聯苯四氮唑沙坦類藥物廣譜性抗體的制備及其在降壓類保健食品中多殘留檢測ic-ELISA法的應用

劉鳳銀，蘇珮韻，林浩標，劉 匯，陳嘉儀，盧梓程，穆洪濤，李攻科,

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東 廣州 510303；2.中山大學化學學院，廣東 廣州 510006；3.華南農業大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

沙坦類藥物為一類抗高血壓藥物，臨床上主要用于治療高血壓、心衰和冠心病等[1-2]。依據其結構可分為聯苯四氮唑類和非聯苯四氮唑類[3]，前者的結構式中均含有聯苯四氮唑環，主要包括坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯等，結構見圖1；后者主要包括阿奇沙坦、甲磺酸依普羅沙坦和替米沙坦等。保健食品中的聯苯四氮唑沙坦類藥物主要來源于非法添加。我國《食品安全法》明確規定，保健食品不得添加藥品。一些不法分子為使其效果顯著，向降壓類保健食品中非法添加降壓類藥物，而尚未在原國家食品藥品監督管理總局發布《保健食品中75 種非法添加化學藥物的檢測》（BJS 201710）名單中的聯苯四氮唑沙坦類藥物，成為不法分子為規避處罰，非法添加的降壓類備選藥物。而非法添加的藥物存在來源不明確、兼容性不明確和添加量不明確等問題，對消費者的健康帶來很大的安全隱患。

圖1 8 種聯苯四氮唑沙坦類藥物的化學結構式Fig.1 Chemical structures of eight biphenyl tetrazolium sartans

針對聯苯四氮唑沙坦類藥物，國外研究者主要關注于其對環境生態的危害問題，開展其在環境水資源中的殘留檢測及生態風險評估研究[4-6]；國內研究者主要關注于降壓類保健食品和中成藥中的非法添加現象[7-8]。采用的檢測方法主要有液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[7,9]、高效液相色譜法[8,10]等，該類儀器檢測方法準確性好、靈敏度高，但儀器設備昂貴、專業化要求較高，方法普及受限。因此，建立一種準確靈敏、快速簡便的分析方法用于降壓類保健食品中聯苯四氮唑沙坦類藥物非法添加的檢測十分必要。基于抗原-抗體特異性反應的免疫分析技術具有準確、靈敏、快速的特點，尤其適用于現場篩查和大批量樣品的快速分析，為食品安全提供了重要保障[11-12]。基于廣譜性抗體建立的免疫檢測方法，可通過一次實驗同時篩查多種待測物，在分析通量、實用性、成本方面具有突出優勢[13-14]。目前，國內外鮮見有關于聯苯四氮唑沙坦類藥物免疫檢測方法的報道。

本研究基于免疫分析技術，針對聯苯四氮唑沙坦類藥物的共性結構，通過人工抗原的制備和動物免疫，制備其廣譜特異性抗體，建立其間接競爭酶聯免疫吸附檢測（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）法，并用于降壓類保健食品中聯苯四氮唑沙坦類藥物的多殘留檢測，檢測結果采用LC-MS/MS法確證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品購于國內互聯網商店；SPF級雌性純種新西蘭大白兔購于廣東省醫學實驗動物中心。

坎地沙坦（純度98%）天津希恩思生化科技有限公司；氯沙坦羧酸（純度98%）上海撫生實業有限公司；洛沙坦鉀（純度99%）上海安耐吉化學有限公司；奧美沙坦酯（純度≥98%）、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（純度99%）上海源葉生物科技有限公司；纈沙坦（純度95%）上海麥克林生化科技有限公司；奧美沙坦（純度≥98%）、纈沙坦甲酯（純度95%）、阿奇沙坦（純度≥99%）、甲磺酸依普羅沙坦（純度≥99%）、替米沙坦（純度≥98%）、厄貝沙坦（純度≥98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（純度99%）、1,3-二環己基碳二亞胺（純度99%）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、N,N-二甲基甲酰胺（無水級99.8%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體 美國Earthox公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度高于98%）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA，純度高于98%）上海昂一生物科技有限公司；弗氏完全和不完全佐劑 美國Sigma公司；96 孔微孔板 廈門怡佳美實驗器材有限公司；針筒式有機過濾器（0.22 μm）天津市津騰實驗設備有限公司；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；TOM-3PW自動洗板機 上海托莫斯科學儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；Neofuge 13R高速冷凍離心機上海力申科學儀器有限公司；UNIQUE-R20實驗室多功能純水系統 銳思捷科學儀器有限公司；LCMS-8050超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀 日本島津公司；Amicon Ultra-0.510 kDa超濾離心管 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原合成與結構鑒定

