凍結方式對中華鱘脂質氧化和肌纖維微觀結構的影響

廖錦晗，陳季旺,2,*，譚 玲，廖 鄂,2，焦楚壹

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.農產品加工與轉化湖北省重點實驗室（武漢輕工大學），湖北 武漢 430023；3.湖北和遠氣體股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

中華鱘（Acipenser sinensis）為我國特有鱘魚品種[1]，魚肉蛋白質含量高、脂肪含量低，必需氨基酸種類齊全、比例適宜，富含不飽和脂肪酸，且肉質細嫩、風味獨特、可食用比例高，受到消費者的推崇[2-3]。由于國內人工養殖中華鱘起步較晚，加工產品種類少，仍多以活魚、冰鮮魚肉銷售為主。近年來，隨著人工繁育和養殖技術的發展，中華鱘養殖產量逐年增加，2021年全國淡水養殖鱘魚產量已達121 875 t，與上年相比增幅達到16.87%[4]。因此，亟需提高中華鱘精深加工的水平和規模，保證中華鱘產業健康、可持續發展[5]。

目前，市場上中華鱘生鮮產品主要有凍藏保鮮、冰袋保鮮和整條活魚等運輸方式，運輸成本昂貴，保鮮保活期短；而且生鮮中華鱘的肌肉組織軟嫩、內源蛋白酶活性高，魚肉易腐敗變質[6-7]。冷凍貯藏在水產類產品中應用廣泛、經濟有效。將水產品降溫后保持凍結狀態貯藏，可以抑制水產品腐敗變質，延長貯藏時間，擴大供應范圍，調節市場供需關系[8-9]。但是在凍藏過程中，水產品中的不飽和脂肪酸容易氧化，影響產品色澤，使水產品特有風味變淡，產生不良風味等，也會使水產品營養價值降低，導致水產品商業價值下降，減弱了消費者的購買意愿[10-11]。Shi Yali等[12]研究－4 ℃下凍藏49 d羅非魚的脂質和蛋白質氧化，結果顯示，隨著凍藏時間的延長，硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值和共軛烯烴等脂質氧化產物增加，羅非魚肉亮度降低，冷凍羅非魚品質發生劣變。Romotowska等[13]通過測定鯖魚在－18 ℃和－25 ℃凍藏期間的TBARS值、脂肪和游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）含量和脂肪酸組成發現，隨著凍藏時間的延長，冷凍鯖魚的脂質明顯降解，較低的凍藏溫度能夠延緩鯖魚中的脂質氧化。

液氮無色無味，常壓下快速汽化，安全穩定，不會對食品造成污染。液氮冷凍能夠以很短的時間通過最大冰晶生成帶，在食品中快速形成大量分布均勻的細小晶體，對食品組織結構的破壞程度低，解凍后能很好地保持原有品質，使凍結產品具有高的商品價值[14-15]。前期預實驗表明，凍結方式（冰柜冷凍、液氮冷凍）明顯影響了中華鱘凍藏過程中品質和蛋白質的理化性質。本研究采用冰柜（－20、－50 ℃）和液氮（－80、－110 ℃）凍結中華鱘，然后置于－18 ℃冰柜中凍藏24 周，測定凍藏中華鱘魚塊中心溫度、脂肪和FFAs含量、過氧化值（peroxide value，POV）、TBARS值、熒光化合物、脂肪酸組成，觀察魚肉肌纖維微觀結構，分析凍藏過程中脂質氧化規律，探討凍結方式對中華鱘脂質氧化和肌纖維微觀結構變化的影響，旨在為中華鱘的保鮮保質加工提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱘，養殖約1 年，（1.50±0.25）kg/尾，由恩施州國硒冷水漁業開發有限公司提供。

