矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學

王 偉，崔 妍，鄭明珠，蔡 丹，劉景圣，劉美宏，劉回民

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130118）

2型糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的復雜代謝性疾病，其發病率在世界范圍內呈現逐漸增高的趨勢[1]。通過抑制消化酶（如α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）延緩腸道葡萄糖吸收是降低高血糖的有效手段[2]。阿卡波糖、伏格列波糖等常用于治療糖尿病的藥物，是通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性減少碳水化合物的水解。然而，這些藥物會對人體產生一定的副作用，例如胃腸道不適、肝酶損傷、腎功能損害等[3-4]。因此，尋找具有輕微或無不良影響的新型α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶天然抑制劑應用于高血糖預防和治療非常重要。研究指出，天然來源的植物多酚具有較強的消化酶抑制活性和較低的毒性[5]。任順成等[6]發現梔子黃通過競爭性抑制的方式能顯著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。此外，一些天然類黃酮化合物被發現可以通過非競爭性抑制模式顯著抑制α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的活性，例如芹菜素、楊梅素以及槲皮素等[7-8]。

黑米花色苷（black rice anthocyanins，BRA）是黑米中的重要活性物質，主要是由矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）、花青素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷組成[9]。C3G屬于多酚類黃酮物質，具有多種生物活性，如抗炎、抗胰島素抵抗、調節血脂等[10]。已有研究發現，C3G可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低糖尿病小鼠的血糖水平并增強胰島素敏感性[11-12]。然而，C3G對α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的具體抑制機制尚不清楚。因此，本研究通過酶動力學、熒光猝滅以及分子對接等方法對其抑制機制做進一步的解析，以期為其在降糖保健食品的應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、豬胰α-淀粉酶、玉米淀粉 上海源葉生物科技有限公司；BRA、C3G 成都植標化純生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Fluostar omega多功能酶標儀 德國BMG Labtech公司；SQP電子天平 德國Sartorius公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AllegraX-30R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；LAMBDA365紫外-可見分光光度計 美國PerkinElmer公司；F7000熒光分光光度計日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果測定

采用PNPG法測定BRA對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[13]。將25 μL的樣品溶液與25 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液混合孵育15 min后，加入50 μL 1 mmol/L PNPG底物溶液。加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，隨后使用多功能酶標儀在405 nm波長處測定其吸光度。

采用3,5-二硝基水楊酸法測定BRA對α-淀粉酶的抑制活性[14]。0.3 mL BRA溶液（1、3、5、7、9 mg/mL）加入0.3 mL 2.5 U/mL的α-淀粉酶溶液?；旌弦涸?7 ℃預熱5 min，加入預溫的1%淀粉溶液反應15 min。使用多功能酶標儀在540 nm波長處測定吸光度。

1.3.2 超濾-高效液相色譜分析

將20 μL BRA（10 mg/mL）、20 μLα-淀粉酶（10 mg/mL）和160 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）混合并孵育30 min。置于10 kDa分子質量的超濾離心管離心20 min以截留復合物，并洗滌除去未結合的組分。使用體積分數50%甲醇溶液使α-淀粉酶變性。Ultimate LP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相A為甲醇，流動相B為0.5%甲酸溶液。洗脫方案如下：A相在0～2 min為90%，2～6 min為90%～80%，6～10 min為80%～70%，10～15 min為70%～65%，15～20 min為65%～50%，20～24 min為50%～10%，24～29 min為10%～90%，29～30 min為90%。柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min。結合率按下式計算：

式中：Aa為超濾篩選前各化合物色譜峰面積；Ab為親和篩選作用后活性酶結合的各化合物色譜峰面積；Ac為與變性酶結合的各化合物色譜峰面積。

1.3.3 酶抑制動力學

酶抑制動力學測定按照經典方法進行，略有修改[15]。具體如下：底物PNPG濃度調整為1 mmol/L，設定不同濃度α-葡萄糖苷酶（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 U/mL），添加不同濃度的C3G。根據酶濃度與酶反應速率變化關系圖，判斷酶促反應是否可逆。在α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）的條件下，隨著PNPG濃度（0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）增加，確定C3G對α-葡萄糖苷酶活性的抑制模式。

α-淀粉酶動力學研究是根據1.3.1節反應條件與各種質量濃度（0、1、3、5 mg/mL）的抑制劑進行，并且底物的質量濃度范圍規定在5～15 mg/mL。同時，以1/V對不同質量濃度底物的抑制劑質量濃度作圖獲得α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制劑常數[16]。

1.3.4 紫外吸收光譜測定

根據劉碩等[17]的方法稍作修改。C3G溶液與α-淀粉酶溶液/α-葡萄糖苷酶溶液的質量濃度比為0∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，振蕩搖勻。在室溫下反應15 min后，在200～400 nm波長范圍測定混合液的紫外吸收光譜。

1.3.5 熒光光譜學測定

配制成酶-抑制劑混合體系：300 μLα-葡萄糖苷酶溶液和100 μL不同質量濃度的C3G溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）。測定混合體系熒光強度，發射波長為300～450 nm，狹縫寬度為10 nm。α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶熒光光譜測定方法類似，其中C3G溶液質量濃度分別為0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。對照組：磷酸鹽緩沖液代替C3G。結合常數（Ka）、熒光猝滅常數（Kq）和結合位點數（n）按式（2）和（3）計算：