采用活潑酯法，將坎地沙坦與BSA偶聯制備免疫原坎地沙坦-BSA，將坎地沙坦、氯沙坦羧酸、奧美沙坦和纈沙坦分別與OVA偶聯，制備包被原坎地沙坦-OVA、氯沙坦羧酸-OVA、奧美沙坦-OVA和纈沙坦-OVA。人工抗原合成路線圖如圖2所示。具體偶聯方法：將0.05 mmol半抗原溶于500 μLN,N-二甲基甲酰胺中，攪拌中加入0.1 mmol 1,3-二環己基碳二亞胺和0.1 mmolN-羥基琥珀酰亞胺，4 ℃磁力攪拌反應過夜，離心后取上清液；攪拌中，將上清液逐滴滴加到溶解有適量載體蛋白的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）溶液中，4 ℃磁力攪拌反應12 h；4 ℃、12000 r/min離心10 min，取上清液。4 ℃用PBS透析3 d得人工抗原，-20 ℃分裝貯存。上述半抗原與BSA、OVA的物質的量比分別為100∶1、60∶1。

圖2 人工抗原合成技術路線圖（以坎地沙坦-BSA為例）Fig.2 Scheme for preparation of artificial antigen (taking candesartan-BSA for example)

在220～320 nm波長間分別對載體蛋白、人工抗原和半抗原進行紫外掃描，比較三者的紫外吸收光譜曲線，判定人工抗原是否制備成功。免疫原用超濾管脫鹽，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MADLI-TOF MS）法測定其分子質量，計算偶聯比。

1.3.2 動物免疫與抗體特性評價

將上述制備的免疫原免疫2 只2.5 kg雌性新西蘭大白兔，采集抗血清。免疫方法：將免疫原（500 μg/只）與等劑量的弗氏佐劑混合乳化，采用皮內、皮下、肌肉多點注射免疫；首次免疫后，于第31、52、73天以同樣方式進行加強免疫。首次免疫采用弗氏完全佐劑，加強免疫采用弗氏不完全佐劑。于第80天心臟采血，將血室溫靜置0.5～1 h，4 ℃、12000 r/min離心15 min，收集上清液獲得抗血清，分裝后于-20 ℃保存備用。

采用ic-ELISA法，在包被原和目標分析物的質量濃度均為1 μg/mL時，測定同源和異源不同包被模式下抗血清的效價和抑制率。抑制率按照式（1）計算：

式中：A450nm效價孔為在一定包被濃度和抗體稀釋倍數下，不含目標分析物的測試孔的吸光度；A450nm抑制孔為在特定包被濃度和抗體稀釋倍數下，含有一定濃度目標分析物測試孔的吸光度。

1.3.3 ic-ELISA建立

參照楊武英等[15]的ic-ELISA實驗步驟，采用棋盤滴定法確定最佳包被原濃度和抗血清稀釋倍數；通過單因素試驗，考察理化因素緩沖液pH值（5.4、6.4、7.4、8.4）、緩沖液離子濃度（5、10、20、40 mmol/L）、競爭反應時間（20、30、40、50、60 min）對ic-ELISA檢測性能的影響。以目標分析物濃度的對數值為橫坐標，吸光度A450nm為縱坐標，繪制抑制曲線，計算最大吸光度Amax、半抑制濃度IC50及Amax/IC50。選取Amax較大、IC50較小、Amax/IC50較大且曲線擬合度好的反應條件作為最佳工作條件。

1.3.4 交叉反應率評價

選取7 種聯苯四氮唑沙坦類藥物和3 種非聯苯四氮唑沙坦類藥物進行交叉反應實驗。分別繪制每種藥物的抑制曲線，計算其對應的IC50、檢出限IC10。交叉反應率按式（2）計算：

