美拉德反應對四角蛤蜊原肌球蛋白免疫結合活性的影響

亢 帥，何欣蓉，李東曉，紀乃茹，于晨晨，陳桂霞，曹敏杰,3，劉光明,3,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021；2.廈門大學附屬婦女兒童醫院，福建 廈門 361003；3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

食物過敏是世界范圍內重要的公共安全問題，其患病率呈現逐年上漲趨勢[1]。據估計，食物過敏會對6%～8%的兒童和2%～5%的成年人產生影響[2]。食物過敏主要是免疫球蛋白E介導的速發型過敏反應，能夠誘發機體產生IgE并與之結合，使抗體進一步誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介質從而引起速發型過敏反應[3]。不同過敏食物引起的發病率存在地域差異性，西方國家易對花生堅果類產生過敏反應，相比之下，在中國等東方國家中，水產食品是主要引發過敏反應的食物之一[4-5]。其中原肌球蛋白（tropomyosin，TM）被認為是軟體類及甲殼類動物中主要過敏蛋白[6]。

蛤蜊，是我國四大養殖貝類之一，約占全國貝類總產量的30%，因其營養豐富、味美肉鮮、價格低廉而深受消費者喜愛[7-8]。隨著其產量和消費量的增加，因食用蛤蜊而引起的過敏事件時有發生[9-10]。作為一種常見的食物成分，除直接食用外，蛤蜊也被用于許多食物或調味品中，不經意間的攝入也可能會發生超敏反應危及人們生命，但目前為止蛤蜊中的過敏原尚未得到廣泛研究，其致敏性消減方面的探索更是有所欠缺[11-13]。因此，開發對過敏消費者安全的低致敏性蛤蜊類食品已成為一個有待解決的問題。

美拉德反應是廣泛應用于食品工業的一種加工方式，也是降低水產食品致敏性的有效手段。通過還原糖羰基與蛋白質氨基之間發生反應，修飾氨基酸殘基，進而改變過敏原的抗原表位，最終達到降低致敏性的目的。美拉德反應可以分為濕法和干法[14]。濕法美拉德反應溫度一般不低于100 ℃，反應速率較快，但反應程度不易控制[15]。干法美拉德反應，反應溫度較低，反應速度較慢，但更加容易控制[16]，且反應產物具有更好的熱性能以及更長的保質期[17-18]。因此，干法美拉德反應不僅能消減過敏原的致敏性，還能最大程度保持產品的營養狀態，在食品工業中具有很大的發展潛力。蛋白質在加工過程中結構會因外力作用受到改變，使過敏原的抗原表位受到影響，從而調節免疫結合活性，但很少有研究集中與加工后純化的蛋白質的結構上[19]。現階段研究過程中多為對單一蛋白質進行美拉德反應，有研究發現，粗提物在熱處理過程中其中致敏原的作用效果會發生改變[20]，在美拉德反應的熱處理過程中粗提物的過敏原是否受到影響目前尚未可知。美拉德反應也會誘導蛋白質構象的變化，導以食物過敏原結構變的更加松散和靈活，以及與其他蛋白質、脂質和碳水化合物的相互作用，影響過敏原的消化率[21-22]。Zhang Ziye等[23]發現TM與葡萄糖的干法美拉德反應會使TM的α-螺旋減少，其他二級結構則增加，同時減弱了TM的致敏性和消化率。經過美拉德反應的過敏原進入人體后，需要經過胃腸消化才能被人體所吸收。在消化過程中，過敏原本身的結構會被胃腸中的消化酶破壞，可能會改變消化產物的致敏性。因此在加工過程中，過敏原的消化穩定性也是探究其致敏性的重要指標。

