食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽：構效關系、安全性及生物利用度研究進展

李志明，張 舒，孟維洪，張家瑜，張東杰,3,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

由胰腺β細胞功能受損、胰島素代謝紊亂所導致的糖尿病是世界性代謝紊亂疾病，血糖偏高和血脂持續異常是該疾病的主要病理特征，可分為1型、2型（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和妊娠型。其中T2DM占患病人群的90%以上[1]，近十年來，全世界糖尿病患病人數持續攀升，預計至2046年，全球T2DM患病人數將增至6.42億。針對T2DM的病理學特點，現已開發了各類口服降糖藥用以預防、治療T2DM，干預途徑主要包括兩種：一是有針對性地提升胰島細胞活性，促進胰島素分泌，從而間接降低血糖（雙胍類、磺脲類、二肽基肽（dipeptidyl peptidase，DPP）IV酶抑制劑、胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）激動劑等）；二是延緩攝入體內的碳水化合物轉換化為葡萄糖的速率以阻礙葡萄糖進入體循環，從而對餐后血糖進行直接調控（α-葡萄糖苷酶抑制劑）[2]。相較于第一種間接血糖調控機制，抑制腸道內碳水化合物消化酶活性可對T2DM患者血糖進行直接干預，不涉及胰島細胞及代謝靶器官，可一定程度緩解患者胰島素代謝壓力，改善受損的胰島β細胞功能，所以采用有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑來控制血糖異常現已成為預防、治療T2DM的重要策略之一[3]。大量研究已證實，一些食品源生物活性成分（肽、酚類、萜類等）具備優異的α-葡萄糖苷酶抑制潛能[4]，其中由食源蛋白制備的α-葡萄糖苷酶抑制肽具有營養屬性，因其生物利用度高、T2DM治療效果明顯、與傳統α-葡萄糖苷酶抑制劑相比副作用低等特點受到研究界的廣泛關注，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的制備與研究已成為熱點。

多肽的氨基酸組成、序列、分子質量、鏈長、凈電荷等顯著影響其功能特性和生理活性，同時，不同的多肽構型和分子特征與其動力學行為、靶向生物藥理功效、化學穩定性、生物利用度、半衰期、毒性和過敏性等性質皆存在特定的關聯[5]。早在2018年，Ibrahim團隊[6]將篩選的43 條食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽通過歸類統計，總結了α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特點和作用機制，包括：1）鏈長3～6；2）N端含OH（Ser、Tyr、Thr）或堿性氨基酸（Lys、Arg、His）；3）C端出現Ala或Met；4）Pro靠近C端，最好位于倒數第二位；5）在pH 7.0時凈電荷為0或＋1；6）以氫鍵、靜電相互作用為主，可忽略疏水相互作用。這幾條規律被多數α-葡萄糖苷酶抑制肽研究人員所引用，作為篩查、鑒別高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽的“黃金準則”，具有指導性意義。但是，近些年針對α-葡萄糖苷酶抑制肽的定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）探究發現了許多之前未提及的結構特征，肽與α-葡萄糖苷酶之間的分子相互作用機制也與上述觀點部分沖突或重疊度低。比如，Gallego等[7]制得的大麻蛋白肽（LR和PLMLP）在α-葡萄糖苷酶抑制方面有優異表現，但質譜結果顯示其肽鏈上Leu是靶酶活性降低的關鍵氨基酸殘基；Mollica等[8]發現所篩選的α-葡萄糖苷酶抑制肽可通過氫鍵、親水/疏水相互作用等形式實現對α-葡萄糖苷酶活性的抑制。這些發現在Ibrahim等[6]總結的α-葡萄糖苷酶抑制肽特征和肽-酶結合模式中均未提及。

