螯蝦肉FAA的組成與含量

由表1可知，從各養殖模式的克氏原螯蝦肉中共檢測到17 種FAA。不同養殖模式的克氏原螯蝦肉的FAA總含量在21.80～27.11 mg/g之間，其中養殖模式RC1的克氏原螯蝦肉FAA含量最高（（27.11±1.03）mg/g），RC2、LC和CC2與其沒有顯著差異。Arg在所測6 組克氏原螯蝦肉中均為含量占比最高的FAA，占總FAA的含量最高達67.76%（RC3），占比最低55.64%（RC2）。除含量占絕對優勢的Arg外，蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）的含量在各養殖模式的克氏原螯蝦肉中的含量居其次。其中，Thr在所測克氏原螯蝦肉中的占比在5.09%～9.16%之間，Ala的含量在5.84%～11.81%之間。6 組克氏原螯蝦肉中天冬氨酸（Asp）的含量均為最低，0.01～0.02 mg/g，僅占FAA總量的0.04%～0.09%。必需氨基酸在6 組克氏原螯蝦肉中占比在7.12%～16.30%之間，其中養殖模式RC1的克氏原螯蝦肉中必需氨基酸含量最高（（4.42±0.13）mg/g），占FAA總量的16.30%，RC2的克氏原螯蝦肉中必需氨基酸含量與RC1無顯著差異，CC2養殖模式的克氏原螯蝦肉中必需氨基酸含量最低（（1.93±0.45）mg/g）。

表1 不同養殖模式克氏原螯蝦肉中FAAs的組成與含量Table 1 Contents of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.2 滋味分析

由表1可知，RC2模式養殖的克氏原螯蝦肉中Glu的含量為（0.35±0.08）mg/g，顯著高于其他養殖模式的克氏原螯蝦肉，而CC1養殖模式的克氏原螯蝦肉中Glu含量最低（（0.12±0.03）mg/g）。RC2養殖模式的克氏原螯蝦肉中甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala）的含量也為最高（（7.67±2.62）mg/g），占FAA總量的28.58%，但是與RC1養殖模式的甜味氨基酸含量差異不顯著。CC1養殖模式的甜味氨基酸含量最低（（3.82±0.17）mg/g）。Ser和Thr為甜味氨基酸[21]。

對不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的TAV進行評價（表2），大部分氨基酸的TAV小于1，對克氏原螯蝦肉的滋味無貢獻。Arg的TAV最高，貢獻最大。Arg是所有養殖模式的克氏原螯蝦肉中占FAA總量比例最高的氨基酸。6 組克氏原螯蝦肉中的甜味氨基酸Ala和苦味氨基酸His的TAV也都大于1。Glu作為鮮味最強的氨基酸，只在RC2模式的克氏原螯蝦肉中TAV大于1。只有RC、RC2、CC2克氏原螯蝦肉中的Gly的TAV大于1，分別為1.06、1.67、1.15，呈味作用差異顯著。通過對FAA滋味的綜合分析，發現養殖模式RC2的克氏原螯蝦肉的鮮味和甜味氨基酸的TAV最高，味道最為鮮美。

表2 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.3 相關性分析

在做PCA之前，需對數據進行適應性檢驗[14]。如表3所示，各氨基酸之間有正相關也有負相關，且大部分呈顯著相關（P＜0.05），尤其是Glu與Ser，Gly與Ala，Pro與Thr、Lys、Val、Ile、Leu、His，Val與Thr、Asp、Pro，His與Thr、Ser、Pro、Lys、Val等之間相關系數在0.8以上，這表明克氏原螯蝦肉中的FAA間相關性較強，可通過PCA對不同養殖模式克氏原螯蝦肉中的FAA進行綜合評價。

表3 FAA間相關性分析Table 3 Correlation analysis among free amino acids

2.4 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的PC差異

特征值代表某一項PC所反映原始變量信息的權重，由表4可知，經PCA所抽取的3 個PC特征值均大于1，累計方差貢獻率為89.937%（累計方差貢獻率大于85%即被認為能較好地反映原始信息）。選取前3 個PC，反映不同養殖模式克氏原螯蝦肉FAA的大部分信息。由圖1可知，6 組養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的區分效果較好，所有數據點均位于95%置信區間內。

圖1 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的PCA得分圖Fig.1 PCA score plot of major free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

表4 PC的特征值和貢獻率Table 4 Eigenvalues of principal components and their contribution rates and cumulative contribution rates