目前，美拉德反應消減過敏原致敏性的研究多為甲殼類水產食品，對軟體類水產食品的研究比較欠缺，而且大多研究集中于單一蛋白。然而在實際加工過程中，是對完整組織或粗提物進行加工，單一蛋白的研究處理，并不完全符合實際加工過程。所以本研究運用干法美拉德反應的工藝手段，以四角蛤蜊粗提物為原料，探究干法美拉德反應對四角蛤蜊過敏原的消化特性、免疫結合活性及結構特性的影響。旨在為開發低致敏性蛤蜊產品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活四角蛤蜊購自福建廈門樸樸電子商務有限公司，去殼去內臟取其肌肉組織用于粗蛋白的提取。兔抗華貴櫛孔扇貝TM多克隆抗體由本實驗室制備；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、標記的羊抗兔IgG抗體美國Pierce公司；HRP標記的羊抗人IgE抗體 英國Abcam公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶美國Sigma公司；木糖、阿拉伯糖 上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；Bio-Profile凝膠成像及分析系統 法國Viber Lourmant公司；600化學發光成像系統 美國Azure Biosystems公司；NDO-700定溫恒溫干燥箱 上海愛朗儀器有限公司；Nano-ZS Malvern激光散射粒度儀 美國Malvern公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysics公司；Infinite?M200 PRO酶標儀 奧地利Tecan公司；NP80超微量分光光度計 德國Touch Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 四角蛤蜊過敏患者血清

血清來自于自廈門大學附屬婦女兒童醫院（倫理委員會批準編號KY-2019-018）經過ImmunoCAP、通過酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析確定能與四角蛤蜊粗提液有陽性反應的血清，并以健康人血清作為對照。四角蛤蜊過敏患者信息見表1。

表1 四角蛤蜊過敏患者信息Table 1 Information of patients allergic to M.veneriformis

1.3.2 四角蛤蜊粗提液的制備

取四角蛤蜊肌肉組織加入含有0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液（1∶10（g/mL）），搗碎后4 ℃、12000×g離心20 min，取上清液即為四角蛤蜊粗提液。

1.3.3 制備美拉德反應產物

美拉德反應產物的制備參考Zhang Ziye等[24]，并進行一定修改。將四角蛤蜊粗提液分別與木糖（1∶1，m/m）、阿拉伯糖（1∶1，m/m）混合凍干，將凍干的樣品在55 ℃恒溫干燥箱中進行美拉德反應，含有木糖的粗提物樣品反應3 h，含有阿拉伯糖的粗提物樣品反應4 h，粉碎后即為四角蛤蜊的美拉德反應產物。Mactra為未進行美拉德反應的四角蛤蜊粗提物，木糖對四角蛤蜊粗提物的美拉德反應產物為Mactra-Xyl，阿拉伯糖對四角蛤蜊粗提物的美拉德反應產物為Mactra-Arab。

1.3.4 美拉德反應產物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot、Dot blot分析

參考Mei Xuejiao等[25]的方法對樣品的蛋白成分進行SDS-PAGE分析。電泳后，用FastBlue蛋白染色液（RTD6202-02）進行染色，利用Western blot及Dot blot的方法對過敏原的免疫結合活性進行分析。IgG的檢測以兔抗扇貝TM多克隆抗體（稀釋至1∶20000）作為一抗孵育NC膜，以HRP標記的羊抗兔IgG抗體（稀釋1∶20000）作為二抗進行孵育。IgE的檢測以過敏患者血清（稀釋1∶3）作為一抗孵育NC膜，HRP標記的羊抗人IgE抗體（稀釋1∶10000）為二抗進行孵育。最后使用化學發光成像系統拍攝圖像。

1.3.5 美拉德反應產物的體外消化實驗

體外消化實驗參考Liu Meng等[26]進行模擬胃腸道連續消化。首先進行模擬胃液消化：將蛋白樣品與模擬胃液于37 ℃水浴鍋中混合，加入預熱后的胃蛋白酶（酶與底物1∶50，m/m）進行消化，分別在0、2、5、10、15、30、60 min后依次取出樣品，加入一定量的NaHCO3將pH值調至中性，以終止消化。