式中：F0和F分別為α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶在沒有抑制劑和有抑制劑的情況下的熒光強度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數；τ0為不存在猝滅劑時熒光團的平均壽命（其值約為10-8s）；[Q]為C3G的質量濃度/（mg/mL）；[P0]為α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 分子對接實驗

采用AutoDock 4.2分子模擬軟件進行分子對接，預測C3G與兩種酶的結合模式和作用力。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的PDB編號分別為3WY2、1DHK。酶蛋白結構從UniProt（https://www.uniprot.org/）獲取，C3G小分子結構從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取。結合能被用來評估酶蛋白與小分子的結合親和力。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 BRA對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用

膳食淀粉可以被α-淀粉酶消化成還原糖，接著再被α-葡萄糖苷酶消化為葡萄糖，從而導致2型糖尿病患者的餐后血糖水平升高[18-19]。因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性對于延緩碳水化合物降解和葡萄糖吸收至關重要。本研究發現BRA對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，且對α-葡萄糖苷酶的抑制呈現劑量依賴性。由圖1A可知，當BRA質量濃度達到0.1 mg/mL時，其抑制率達到了81.22%。BRA對α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的抑制效果可以通過半數抑制濃度（IC50）表示，即BRA引起的α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶活力降低50%的結果。通過線性擬合計算得出，阿卡波糖（IC50=0.214 μg/mL）對α-葡萄糖苷酶的抑制效果高于BRA（IC50=13 μg/mL）。此外，圖1C、D顯示，BRA對α-淀粉酶的抑制作用與質量濃度呈正相關，且抑制效果低于阿卡波糖。同時，發現BRA對α-淀粉酶的IC50（1.141 mg/mL）遠大于α-葡萄糖苷酶，其原因可能是α-淀粉酶與BRA中活性物質的親和能力比α-葡萄糖苷酶更弱。總而言之，BRA對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較好的抑制作用，可能作為潛在的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑。

圖1 BRA和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶（A、B）和α-淀粉酶（C、D）的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BRA and acarbose against α-glucosidase(A and B) and α-amylase (C and D)

2.2 BRA的高效液相色譜分析

對BRA進行超濾-高效液相色譜分析，以鑒定出BRA中與酶蛋白結合的主要活性成分。如圖2A所示，超濾篩選前BRA提取物高效液相色譜圖中第3個樣品峰的出峰時間為13.250 min，與圖2B中C3G標準品的出峰時間一致，表明C3G是BRA的主要組分。此外，由圖2C可知，BRA中C3G與α-淀粉酶發生特異性結合后，活性酶組所捕獲的配體所對應的波峰的強度與面積均大于失活酶組。因此，可以通過比較波峰面積反映C3G與α-淀粉酶的結合率。高效液相色譜圖數據顯示Aa=3421.62549、Ab=353.69589、Ac=48.32920，通過式（1）計算得C3G與α-淀粉酶的結合率為8.9%。由此可知，BRA中的C3G是對α-淀粉酶發揮抑制作用的主要活性成分。

圖2 BRA的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of BRA

2.3 α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制動力學分析

對酶抑制劑的C3G單體進行動力學研究，以揭示C3G對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機制。通過Lineweaver-Burk和Dixon圖確定C3G對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制模式[20-21]。如圖3A、C所示，所有直線都經過原點，并且所有直線的斜率隨著C3G質量濃度增加而減小，這表明C3G作為兩種酶蛋白的可逆抑制劑發揮作用。圖3B、D顯示，不同反應體系的抑制曲線交點無限收斂于x正半軸。此外，Vmax持續下降，而Km值幾乎沒有變化，這表明C3G作為兩種酶蛋白的非競爭性可逆抑制劑起到了抑制作用（表1、2）。對于非競爭性可逆抑制，以Lineweaver-Burk方程中1/Vmax對相應的抑制劑濃度I進行二次繪圖得到直線的橫軸截距，可求出抑制常數Kiu[22-23]。1/Kiu值被用來衡量抑制劑與酶的親和力程度[24]。Dixon圖結果表明，α-葡萄糖苷酶與C3G（Kiu=0.05）間的相互作用比α-淀粉酶與C3G（Kiu=3.723）間的相互作用更強，這與酶活性抑制的結果保持一致（圖3）。因此，C3G以可逆非競爭性的方式抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，且與兩種酶蛋白的親和程度有差異。

表1 C3G抑制α-淀粉酶的Vmax和Km值Table 1 Vmax and Km values of C3G against α-amylase

表2 C3G抑制α-葡萄糖苷酶的Vmax和Km值Table 2 Vmax and Km values of C3G against α-glucosidase

圖3 C3G對α-葡萄糖苷酶（A）與α-淀粉酶（C）的可逆抑制作用以及對α-葡萄糖苷酶（B）與α-淀粉酶（D）的雙倒數曲線圖Fig.3 Reversible inhibition of α-glucosidase (A) and α-amylase (C) by C3G and double-reciprocal curves for α-glucosidase (B) and α-amylase (D)