如表5所示，特征向量代表各氨基酸在所提取3 個PC矩陣中的權重系數，載荷值表示原始變量對所取因子影響的大小，正負代表方向。3 個PC從不同方面反映不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的綜合品質，PC1方差貢獻率為51.934%，主要代表Ser、Thr、Val、His、Leu、Ile、Cys、Glu、Gly、Pro、Tyr的信息。PC2方差貢獻率為27.747%，主要代表Pro、Glu、Ala、Asp、Gly、Tyr、Phe、Met的變異信息。PC3方差貢獻率為10.256%，其載荷絕對值最大的前2 位是Phe、Met。3 個PC基本上能代表所測氨基酸的大部分信息。

表5 PC的特征向量與載荷矩陣Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

2.5 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的綜合評價

由前述分析可知，利用經PCA提取的3 個因子（可以代表所有FAA信息的89.937%）對6 組養殖模式的克氏原螯蝦肉中的FAA進行綜合評價可行。將PC1、PC2、PC3作為3 個新變量替代原17 個指標，得到克氏原螯蝦肉中FAA的前3 個PC線性關系分別為：

以每個P C 對應的方差相對貢獻率作為權重，對3 個P C 得分進行權重加和，建立綜合評價函數PC=0.519PC1+0.277PC2+0.103PC3，計算各組的綜合得分，分數高低可反映不同養殖模式克氏原螯蝦肉中FAA綜合品質的高低。由表6可知，3 個PC綜合得分最高的是RC2，其次是RC1，得分最低的是CC1，稻蝦模式養殖的克氏原螯蝦肉的FAA綜合品質相對較好。

表6 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的成分得分和綜合評價Table 6 Principal component scores and comprehensive assessment of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

2.6 聚類分析

對不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的品質進行聚類分析，結果如圖2所示，上方樹狀為不同組別的養殖模式聚類，左側樹狀為FAA的聚類。從上方聚類看，6 組克氏原螯蝦肉的FAA品質可分為3 類，第1類為RC2，品質最好，甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量較高；第2類為RC1和LC，品質較好，甜味氨基酸中的Thr、Pro含量較高；第3類為CC1、CC2、RC3，品質較差，鮮味和甜味氨基酸含量較低，Met、Phe、Leu等苦味氨基酸含量較高。FAA的聚類可分為5 大類，Arg單獨一類，含量較高且與其他氨基酸相關性較弱；Asp、Gly、Glu、Ala、Tyr聚為一類，是主要鮮味和甜味氨基酸；Met作為限制氨基酸單獨一類；其余氨基酸主要為苦味氨基酸，分為2 類。聚類分析與PCA結果相近，可以較好體現不同養殖模式的克氏原螯蝦肉的差異性。

圖2 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉FAA的聚類分析熱圖Fig.2 Dendrogram from cluster analysis of free amino acids in meat of crayfish from different co-culture modes

3 討論

從各養殖模式的克氏原螯蝦肉中共檢測到17 種FAA，王曜等[3]從野生和養殖克氏原螯蝦肉中共檢測到15 種FAA。與之相比，本研究檢測出脯氨酸（Pro）和半胱氨酸（Cys）2 種氨基酸，這可能與FAA提取方法和檢測靈敏度及養殖模式差異等有關。不同養殖模式的克氏原螯蝦肉的FAA總含量在21.80～27.11 mg/g之間，該結果顯著高于王曜等[3]在養殖克氏原螯蝦肉中檢測的總FAA的6.96 mg/g。Arg為含量占比最高的FAA，天冬氨酸（Asp）在6 組克氏原螯蝦肉中的含量都為最低，結果與王曜[3]和Liu Qiao[13]等在養殖克氏原螯蝦肉中檢測到的Arg和Asp含量接近。此外，研究發現，Ala和Arg在FAA含量占絕對優勢是甲殼類動物的重要特征[19-23]。

FAA是食品中的主要呈味物質之一，根據滋味特征，可將FAA分為鮮味氨基酸（Glu、Asp）、甜味氨基酸（Ala、Thr、Ser、Gly、Pro）、苦味氨基酸（Arg、Lys、Val、Tyre、Phe、Met、Ile、Leu、Cyst、Met、His）[16]。不同呈味FAA間的相互作用影響克氏原螯蝦肉的鮮美滋味。養殖模式RC2的克氏原螯蝦肉中有更高含量的鮮味氨基酸（Glu和Asp），占FAA總量的1.31%。在所有呈味氨基酸中，Glu呈鮮滋味最強[24]。此外，Glu是作用于大腦和外周組織的主要興奮性神經遞質，進入人體后，結合氨形成谷氨酰胺，減輕氨的毒性作用，因而能治療肝昏迷，還能促進血液循環改善皮膚和毛發狀況[25]。CC1養殖模式的甜味氨基酸含量最低（（3.82±0.17）mg/g）。Ser和Thr是甜味氨基酸[21]。Gly、Ala能使水產動物肌肉產生令人愉悅的甜味，例如河豚魚、螃蟹等，其中Gly還能減弱食物中令人不悅的苦味[23,26]。