石油醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、甲苯、啶乙酸銅、正丁醇（均為分析純）和正己烷（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液、三氟化硼-甲醇（1∶3，V/V） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LN2液氮速凍機 科威嘉尼（北京）科技有限公司；DW-60W388超低溫冰柜 青島海爾生物醫療有限公司；S 2 F-0 6 C 脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司；SSN-61熱電偶溫度計 深圳源恒通科技有限公司；7890B GC-MS氣相色譜-質譜儀 美國安捷倫公司；SU8010高分辨場發射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 中華鱘樣品的處理

鮮活中華鱘在養殖基地直接宰殺，用清水沖洗干凈后去頭、內臟和魚鱗，剔除上表皮，清洗表面黏液及血漬后，置于裝有冰袋的泡沫箱內迅速運至實驗室。

將原料切割成6.5 cm×3.5 cm×1.5 cm大小一致的魚塊，約200 g為一份裝入生鮮塑料盒中，隨機分為4 組，每組10 盒，共40 盒，并進行標記。將4 組魚塊分別于液氮（－110、－80 ℃）和冰柜（－50、－20 ℃）中進行凍結，液氮冷凍溫度由液氮速凍柜控制液氮噴淋量調節。將熱電偶測溫計插入鱘魚塊中心測定溫度，待中心溫度達到－18 ℃時立即將魚塊轉入－18 ℃冰柜凍藏。凍藏周期為24 周，每6 周取樣，流水解凍后用于測定脂質氧化指標和觀察肌纖維微觀結構。

1.3.2 中心溫度的測定

將熱電偶測溫計插入鱘魚塊中心，放入液氮速凍機中進行凍結，記錄時間和中心溫度。凍結結束后，以時間為橫坐標、中心溫度為縱坐標，繪制液氮（－110、－80 ℃）和冰柜（－50、－20 ℃）凍結中華鱘魚塊的凍結曲線。

1.3.3 脂肪質量分數的測定

參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[16]中的索氏抽提法。取中華鱘魚肉于料理機內攪碎，稱?。?.0±0.2）g攪碎后的中華鱘魚肉，移入兩端塞入脫脂棉的濾紙筒中。將濾紙筒用脫脂棉線固定后置于抽提筒中，然后將抽提筒置于已烘干至恒質量的接收瓶內。接收瓶內加入約瓶容積2/3的石油醚，60 ℃水浴加熱抽提3.5 h。提取結束后，于60 ℃水浴加熱0.5 h，蒸發接收瓶內多余的石油醚。蒸發完全后置于105 ℃烘箱中干燥1 h，置于干燥器內冷卻至室溫后稱質量。脂肪質量分數按式（1）計算。

式中：m1為恒質量接收瓶和脂肪質量/g；m0為接收瓶質量/g；m2為中華鱘魚肉質量/g。

1.3.4 FFAs相對含量的測定

參考楊海琦等[17]的方法，略作修改。稱取0.05～0.10 g于1.3.3節中已提取的中華鱘油樣品溶于5 mL甲苯中，然后加入1 mL 5 mg/mL吡啶乙酸銅溶液，將混合溶液振蕩2 min，室溫3 000 r/min離心5 min，取上清液于715 nm波長處測定吸光度。結果以每100 g脂肪中含FFA的質量表示。

1.3.5 POV的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的滴定法[18]。稱取2～3 g中華鱘油樣品（精確至0.001 g），置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，輕輕振搖使油樣完全溶解。準確加入1 mL飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min。取出加100 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定析出的碘，滴定至淡黃色時，加1 mL淀粉指示劑，繼續滴定并振搖至溶液藍色消失為終點。同時進行空白實驗，空白實驗所消耗0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液體積（V0）不得超過0.1 mL。POV按式（2）計算。

式中：V為中華鱘油樣品消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；V0為空白樣品消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；c為硫代硫酸鈉標準溶液濃度/（mol/L）；m為中華鱘油樣品質量/g。