2.4 α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的紫外吸收光譜分析

如圖4所示，復合物體系在295 nm處有吸收峰且發生紅移現象（295～305 nm）。此外，固定α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶濃度，吸光度隨著C3G溶液質量濃度的增大而增大。因此，這表明C3G與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，使α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的肽鍵C＝O基團的π-π*發生躍遷，導致酶的能量與活性降低。

圖4 C3G質量濃度對α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）紫外吸收光譜的影響Fig.4 Effect of different concentrations of C3G on the UV absorption spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

2.5 C3G對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅效應

熒光光譜通過測量熒光強度和最大發射波長的變化監測α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶中色氨酸殘基的微環境變化[25-26]。如圖5A所示，隨著C3G質量濃度增大，α-淀粉酶中色氨酸殘基的熒光強度顯著降低，熒光光譜發生明顯猝滅現象。在添加不同質量濃度C3G（0～6 mg/mL）的過程中，最大發射波長出現明顯的藍移現象（375～350 nm），這意味著C3G與α-淀粉酶的結合引起了色氨酸殘基周圍的疏水性變化。同樣地，C3G質量濃度增大導致α-葡萄糖苷酶熒光強度呈規律性降低。此外，明顯的紅移（339～390 nm）現象表明，C3G會引起α-葡萄糖苷酶疏水鍵的斷裂，導致色氨酸等非極性氨基酸殘基暴露于極性環境中。

圖5 C3G質量濃度對α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）熒光猝滅強度的影響Fig.5 Effects of different concentrations of C3G on the fluorescence quenching spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

因此，C3G是α-淀粉酶/α-葡糖苷酶熒光的猝滅劑，并改變了α-淀粉酶/α-葡糖苷酶的特定結構變化，這與高效液相色譜得出的結果保持一致。利用熒光色譜數據進一步分析得出α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅速率常數Kq=1.3×1012L/（mol·s），α-淀粉酶的熒光猝滅速率常數Kq=3.8×1011L/（mol·s）。此外，兩種糖苷酶的熒光猝滅速率常數Kq大于2×1010L/（mol·s），進一步得出C3G熒光猝滅α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的過程不是由分子擴散和動態碰撞引起的動態猝滅，而是形成復合物的靜態猝滅過程?？偠灾?，C3G在疏水作用力驅動下可與兩種酶結合生成復合物，從而引發酶的結構發生變化，導致酶的活性降低。

2.6 分子對接分析

分子對接被應用于通過非共價鍵形成雙分子復合物的分析，主要包括疏水力和氫鍵[27]。通過該分析方法，獲得化合物與蛋白質相互作用的結合親和力和氨基酸殘基。經線性擬合計算后，發現C3G與α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶可能存在1 個最佳結合位點（表3）。結合能Eb表示測試化合物對酶蛋白的結合親和力[28]。由表3可知，C3G與α-淀粉酶的電離能Eb為-7.8 kcal/mol，而與α-葡萄糖苷酶為-9.8 kcal/mol。此外，C3G與α-葡萄糖苷酶之間的結合親和力比α-淀粉酶高，這與熒光猝滅常數Kq和抑制常數Kiu結果一致。此外，Eb值均為負值，表明C3G-淀粉酶結合的相互作用是一個放熱過程。

表3 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的熒光參數Table 3 Fluorescence parameters of α-glucosidase and α-amylase

分子對接結果預測C3G與位于α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶非催化位點的氨基酸殘基相互作用，可能擾亂蛋白質結構，并以非競爭方式抑制酶活性，進而改變酶活力。如圖6E所示，C3G與α-淀粉酶結合位點附近對結合作用貢獻較大的氨基酸殘基為ASP316、LEU181、ALA214、TRP77和GLN81。與此同時，C3G和α-葡萄糖苷酶之間形成了4 個氫鍵（THR445、ARG429、ASP441、ASN46）相互作用。圖6F顯示，當與α-葡萄糖苷酶結合時，C3G主要被氨基酸殘基HIS348、THR445、ARG429、HIS515、ASN46、GLU432、GLN438和ASP441包圍。此外，這些氨基酸殘基增加了抑制劑-酶復合物的穩定性?？偠灾?，C3G可能是α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的潛在配體，通過非共價力與關鍵氨基酸殘基相互作用，發揮其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

圖6 C3G與α-淀粉酶（A、C、E）和α-葡萄糖苷酶（B、D、F）的分子對接結果Fig.6 Molecular docking results of C3G with α-amylase (A,C and E) and α-glucosidase (B,D and F)

3 結論

本研究揭示BRA中的C3G對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制機制。結果表明，C3G與兩種酶的結合過程是自發的，生成酶-抑制劑復合物，導致α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的內在熒光猝滅。此外，該抑制作用屬于非競爭性可逆抑制。C3G與ASP441、TRP等殘基以氫鍵結合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持復合物的穩定結構。本研究對于開發新型的食源性α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶抑制劑，推動C3G在功能性食品領域的應用具有一定的參考價值。