不同氨基酸的味覺感知閾值不同，含量高的氨基酸對滋味的貢獻不一定大，因此需要進一步采用TAV對各氨基酸進行呈味貢獻評價。TAV＞1時，該種呈味物質對于食物呈味有影響，數值越大貢獻越大；TAV＜1時，表示該物質呈味貢獻不大。Arg是所有養殖模式的克氏原螯蝦肉中占FAA總量比例最高的氨基酸。Arg加入蔗糖、谷氨酸鈉、NaCl、咖啡和檸檬酸等溶液中改善對各物質甜、鮮、咸、苦、酸的感知[27]。只有RC2模式的克氏原螯蝦肉中Glu的TAV大于1，RC、RC2、CC2克氏原螯蝦肉中的Gly的TAV大于1，呈味作用差異顯著。通過對FAA滋味的綜合分析，發現養殖模式RC2的克氏原螯蝦肉的鮮味和甜味氨基酸的TAV最高，味道最為鮮美。不同的養殖模式中使用的飼料營養成分[28-30]、放養密度和形式[8]、形成的微生態系統[6]、飼養環境如水溫、pH值、含氧量、微生物[19,23-24]、克氏原螯蝦腸道微生物等的差異[13]，可能造成了克氏原螯蝦肌肉中FAA的組成和含量的不同。

PCA可以將原始變量的大量指標信息用較少的變量（通常為5 個以內）反映出來[14]，已被廣泛用于農產品品質評價。本實驗利用PCA，從17 種氨基酸中提取得到3 個PC變量較好地反映了克氏原螯蝦肉FAA品質的綜合信息。各氨基酸與相應PC的相關性由載荷值表明，載荷值的絕對值越大，相關程度越高。表5結果表明，所提取的3 個PC變量基本上能代表所測氨基酸的大部分信息。利用3 個PC變量建立綜合評價模型：PC=0.519PC1+0.277PC2+0.103PC3，通過該模型進行計算，得分越高反映不同養殖模式的克氏原螯蝦肉中FAA品質越好。聚類分析利用確定的標準如歐氏距離或曼哈坦聚類計算樣品之間的相關性，根據相關程度將各評價對象進行簡化合并，可以更直觀地綜合比較評價對象[31]。PCA結合聚類分析可以簡化品質評價工作[31]。聚類分析將6 組克氏原螯蝦肉分為3 類，與PCA結果相近，RC2品質最好，CC1、CC2、RC3的品質較差，可以較好地體現不同養殖模式的克氏原螯蝦肉的差異性。FAA品質的差異性受養殖的環境、生物模式、投放蝦苗情況及飼喂情況等多種因素的影響，本研究結果可為地方特色克氏原螯蝦養殖模式、氨基酸營養價值、滋味品質提升等提供一定參考依據。

4 結論

興化地區不同養殖模式的克氏原螯蝦肉中FAA的總含量在21.80～27.11 mg/g之間，其中養殖模式RC1的克氏原螯蝦肉FAA含量最高（（27.11±1.03）mg/g）。Arg在6 組克氏原螯蝦肉中均為含量最高的FAA，占總FAA的含量最高達67.76%（RC3），最低55.64%（RC2）。RC2養殖模式的克氏原螯蝦肉中鮮味氨基酸和甜味氨基酸的含量最高，CC1養殖模式的鮮味和甜味氨基酸含量最低。大部分氨基酸的TAV小于1，對克氏原螯蝦肉的風味無貢獻。通過FAA的滋味綜合分析發現養殖模式RC2克氏原螯蝦肉的鮮味和甜味氨基酸TAV最高，味道最為鮮美。PCA建立的綜合評價模型計算結果表明，RC2得分最高品質最好，CC1模式得分最低品質較差。聚類分析將6 組克氏原螯蝦肉分為3 類，與PCA結果結合較好地體現了不同養殖模式克氏原螯蝦肉的差異性。綜上所述，在蝦肉FAA的品質方面，稻蝦模式（一稻二蝦）養殖的克氏原螯蝦肉品質相對較好，蝦蟹混養模式較差。克氏原螯蝦在我國養殖地域廣泛，養殖模式眾多，本研究為篩選適合養殖滋味鮮美的克氏原螯蝦的模式提供一定的基礎，為建立優質克氏原螯蝦的養殖模式提供更全面的指導，需要結合克氏原螯蝦肉的其他品質性質進行綜合分析。