1.3.6 TBARS值的測定

參考?zen等[19]的方法，略作修改。取中華鱘魚肉于料理機內攪碎，稱取2 g攪碎的中華鱘魚肉，加入20 mL 10%三氯乙酸溶液，均質1 min后過濾。取5 mL濾液加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，沸水浴加熱20 min，混合物冷卻至室溫后用分光光度計測定532 nm波長處吸光度。TBARS值表示為中華鱘魚肉中所含丙二醛質量，按式（3）計算。

式中：ρ為從標準系列曲線中得到的丙二醛質量濃度/（μg/mL）；V為中華鱘魚肉溶液定容體積/mL；m為中華鱘魚肉質量/g。

1.3.7 熒光化合物含量的測定

采用Folch等[20]的方法提取總脂，將10 g中華鱘魚肉用200 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶解并勻漿。在室溫下攪拌15～20 min后用濾紙過濾勻漿物，收集液相。用一定量去離子水清洗收集的液相，渦旋10 s，5 000 r/min離心分離兩相。用體積分數50%甲醇溶液沖洗兩相交界面兩次。將混合液移入分液漏斗中，靜置分層3 h，取下層液相，在旋轉蒸發器中蒸發下層氯仿相，即得到脂質。

取脂肪提取分離時的水相溶液，分別測定其在393、463、327、415 nm波長處的熒光吸收強度，確定熒光化合物的組成。熒光化合物含量采用熒光比率表示，按式（4）計算。

式中：RF1為激發波長393 nm、發射波長463 nm處的相對熒光強度；RF2為激發波長327 nm、發射波長415 nm處的相對熒光強度；其中RF＝F/Fst，F為RF1或RF2的熒光強度最大值，Fst為奎寧硫酸溶液在相同波長條件下的熒光強度。

1.3.8 脂肪酸組成的測定

樣品甲酯化：取1.3.3節制得的脂肪樣品20 mg，氮氣吹干，加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，65 ℃水浴加熱振蕩反應30 min，取出冷卻后加入2 mL新配制的三氟化硼-甲醇（1∶3，V/V）溶液，于70 ℃振蕩反應5 min，取出冷卻后加入2 mL正己烷萃取，同時加入2 mL飽和氫氧化鈉溶液促進溶液體系分層，靜置后取上層液過膜移入樣品瓶以備分析。

色譜條件： 色譜柱： H P - 8 8 色譜柱（100 cm×0.25 mm×0.10 μm）；進樣量1 μL；分流比100∶1；進樣口溫度280 ℃；升溫程序：150 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至210 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min，載氣為氦氣（99.99%），流速1.2 mL/min。

質譜條件：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃；離子化模式為電子電離，電子能量70 eV，掃描范圍m/z50～650；掃描模式：全掃描；溶劑延遲：5 min。

1.3.9 肌纖維微觀結構的觀察

挑選解凍后的中華鱘魚塊（魚塊較厚，魚塊紋理清晰均勻），取中華鱘魚背部肌肉，沿肌原纖維方向切為3 mm×3 mm×6 mm的魚塊，使用戊二醛固定肌肉組織，固定后漂洗，隨后依次使用體積分數50%、70%、80%、90%乙醇溶液和無水乙醇梯度脫水，中華鱘魚肌肉樣品干燥后使用掃描電子顯微鏡觀察肌原纖維橫切面的微觀結構，放大倍數200 倍。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 2018和SPSS 19.0軟件進行數據處理和分析，每個實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，采用方差分析進行Duncan檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 凍結過程中華鱘魚肉中心溫度的變化

在凍結過程中，通過最大冰晶生成帶的時間對水產品品質具有較大影響[21]。如圖1所示，中心溫度達到－18 ℃時，液氮凍結組所用平均時間僅為－50 ℃冰柜凍結用時的約1/8，僅為－20 ℃冰柜凍結用時的約1/50，凍結速率明顯加快。4 組鱘魚塊通過最大冰晶生成帶的時間明顯不同，－110、－80 ℃液氮凍結和－50、－20 ℃冰柜凍結所需時間分別為65、210 s和2 810、19 380 s，液氮凍結所用平均時間較冰柜凍結縮短了約20～141 倍。表明液氮凍結中華鱘魚塊的速率快，形成的冰晶小，對肌肉細胞損害小。