模擬腸液消化：將經過上述胃液消化60 min后的樣品加入一定量的NaHCO3將pH值升高至7.4，以終止消化。之后加入0.5 mol/L的KCl溶液與預熱后的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合（酶與底物1∶200，m/m）于37 ℃水浴鍋中進行消化，在0、5、15、30、60、120、180、240 min后依次取出樣品在95 ℃水浴中加熱5 min終止反應。將消化后的樣品貯存在4 ℃環境中。

1.3.6 消化產物的粒徑分析

使用Malvern激光散射粒度儀對美拉德反應后的消化產物進行粒徑分析，觀察消化產物的粒徑變化。具體參數設置為：Material（Protein）；Dispersan（Water）；Temperature（25 ℃）。每個樣品測定3 次，采用Malvern Mastersizer軟件進行數據結果分析。

1.3.7 美拉德反應產物中TM的分離純化

參考Ji Nairu等[27]方法。將未處理的粗提物與美拉德反應產物按照1.3.2節所述分別用10 倍體積的磷酸鹽緩沖液復溶，浸提1 h，4 ℃、12000×g離心20 min取上清液，用40% (NH4)2SO4鹽析，攪拌0.5 h，靜置2 h，離心取上清液。將上清液調pH 4.55得到的沉淀用Tris-HCl溶解，經Q-Sepharose強陰離子交換層析，用含有0～0.2 mol/L NaCl的Tris-HCl線性洗脫后用含0.2 mol/L NaCl的Tris-HCl進行流洗，最后用0.2～0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl再次線性洗脫，收集組分得到純化的TM。從木糖的美拉德反應產物中純化的TM記為TM-Xyl、阿拉伯糖記為TM-Arab。

1.3.8 美拉德反應產物中TM圓二色譜、表面疏水性和紫外吸收光譜的分析

將上述從美拉德反應產物中純化的TM及未處理TM稀釋至0.2 mg/mL，利用圓二色譜儀進行二級結構的分析，利用CDNN軟件分析二級結構含量變化情況；將美拉德反應TM及未處理TM稀釋至0.05 mg/mL，并用5 mmol/L的ANS溶液進行熒光標記，使用酶標儀測定其熒光強度；取2 μL 1 mg/mL的樣品，采用超微量紫外分光光度計在200～300 nm掃描波長范圍對將美拉德反應TM及未處理TM進行紫外吸收光譜分析，觀察三級結構的變化。每個樣品需進行3 次測定。

1.3.9 美拉德反應產物中TM的免疫結合活性分析

按照1.3.4節方法對美拉德反應產物中TM進行SDSPAGE和Western blot及Dot blot分析。

1.4 統計分析

運用SPSS 20.0軟件進行顯著差異性分析結果以3 次表示（P＜0.01，差異極顯著；P＜0.05，差異顯著）。使用Image J軟件對蛋白印跡進行灰度值分析。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應產物的IgE-/IgG-結合活性分析

對四角蛤蜊美拉德反應產物進行SDS-PAGE分析，如圖1A所示，與未處理的粗提物樣品相比，經過美拉德反應后其蛋白條帶出現上移和彌散，說明在一定溫度下，木糖和阿拉伯糖與蛋白質形成了糖-蛋白復合物。分別用四角蛤蜊過敏患者血清池及扇貝TM多克隆抗體進行Western blot分析，由圖1B可知，未處理的粗提物樣品中36 kDa處有明顯的蛋白印跡，通過美拉德反應處理后免疫印跡強度明顯減弱，圖1C的印跡效果與圖1B相似，經過美拉德反應后TM的免疫結合活性明顯降低。由此說明，36 kDa蛋白條帶為TM，是已知蛤蜊中的主要過敏原[28]。通過木糖和阿拉伯糖的美拉德反應處理后，其免疫結合活性大幅度喪失。這與Han Yinyu等[29]發現阿拉伯糖引起的美拉德反應能顯著降低青蟹TM免疫結合活性，Bai Tianliang等[30]確定木糖與扇貝TM的美拉德反應使其免疫結合活性減低相符合。因此可確定木糖和阿拉伯糖的干法美拉德反應可以修飾四角蛤蜊TM，降低TM的免疫結合活性。