1.3.5 樣品前處理

參照王超等[16]的方法并適當調整。具體如下：固體樣品（片劑、硬膠囊和茶葉）取10 次服用劑量用磨粉機磨粉后，過30 目篩；液體樣品（軟膠囊）取10 次服用劑量的內容物混勻。準確稱取1 次服用劑量的樣品于50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇超聲提取15 min，冷卻后甲醇定容，過0.22 μm有機相濾膜，得提取液。用PBS或甲醇適當稀釋后分別采用ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定。

1.3.6 基質效應評價

選取4 種劑型的空白樣品（經LC-MS/MS法測定不含有8 種目標分析物），按照1.3.5節樣品前處理步驟，制備空白基質溶液。將空白基質溶液用PBS稀釋100、500、1000 倍后作為稀釋液，分別配制一系列濃度梯度的坎地沙坦標準溶液，進行ic-ELISA實驗，繪制基質標準曲線，與以PBS作為稀釋液繪制的溶劑標準曲線進行比對。

1.3.7 LC-MS/MS法確證

色譜條件：色譜柱Endeavorsil C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL；流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，15% A、85% B；1～3 min，15%～40% A、85%～60% B；3～6 min，40%～60% A、60%～40% B；6～8 min，60%～85% A、40%～15% B；8～12 min，85% A、15% B；12～15 min，85%～50% A、15%～50% B；15～19 m i n，50%～15% A、50%～85% B；19～20 min，15% A、85% B。

質譜條件：電噴霧離子源正離子模式；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；干燥氣流量10 L/min；加熱塊溫度400 ℃；接口電壓4.0 kV；接口溫度300 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；多反應選擇監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），采用分段采集（利用軟件的自帶功能，根據每個目標分析物的保留時間自動設置MRM事件時間）。主要質譜參數見表1。

表1 主要質譜參數Table 1 MS/MS parameters

1.4 數據處理

采用ChemDraw pro 18繪制化學結構式；采用Origin pro 2018繪制抑制曲線；采用Excel 2010繪制表格。

2 結果與分析

2.1 人工抗原合成與結構鑒定

采用紫外掃描判定人工抗原是否偶聯成功。由于結構不同，載體蛋白和半抗原在紫外下有各自不同的特征吸收峰，偶聯后兩者的共軛結構相互作用，若人工抗原相較于載體蛋白的紫外吸收光譜發生明顯偏移，則說明人工抗原合成成功[17]。半抗原、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜見圖3。可以看出，人工抗原的光譜曲線明顯區別于相應的載體蛋白，說明人工抗原合成成功。

圖3 人工抗原的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV spectra of artificial antigens

采用MADLI-TOF MS測定BSA和免疫原坎地沙坦-BSA的分子質量，計算偶聯比。從圖4可知，BSA相對分子質量為66433，坎地沙坦-BSA相對分子質量為68672。坎地沙坦與BSA通過酰胺鍵偶聯，BSA分子上偶聯1 個坎地沙坦分子，相對分子質量增加422.5，計算得到坎地沙坦-BSA的偶聯比為5.3。

圖4 BSA（A）及坎地沙坦-BSA（B）質譜圖Fig.4 Mass spectra of BSA (A) and candesartan-BSA (B)

2.2 抗體特性評價

不同包被模式下，抗血清記作PAb-坎地沙坦的效價和抑制率測定結果見表2，其中包被原質量濃度和待測物質量濃度均為1 μg/mL。同源包被模式下，PAb-坎地沙坦的效價為243000，對坎地沙坦的抑制率為65%，對其他3 種待測物無抑制；以纈沙坦-OVA作為包被原的異源包被模式下，PAb-坎地沙坦的效價為9000，對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、奧美沙坦和纈沙坦4 種待測物均呈現了很高的抑制率，分別為92%、93%、92%和91%；以氯沙坦羧酸-OVA和奧美沙坦-OVA作為包被原時，PAb-坎地沙坦的效價為9000，但抑制率很低或抑制率為0%。可能原因是纈沙坦分子結構中不含苯并咪唑或咪唑結構，這種結構上的差異使得纈沙坦-OVA作為包被原時，對抗體的親和力較小，提高了抗體對游離藥物的檢測靈敏度[18]。實驗以抗血清PAb-坎地沙坦、包被原纈沙坦-OVA建立ic-ELISA法。