圖1 中華鱘凍結過程中心溫度的變化Fig.1 Changes in central temperature of Acipenser sinensis during frozen storage

2.2 凍結方式對凍藏中華鱘脂肪和FFAs含量的影響

脂肪和FFAs含量是影響魚肉脂質水解的主要因素之一，可反映凍藏中華鱘魚肉脂質的水解程度[22]。脂質在脂肪酶催化下發生水解反應，生成甘油和FFAs，使得魚肉品質劣變，促進腥味物質的產生[23]。如圖2A、B所示，隨著凍藏時間的延長，4 組中華鱘魚塊的脂肪質量分數整體呈下降趨勢，FFAs相對含量呈上升趨勢，說明脂肪在凍藏過程中不斷進行水解。這可能是在凍藏過程中，中華鱘魚肉中的冰晶不斷增大，脂質在冰晶的壓迫下被擠出肌肉細胞，從而被脂肪酶水解[24-25]。

圖2 凍結方式對中華鱘凍藏過程中脂肪質量分數（A）和FFAs相對含量（B）的影響Fig.2 Effect of freezing methods on fat (A) and free fatty acid (B) contents in Acipenser sinensis during frozen storage

在凍藏0 周時，液氮凍結組和冰柜凍結組鱘魚塊脂肪質量分數無顯著差異（P＞0.05）。凍藏至18 周，冰柜凍結組的脂肪質量分數較初始時顯著下降（P＜0.05），且顯著低于液氮凍結組（P＜0.05）。凍藏結束時，液氮凍結－110、－80 ℃組的脂肪質量分數較其初始時分別下降了5.97%、4.48%，冰柜凍結－50、－20 ℃組的脂肪質量分數分別下降了13.8%、17.1%。凍藏結束時，－20 ℃冰柜凍結組脂肪質量分數為7.89%，－80 ℃液氮凍結組脂肪質量分數為9.13%。與冰柜凍結組相比，液氮凍結組中華鱘魚塊的脂肪質量分數變化較小，表明液氮凍結可以延緩凍藏中華鱘魚肉脂肪的水解。

液氮凍結組鱘魚塊的FFAs相對含量在凍藏過程中緩慢上升，第24周液氮凍結－110、－80 ℃組的FFAs相對含量較第0周分別增加了74.9%、76.1%。冰柜凍結組的FFAs相對含量在貯藏前期快速上升，后期上升緩慢，第24周冰柜凍結－50、－20 ℃組的FFAs含量較第0周分別增加了83.8%、92.3%。凍藏過程中，液氮凍結組的FFAs相對含量顯著低于冰柜凍結組（P＜0.05），且在24 周前，－110、－80 ℃組間無顯著差異（P＞0.05）。這進一步表明相對于冰柜凍結，液氮凍結可以延緩凍藏中華鱘魚肉脂質的水解。

2.3 凍結方式對凍藏中華鱘POV和TBARS值的影響

脂質氧化生成的初級產物是過氧化物，因此POV可以反映中華鱘魚肉脂質氧化的程度[26]。如圖3A所示，隨著凍藏時間的延長，4 組中華鱘魚塊的POV呈上升趨勢。液氮凍結－110、－80 ℃組中華鱘魚塊的POV分別從第0周的0.23、0.21 μmol/kg增加到第24周的0.39、0.37 μmol/kg；冰柜凍結－50、－20 ℃的POV分別從第0周的0.28、0.31 μmol/kg增加到第24周的0.49、0.65 μmol/kg。在凍藏過程中，液氮凍結組中華鱘魚塊的POV顯著低于冰柜凍結組（P＜0.05），液氮凍結－110、－80 ℃組間無顯著差異（P＞0.05）。這是因為冰柜凍結中華鱘魚塊的冰晶較大，過大的冰晶破壞了細胞膜結構，使膜上的非血紅鐵素被釋放、氧自由基轉化成羥自由基，加快了脂質氧化，得POV更高[27-28]。這表明液氮凍結中華鱘魚塊的脂質氧化程度低于冰柜凍結，液氮凍結可延緩凍藏中華鱘魚肉脂質的氧化。