圖1 四角蛤蜊美拉德反應產物的IgE-/IgG-結合活性Fig.1 IgE-/IgG-binding activity of the MRPs from M.veneriformis

2.2 美拉德反應產物的模擬胃腸液連續消化穩定性分析

評估四角蛤蜊美拉德反應產物在胃腸道連續消化模式下，目的蛋白的穩定性及免疫結合活性。如圖2A、B所示，在模擬胃液消化過程中，TM條帶始終具有良好的穩定性，其免疫印跡強度也并未減弱。經過木糖和阿拉伯糖的美拉德反應處理后，生成的美拉德反應產物消化模式基本相似。如圖2C～F所示，在模擬胃液消化過程中經過美拉德反應的TM條帶有彌散現象，但在胃液消化過程中并無明顯降解，且免疫印跡也無明顯改變。在隨后進行的模擬腸液連續消化中，如圖3A、B所示，TM條帶在消化30 min后基本全部降解，免疫印跡也基本消失。而經過木糖（圖3C、D）和阿拉伯糖（圖3E、F）的美拉德反應處理后，美拉德反應TM條帶在腸液連續消化15 min后基本降解，免疫印跡強度也逐漸減弱在15 min后基本消失。

圖2 四角蛤蜊美拉德反應產物的模擬胃液消化Fig.2 Electropherograms of simulated gastric fluid digestion products of the MRPs from M.veneriformis

圖3 四角蛤蜊美拉德反應產物的模擬腸液消化Fig.3 Electropherograms of simulated intestinal fluid digestion products of the MRPs from M.veneriformis

結果表明，在四角蛤蜊粗提物中，TM耐胃液消化，不耐腸液消化，美拉德反應能夠加快TM的模擬胃腸液連續消化速率，使其免疫結合活性更快的喪失。這與秀麗白蝦TM與麥芽七糖混合凍干后在60 ℃環境下反應48 h更易被胃蛋白酶水解表現出相同的趨勢[31]，但在同樣條件下秀麗白蝦TM與葡萄糖的美拉德反應卻降低了消化率[23]。這可能是由于在美拉德反應過程中由于還原糖種類及分子質量的不同，導致過敏原構象的改變及表位的修飾程度不同，從而表現出對消化酶不同的敏感度。除了過敏原對酶水解的內在敏感度外，加工產物中的其他組織成分也可以改變蛋白的消化穩定性[32]，因此，對于單一蛋白和粗蛋白，在加工過程中可能會表現出不同的消化模式，粗蛋白的研究更適用食品加工過程。

通過本實驗可知，干法美拉德反應在一定程度上可以促進加工產物在人體的消化速率，這可能是由于蛋白質水解酶對肽鍵的不同識別和干法美拉德反應處理過程中的一些外在條件破壞了一些結合肽及過敏原表位，改變了蛋白質的空間結構，增加了蛋白酶的酶解位點，使得加工產物在模擬胃腸液連續消化過程中速率加快。