表2 不同包被模式下抗血清PAb-坎地沙坦的效價及抑制率Table 2 Titers and inhibition rates of antiserum PAb-candesartan under heterologous and homologous coating modes

2.3 ic-ELISA法建立

最佳工作條件：包被原質量濃度為4 μg/mL，抗血清稀釋倍數為1∶15000，反應體系為PBS（pH 7.4，10 mmol/L），競爭反應時間為30 min。在最佳工作條件下建立坎地沙坦標準曲線，如圖5所示。緩沖溶液體系中，方法對坎地沙坦的檢出限IC10為0.012 ng/mL，IC50為0.18 ng/mL，線性范圍IC20～IC80為0.032～1.02 ng/mL。

圖5 ic-ELISA法檢測坎地沙坦的標準曲線（n=3）Fig.5 Standard curve for the detection of candesartan by ic-ELISA (n =3)

2.4 交叉反應率評價

在以纈沙坦-OVA作為包被原的異源包被模式下，抗血清PAb-坎地沙坦對10 種沙坦類藥物的交叉反應率見表3。免疫半抗原坎地沙坦為聯苯四氮唑沙坦類藥物，含有聯苯四氮唑沙坦類藥物含有的共性結構聯苯四氮唑結構，故以其作為免疫半抗原制備的抗血清PAb-坎地沙坦對其他7 種聯苯四氮唑沙坦類藥物均呈現了較好的異源親和能力，對氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯的交叉反應率分別為109%、27%、495%、32%、55%、21%、7%；非聯苯四氮唑沙坦類藥物的分子結構中不含有聯苯四氮唑沙坦類藥物，抗血清PAb-坎地沙坦對阿奇沙坦、甲磺酸依普羅沙坦和替米沙坦的交叉反應率低于0.1%，說明該抗血清對聯苯四氮唑結構具有特異性識別能力。抗血清PAb-坎地沙坦對8 種聯苯四氮唑沙坦類藥物的IC50在0.04～2.4 ng/mL之間，具有良好的廣譜特異性。

表3 ic-ELISA法對沙坦類藥物的檢出限、IC50、線性范圍及交叉反應率檢測結果（n=3）Table 3 Detection limit,IC50,linear range and cross-reactivity of ic-ELISA for sartans (n =3)

2.5 基質效應評價

基質成分引起的基質效應（待測物響應增強或響應抑制）會嚴重影響定量分析結果的準確性[19-20]。ELISA實驗中常用的基質效應消除方法有標準稀釋液稀釋法[21-22]、基質匹配標準溶液法[23-24]、基質多重凈化法[25-27]等。基質匹配標準溶液法是利用空白基質提取液作為待測物的稀釋液，建立校正曲線，可同等程度地補償目標分析物在樣品提取液和標準溶液中的響應強度差異，是一種常用的基質效應消除方法。但由于不同樣品的基質性質差異較大，在實際檢測中為保證檢測的準確性，需要針對每種待測樣品基質制備其空白提取液及基質匹配標準曲線，工作量大，不適用大批量不同類型樣品的檢測。基質多重凈化法是采用多種凈化方法，如固相萃取[28]、磁富集[29]和液相色譜分離法[30]等，盡可能地將除目標分析物之外的其他基質成分去除，以消除其可能帶來的基質干擾。該方法往往對實驗設備要求較高，操作較為繁瑣，耗時長，適用于對靈敏度要求較高的樣品檢測。標準稀釋液稀釋法是通過用標準稀釋液對樣品提取液進行一定程度的稀釋，將樣品中的基質成分降低到較低水平，進而減弱或消除其帶來的基質效應。該方法操作簡便，不需要復雜的樣品前處理方法，也不需要每次檢測時針對每種樣品基質制備空白提取液，在實際檢測應用中可操作性強。