圖3 凍結方式對中華鱘凍藏過程中POV（A）和TBARS值（B）的影響Fig.3 Effect of freezing methods on POV (A) and TBARS value (B) of Acipenser sinensis during frozen storage

TBARS值反映了中華鱘魚肉脂質氧化次級產物的數量[29]。如圖3B所示，隨著凍藏時間的延長，4 組中華鱘魚塊的TBARS值呈上升趨勢，與Shi Yali等[12]的研究結果類似。在凍藏過程中液氮凍結－110、－80 ℃組和冰柜凍結－50、－20 ℃組的TBARS值分別增加了103%、100%、113%、140%。其中液氮凍結組的TBARS值顯著低于冰柜凍結組（P＜0.05），液氮凍結－110、－80 ℃組間TBARS值無顯著差異（P＞0.05），冰柜凍結－50 ℃組中華鱘魚塊的TBARS值顯著低于冰柜凍結－20 ℃組（P＜0.05），與魯珺[30]的研究結果類似。這是因為隨著凍藏時間的延長，初級氧化階段產生的不穩定氫過氧化物降解成醛、酮等物質，冰柜凍結組中華鱘魚塊的脂質在初級氧化階段氧化程度較高，加速凍藏后期的脂質氧化，次級氧化產物含量迅速增加；同時，因為冰柜凍結過程中氧化暴露時間過長，導致脂肪氧化酶活性高及氧化反應速度快，凍藏后期脂質氧化生成的氫過氧化物能以共價鍵與含硫蛋白結合，提高了脂質的氧化水平[31]，進一步表明液氮凍結延緩了凍藏中華鱘魚肉脂質的氧化。

2.4 凍結方式對凍藏中華鱘熒光化合物含量的影響

凍藏期間，脂質氧化形成的次級產物在脂質與蛋白質的相互作用中與氨基酸側鏈反應產生席夫堿，產生的席夫堿含量可利用熒光分光光度計測定[32]。因此，熒光化合物含量的變化可以間接反映中華鱘魚肉的脂質氧化程度。如圖4所示，隨著凍藏時間的延長，4 組中華鱘魚塊的熒光化合物含量呈上升趨勢。液氮凍結－110、－80 ℃組的熒光比率分別從第0周的0.33、0.26增加到第24周的0.70、0.64，在凍藏18 周后，－110、－80 ℃組間無顯著差異（P＞0.05）。冰柜凍結－50、－20 ℃組的熒光比率分別從第0周的0.44、0.74增加到第24周的0.96、1.31，在凍藏過程中冰柜凍結－50 ℃組的熒光比率顯著低于－20 ℃組，且冰柜凍結組的熒光比率顯著高于液氮凍結組（P＜0.05）。這表明液氮凍結對凍藏過程中華鱘魚肉熒光化合物含量有顯著影響，液氮凍結能更好地抑制熒光化合物的產生，延緩凍藏過程中華鱘魚肉的脂質氧化。

圖4 凍結方式對中華鱘凍藏過程中熒光化合物含量的影響Fig.4 Effect of freezing methods on fluorescent compounds content in Acipenser sinensis during frozen storage