2.3 消化后美拉德反應產物的粒徑分析

通過體外模擬胃腸道連續消化模型評估美拉德反應產物中肌肉蛋白的消化特性。將未進行美拉德反應處理及經過美拉德反應處理的樣品經過60 min的模擬胃液消化及240 min的模擬腸液消化后，對消化后的樣品進行粒徑分析。每組對照為消化之前的樣品。如圖4A所示，與對照組相比，胃液消化產物和連續胃腸液消化產物的粒徑顯著減小，粒徑強度左移現象明顯，說明四角蛤蜊粗提物樣品在消化過程中發生酶解反應，蛋白質被分解為粒徑更小的多肽和氨基酸。與未進行美拉德反應的樣品相比，經過美拉德反應的樣品消化產物粒子粒徑強度左移程度更大（圖4B、C）。木糖與阿拉伯糖相比，木糖的美拉德反應產物消化粒徑集中在100～1000 nm范圍內，而阿拉伯糖的美拉德反應產物消化粒徑主要集中在50～1000 nm范圍內，總體粒徑比木糖的美拉德反應產物更小。這與上述模擬胃腸液連續消化相對應，在上述消化過程中除TM外其他高分子蛋條帶在經過美拉德反應后也更易被酶解，這也是導致消化后平均粒徑更小的原因。結果對比如圖4D所示，美拉德反應會降低四角蛤蜊消化產物的粒徑，從而增加消化速率。Liu Meng等[33]研究表明，115 ℃高溫處理南美白對蝦會使其肌肉蛋白結構更加松散，減小了消化產物的粒徑。對于木糖、阿拉伯糖的干法美拉德反應，雖然反應溫度較低，但在還原糖的作用下，蛤蜊肌肉蛋白的結構及分子序列受到修飾和破壞，使大分子蛋白質結構更加松散，暴露出更多酶解位點，在消化過程中降解為更多的小分子多肽，從而降低了消化產物的平均粒徑。

圖4 消化產物的粒徑分析Fig.4 Particle diameter analysis of digestion products

2.4 美拉德反應產物中TM的分離純化

為進一步探究TM在美拉德反應產物中免疫結合活性及結構特性的變化情況，將未處理的四角蛤蜊粗提物及其美拉德反應產物進一步進行分離純化。首先經過硫酸銨鹽析和等電點沉淀除去大部分雜蛋白，之后經過Q-Sepharose層析柱進一步分離純化。由圖5A可知，經過Q-Sepharose層析柱的分離純化，目的蛋白在0.2～0.5 mol/L NaCl的線性范圍內得以洗脫，如圖5B泳道15所示，36 kDa條帶為所純化TM。圖5C為木糖的四角蛤蜊美拉德反應產物經Q-Sepharose層析柱的分離純化，目的蛋白同樣在0.2～0.5 mol/L NaCl的洗脫范圍內，圖5D泳道19為純化TM-Xyl。對于阿拉伯糖的四角蛤蜊美拉德反應產物，目的蛋白具有相同的Q-Sepharose層析柱的洗脫范圍（圖5E），泳道18、19為純化TM-Arab（圖5F）。由此可見，四角蛤蜊TM與華貴櫛孔扇貝TM具有相同的洗脫范圍[30]，經過粗提物的美拉德反應后，TM的洗脫范圍并無明顯改變，說明木糖、阿拉伯糖的干法美拉德反應并無完全改變TM的理化性質。