其次，與非腸道給藥（注射、鼻腔、肺部等）的肽療法不同，作為食物、營養藥品和補充劑配方的α-葡萄糖苷酶抑制肽通常口服后經口腔-胃腔-腸腔-肝門靜脈而進入體循環，受到消化酶、肽酶、代謝酶的侵擾，導致生物可及性較低，在人體血液中的濃度維持在極低的水平（nmol/L），遠低于體外所測定的濃度（約1～100 μmol/L）[9]。α-葡萄糖苷酶大量聚集在小腸黏膜上皮細胞處，α-葡萄糖苷酶抑制肽到達作用位點之前需耐受胃腸腔的酶屏障（胃/胰/糜蛋白酶）和嚴峻的pH環境、穿透覆蓋在小腸上皮細胞上的黏液層，進而引發肽-靶酶分子生化反應[10]。“逃逸”或“多余”的α-葡萄糖苷酶抑制肽可根據電荷、親/疏水等特點與構成腸黏膜的腸道細胞、微褶細胞（M細胞）特異性受體結合，抵抗外排轉運體（P-glycoprotein，P-gp）后經多途徑轉運入肝門靜脈系統，在肝門靜脈系統中，大量細胞色素P-450（cytochrome P-450，CYP-450）代謝酶催化親脂性肽多種功能基團的N—和O—，使其脫烷基化、甲基化、乙酰化及葡萄糖醛酸化。最終釋放并進入體循環的α-葡萄糖苷酶抑制肽還具有抑制DPP IV酶活性、促胰高血糖素樣肽-1分泌、清除脂質堆積等功能[11]，全方面立體、多角度地干預T2DM。通過酶法/發酵法制得的新肽是否會攜帶具有過敏潛力甚至毒性的序列至今尚未闡明，α-葡萄糖苷酶抑制肽的安全性評估面臨諸多挑戰。基于此，本文在Ibrahim等[6]研究的基礎上，使用ScienceDirect（https://www.sciencedirect.com，[2022-08]）搜尋關鍵詞“α-glucosidase”和“peptide”，使用中國知網（https://www.cnki.net，[2022-08]）高級檢索關鍵詞“α-葡萄糖苷酶”和“肽”整理相關文獻，歸納出近6 年（2016年1月—2022年8月）已實驗驗證的具有α-葡萄糖苷酶抑制活力的食源性肽序列62 條，供本綜述參考分析；采用在線工具ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html）預測肽段分子質量、凈電荷（pH 7.0）、理論等電點（pI）、疏水性和毒性；采用Allergen FP v.1.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）分析肽段致敏性；采用ADMETlab（https://admet.scbdd.com/home/index/）和SwissADME（https://www.swissadme.ch/index.php）等工具較全面地評估α-葡萄糖苷酶抑制肽的生物利用度。旨在進一步補充α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特性，并運用生物信息學方法深入闡述具有α-葡萄糖苷酶抑制肽結構特征的系列肽段具有安全隱患的概率，以及其對胃腸腔環境、黏液等生化及物理屏障的穿透能力，以期側面反映其開發成高品質、多功能降糖肽的潛力。

1 構效關系

1.1 鏈長、分子質量、氨基酸組成、序列與α-葡萄糖苷酶抑制活性的關系。

如表1所示，有32 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）小于阿卡波糖（IC50＝201 μmol/L），抑制活力排名前5 位的多肽依次是FDPFPK（IC50＝7.94 μmol/L）、STYV（IC50＝12.01 μmol/L）、AAAPVAVAK（IC50＝13.71 μmol/L）、AIGVGAIER（IC50＝14.74 μmol/L）、WH（IC50＝16.99 μmol/L）。這62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽鏈長位于2～16之間，由2～9 個氨基酸殘基組成的多肽數量占總數的90.32%，研究頻率最高的是四肽（10 個）、五肽（9 個）和七肽（9 個），其中鏈長3～7范圍內的多肽具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50＜80 μmol/L），提示該鏈長區間的多肽有更強的抑制潛能。α-葡萄糖苷酶抑制肽不同分子質量片段頻率如表2所示。經過統計分析可知，62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽中，分子質量小于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽出現頻率高達48.39%，說明其是α-葡萄糖苷酶抑制肽的主流分子質量；且IC50＜20 μmol/L的α-葡萄糖苷酶抑制肽平均分子質量為574.57 Da（表3），說明分子質量低于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽活性更高。事實上，由于肽與α-葡萄糖苷酶有效親和力的要求，過長的肽段對二者的結合效果存在負面影響。Ibrahim等[12]研究發現，α-葡萄糖苷酶抑制肽（如SAPA、SCPA、SEPA等）與α-葡萄糖苷酶活性位點的結合自由能（－36.37～－26.75 kJ/mol）接近或大于SPA基序（－28.01 kJ/mol），這個結果證實了短肽有益于降低肽-酶結合自由能，提升對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。本文所分析的α-葡萄糖苷酶抑制肽的鏈長在3～7之間，與Ibrahim等[6]總結的鏈長3～6不同，從兩方面考慮：一是鏈長在3～7之間的α-葡萄糖苷酶抑制肽滿足與α-葡萄糖苷酶的結合要求；二是研究發現這兩類α-葡萄糖苷酶抑制肽（六肽和七肽）的抑制效果差異不顯著。例如，吳彤[13]所篩查的核桃蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽中六肽LVVDHL和七肽LDVVDHL在質量濃度1.5 mg/mL時對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為20.4%和19.4%，并無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特征、抑制活性、毒性及致敏性Table 1 Structural properties, inhibitory activity, toxicity and allergenicity of food-derived α-glucosidase inhibitory peptides