鑒于建立的ic-ELISA法對8 種目標分析物的靈敏度IC50在0.04～2.4 ng/mL之間，靈敏度遠高于其在保健食品中的實際含量水平，為提高實驗的簡便性，本實驗探究采用標準稀釋液稀釋法消除基質效應的可行性。鑒于不同劑型的降壓類保健食品的輔料差別較大，故實驗考察片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種不同劑型樣品的基質效應，結果見圖6。4 種樣品基質采用簡單的甲醇提取法對樣品進行前處理后，提取液經PBS稀釋1000 倍后的標準曲線與溶劑標準曲線趨勢一致，兩者基本重合，基質效應均可忽略。因此，樣品提取液用PBS稀釋至少1000 倍后用于ic-ELISA測定。

圖6 4 種不同樣品基質對ic-ELISA性能的影響Fig.6 Effects of four different sample matrices on ic-ELISA performance

2.6 添加回收率測定

將8 種聯苯四氮唑沙坦類藥物的混合標準溶液逐級稀釋，進行LC-MS/MS法測定，當信噪比為3時，計算得到LC-MS/MS法對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯的檢出限分別為0.2、0.6、0.1、0.2、0.5、0.3、0.3 ng/mL和0.03 ng/mL。8 種目標分析物在5～100 ng/mL范圍內，均呈線性關系。保健食品中添加的藥物需達到一定劑量后，才能發揮有效的藥物作用；如果劑量過小，其被人體吸收后不能達到有效濃度，便無法發揮藥效[16]。目前已報道的聯苯四氮唑沙坦類藥物在保健食品中的檢出量為1.8～88.2 mg/g[10]。鑒于此，為適應可能非法添加有聯苯四氮唑沙坦類藥物的保健食品其實際含量水平，實驗選取0.1、1、10、100 mg/g四個添加水平，測定8 種目標分析物在片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種劑型的降壓類保健食品中的添加回收率。結果顯示，8 種目標分析物ic-ELISA法的平均回收率為80.6%～120.0%之間變異系數在0.3%～14.0%之間，具有良好的回收率和重復性；LC-MS/MS法的平均回收率在81.0%～118.4%之間，變異系數在0.1%～8.4%之間。兩者檢測結果的相關性見圖7，8 種目標分析物的相關系數r均不低于0.97。ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定結果一致性良好，說明實驗所建立的ic-ELISA法準確性良好。

圖7 ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定結果相關性曲線Fig.7 Correlation of LC-MS/MS results with ic-ELISA results

2.7 盲樣檢測

選取14 份不同劑型的降壓類保健食品，其中片劑2 份、硬膠囊3 份、軟膠囊4 份和茶葉5 份，同時采用ic-ELISA法和LC-MS/MS法進行檢測，均未檢出目標分析物。從每種樣品基質中隨機選取一份樣品，進行加標回收測試，加標量為0.10 mg/g，結果見表4，兩種方法的添加回收率均較好，一定程度說明了本次盲樣檢測實驗的數據可信度高。

表4 ic-ELISA法和LC-MS/MS法盲樣檢測結果比較（n=3）Table 4 Comparison of blind analysis results by ic-ELISA and those by LC-MS/MS (n=3)

3 結論

本實驗采用免疫分析技術，針對聯苯四氮唑沙坦類藥物的結構特點，選取坎地沙坦作為通用半抗原，制備免疫原免疫動物并進行抗體特性評價，以纈沙坦-OVA作為包被原時，抗血清PAb-坎地沙坦取得了較好的效價和廣譜特異性，通過工作條件優化，建立了針對聯苯四氮唑沙坦類藥物多殘留檢測的ic-ELISA法，對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯8 種聯苯四氮唑沙坦類藥物的IC50分別為0.2、0.2、0.7、0.04、0.6、0.3、0.9、2.4 ng/mL，對3 種非聯苯四氮唑沙坦類藥物的交叉反應率小于0.1%。

對片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種不同劑型降壓類保健食品，采用甲醇超聲提取，標準稀釋液稀釋法消除基質效應，標準添加量為0.1、1、10、100 mg/g時，8 種目標分析物的添加回收率為80.6%～120.0%，變異系數為0.3%～14.0%；采用LC-MS/MS法對添加回收檢測結果進行確證，兩者測定結果相關系數r不低于0.97，一致性良好。本研究所建立的ic-ELISA法具有準確、快速、樣品前處理簡單、可多殘留檢測的優點，可用于降壓類保健食品中聯苯四氮唑沙坦類藥物的快速篩查。