圖5 美拉德反應產物中TM的分離純化Fig.5 Separation and purification of TM in MRPs

2.5 美拉德反應產物中純化TM的結構特性分析

美拉德反應會引起過敏原結構的變化，這一變化主要體現二級結構、三級結構及疏水作用力[34]。過敏原結構的變化也是造成致敏性變化的關鍵[35]。為進一步探究經過美拉德反應后TM結構特性的變化情況，首先利用圓二色譜儀分析純化TM、TM-Xyl、TM-Arab的二級結構，如圖6A、B所示，四角蛤蜊TM為典型的α-螺旋結構蛋白，經過木糖和阿拉伯糖的美拉德反應后，α-螺旋相對含量顯著降低，同時β-折疊、β-轉角、無規卷曲相對含量都有不同程度的增加。通過表面疏水性（圖6C）可看出，經過美拉德反應后TM-Xyl、TM-Arab的熒光強度均高于TM，其強弱順序為TM-Xyl＞TM-Arab＞TM，且熒光強度峰有藍移現象，這表明經美拉德反應處理后TM的三級結構發生變化。蛋白質中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香氨基酸殘基及二硫鍵處不對稱環境時，在近紫外200～300 nm處會表現出CD信號，反映出蛋白質三級結構的展開和折疊情況。如圖6D所示，經過美拉德反應處理后，TM-Xyl的吸收峰有增強而TM-Arab有下降趨勢，這表明，美拉德反應使TM的空間結構發生了變化，但木糖和阿拉伯糖導致TM展開或折疊的方式有所不同。結構的改變會影響過敏原的致敏性，Fu Linglin等[36]采用核糖、低聚糖等還原糖通過干法美拉德反應消減中國對蝦TM致敏性，經研究發現致敏性降低可能是由于蛋白質構象變化引起。木糖、阿拉伯糖的干法美拉德反應使四角蛤蜊粗提物中TM的分子結構發生改變，出現了解螺旋現象和空間位阻的增加，進而使蛋白質表面暴露出更多的疏水基團，這可能會掩蓋或破壞過敏原的抗原表位，降低其致敏性。

圖6 美拉德反應產物中TM的結構特性分析Fig.6 Analysis of the structural properties of TM in MRPs 2.6 美拉德反應產物中純化TM的IgG-/IgE-結合活性分析

將上述純化得到的TM、TM-Xyl、TM-Arab進行凝膠電泳分析，結果如圖7A所示，與未進行美拉德反應的TM相比，美拉德反應后的TM條帶有彌散和上移現象，并且有聚體和一些聚集物的產生。說明TM經過木糖和阿拉伯糖的美拉德反應后分子質量有所增加，并且有熱聚集現象。為進一步判斷美拉德反應后TM免疫結合活性的變化情況。將TM、TM-Xyl、TM-Arab分別與扇貝TM多克隆抗體及四角蛤蜊過敏患者的血清進行免疫印跡分析。從圖7B可以看出，經過美拉德反應后TM的免疫印跡強度顯著降低，其IgG結合活性明顯下降。從圖7C的7 名過敏患者血清的Dot blot圖可知，經過美拉德反應后TM的免疫印跡明顯減弱，IgE結合活性明顯降低。通過進一步對圖7C進行灰度分析，結果如圖7D所示，經過美拉德反應處理后TM的IgE結合活性得到大幅度降低，通過對比發現TM-Xyl的IgE結合活性平均下降了約55%，TM-Arab下降了約60%。這與Zhang Ziye等[37]確定凡納濱對蝦TM與葡萄糖的干法美拉德反應能顯著降低其IgE結合活性的結果相似，說明木糖、阿拉伯糖的干法美拉德反應改變了蛤蜊粗提物中TM的結構，修飾或破壞了TM的抗原表位，使得TM的IgG-/IgE結合活性降低。因此可知，由木糖和阿拉伯糖引起的干法美拉德反應會降低四角蛤蜊TM的免疫結合活性，這與上述粗提物的結果相對應。

圖7 美拉德反應產物中TM的IgG-/IgE-結合活性分析Fig.7 Analysis of IgG-/IgE-binding activity of TM in MRPs

3 結論

以四角蛤蜊粗提液為原料，探究木糖、阿拉伯糖的干法美拉德反應對四角蛤蜊TM免疫結合活性的影響。利用四角蛤蜊粗提液制備美拉德反應產物，而并非對單一蛋白進行美拉德反應處理，更加符合實際加工過程。美拉德反應加工方式促進了蛤蜊粗提物在胃腸道中的消化速率，使蛋白質降解速率加快，消化產物粒徑更小，這使得產物更加利于人體的消化吸收。此外，通過對美拉德反應產物中的TM分離純化，確定了由木糖、阿拉伯糖修飾的干法美拉德反應，會使四角蛤蜊TM的α-螺旋相對含量顯著降低，逐漸轉變為β-折疊、β-轉角、無規卷曲狀態，同時增加表面疏水性，改變空間結構，從而導致四角蛤蜊TM的致敏性降低。