2.5 凍結方式對凍藏中華鱘脂肪酸組成的影響

如表1、2所示，中華鱘魚肉的不飽和脂肪酸含量最高，約占總脂肪含量的80%，其中不飽和脂肪酸中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）高于單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs），含量最高的脂肪酸是油酸（C18:1），其次是亞油酸（C18:2）和棕櫚酸（C16:0），這與宋敏[33]在凍結方式和低鹽腌制對鮰魚片品質影響研究中的結果類似。隨著凍藏時間的延長，中華鱘魚肉PUFAs的相對含量減少，MUFAs和SFAs的相對含量增加。Ω-3多不飽和脂肪酸的融化溫度在－11（α-亞麻酸）～－54 ℃（二十碳五烯酸）之間，因此大部分脂肪酸在冷凍貯藏下呈液態，而液體層主要存在于脂肪晶體表面，隨著冰晶的增大，變形脂肪晶體受到擠壓，使這些液態脂肪酸更易發生氧化[34]。凍藏24 周時，液氮－110、－80 ℃凍結組和冰柜－50、－20 ℃凍結組中華鱘魚肉PUFAs相對含量分別較第0周降低了10.3%、10.3%、20.7%、27.2%，液氮凍結組中華鱘魚肉PUFAs相對含量明顯高于冰柜凍結組。這表明中華鱘凍藏過程中主要是PUFAs發生氧化降解，液氮凍結降低了凍藏中華鱘魚肉PUFAs氧化降解的程度。

表1 凍結方式對中華鱘第0～12周凍藏過程中脂肪酸組成的影響Table 1 Effect of freezing methods on fatty acid composition in Acipenser sinensis during 0–12 weeks of frozen storage

表2 凍結方式對中華鱘第18～24周凍藏過程中脂肪酸組成的影響Table 2 Effect of freezing methods on fatty acid composition in Acipenser sinensis during 18–24 weeks of frozen storage

2.6 凍結方式對凍藏中華鱘肌纖維的微觀結構的影響

如圖5所示，凍藏第0周，4 組鱘魚塊肌纖維橫切面差異不明顯，切面平整，肌纖維排列緊密，冰柜凍結組的肌肉組織有細微間隙。隨著凍藏時間的延長，4 組鱘魚塊肌肉組織的微觀結構均出現不同程度的變化：從凍藏第12周開始，冰柜凍結組肌肉組織的間隙變大；凍藏第24周，冰柜凍結組的肌纖維排列松散，間隙明顯增大。相對于冰柜凍結組，液氮凍結組肌肉組織微觀結構變化不明顯，凍藏第18周肌肉組織才開始出現少量間隙，但肌纖維排列仍然整齊。這是因為在凍結和凍藏過程中，冰晶的形成和生長導致肌肉組織結構受到不同程度的機械損傷，液氮凍結形成的細小冰晶減少了肌肉組織損傷。該結果與唐佳楣等[35]研究凍結方式對凍藏大黃魚品質影響的結果類似。魚肉肌纖維微觀結構變化進一步驗證了液氮凍結減輕了中華鱘凍藏過程中脂質的水解，從而減緩了脂質氧化的速率。

圖5 凍結方式對中華鱘凍藏過程中肌肉組織微觀結構的影響Fig.5 Effect of freezing methods on microstructure of muscle in Acipenser sinensis during frozen storage

3 結 論

本研究證明了凍結方式可顯著影響中華鱘凍藏過程中脂質的水解和氧化。相比冰柜凍結，液氮凍結顯著提升了熱交換速率，使魚塊迅速降溫，縮短了魚肉通過最大冰晶生成帶的時間，從而減小了魚肉中的冰晶尺寸，對中華鱘肌肉組織結構的機械損傷更小，表現出肌纖維排列緊密和整齊，延緩了脂質的水解，使凍藏中華鱘魚肉的脂肪質量分數較高。本研究認為，中華鱘凍藏過程中主要是PUFAs發生氧化，而液氮凍結比冰柜凍結更好地抑制了PUFAs的氧化，因此凍藏過程中華鱘魚肉的POV、TBARS值和熒光化合物含量低，脂質水解和氧化程度低，凍藏品質好。該研究可為中華鱘的凍藏保鮮保質與加工提供理論和技術支撐。