表2 α-葡萄糖苷酶抑制肽不同分子質量片段頻率Table 2 Frequency of different molecular-mass segments of α-glucosidase inhibitory peptides

表3 不同IC50值的α-葡萄糖苷酶抑制肽平均分子質量Table 3 Average molecular masses of α-glucosidase inhibitory peptides with different half maximal inhibitory concentration

如圖1所示，Pro、Leu、Ala在α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸組成上占重要地位，在其肽段上的出現頻率最高。Pro除在增強α-葡萄糖苷酶抑制肽的抑制能力中顯示重要作用外，在與血管緊張素轉化酶（angiotensin I converting enzyme，ACE）、DPP IV酶催化/活性位點鍵合上也占有獨特優勢[14-15]。Ibrahim等[12]證實α-葡萄糖苷酶抑制肽SEPA、SVPA中Pro的官能團C＝O分別與α-葡萄糖苷酶位點Arg526的亞氨基和Lys286的氨基通過氫鍵耦合。多項研究表明Pro的環形亞氨胺結構可使整條肽鏈發生折疊，出現構象不規則變化，進而造成肽鏈結構約束，這可能是其發揮功效的關鍵因素[16]。一般來說，Pro位置越靠近C端，其抑制活性越強。Leu在緩解T2DM胰島素抵抗癥狀、提升胰島素作用強度、恢復β胰島細胞生理活性上發揮重要作用[17-18]，是α-葡萄糖苷酶抑制肽篩查的參考氨基酸之一。含大量Leu的大豆蛋白肽（LLPLPVLK）[1]和核桃蛋白肽（LPLLR）[19]表現出高效的α-葡萄糖苷酶抑制活性，適合出現在N端（圖1）。同時，Ala也可顯著提升α-葡萄糖苷酶抑制肽的活性，蛋黃蛋白肽YINQMPQKSRE（IC50＝1.21 mmol/L）在引入Ala后（YINQMPQKSREA，IC50＝0.31 mmol/L）IC50值大幅下降，抑制活性顯著提升[20]。本文認為Pro、Leu、Ala是α-葡萄糖苷酶抑制肽組成上的重要氨基酸殘基。在其他研究中也已經證實Pro、Leu、Ala對胰島素分泌有顯著改善作用。研究發現，在胰腺β細胞系和原代胰島細胞的體外實驗中，Pro、Leu、Ala、Arg和Gln都展示出了不同程度的促胰島素作用[21]；并且，在只攝入Leu、Ala、Ile、Phe和Arg時，人體內胰島素分泌量顯著升高[22]。這些證據表明，Pro、Leu、Ala不僅是保證α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的分子基礎，更是利用抗糖尿病活性肽管理和預防T2DM的關鍵因子。今后應重點研究并解析Pro、Leu、Ala對α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影響，以期為α-葡萄糖苷酶抑制肽的高效率篩查提供參考（圖2）。氨基酸序列是影響生物活性肽生理活性的關鍵結構性質，氨基酸組成相同但序列不同的多肽功能特性和活性存在顯著區別[23]。由圖1可知，Ala、Ser在N端出現頻率較高，符合Ibrahim等[6]的研究結果。此外，本文中活性最強（FDPFPK（IC50＝7.94 μmol/L））和較強（WH（IC50＝16.99 μmol/L）、WS（IC50＝7.94 μmol/L））的α-葡萄糖苷酶抑制肽N端出現芳香族氨基酸殘基（Phe和Trp），推測這兩類氨基酸殘基有增強α-葡萄糖苷酶抑制能力的作用。C端堿性氨基酸Arg和Lys的出現頻率極高（分別為27.59%和20.69%）。肽段C端Arg的存在可提高肽-酶結合穩定性，保證肽與酶關鍵活性氨基酸殘基的強結合，從而提高其抑制活性。例如，小麥胚芽蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽LDLQR中C端Arg殘基與α-葡萄糖苷酶Asp443和Asp542存在氫鍵鍵合作用，氫鍵鍵長（2.1 ?）遠短于傳統平均氫鍵距離（3.5 ?）[24]。Lys在活性排名前3 位的FDPFPK、AAAPVAVAK中均有出現，提示Lys也是保證α-葡萄糖苷酶抑制活性的必要氨基酸殘基。

圖1 α-葡萄糖苷酶抑制肽氨基酸殘基組成Fig.1 Composition of amino acid residues of α-glucosidase inhibitory peptides

圖2 食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽結構特征、安全性和生物利用度Fig.2 Structural characteristics, safety and bioavailability of foodderived α-glucosidase inhibitory peptides

在了解上述α-葡萄糖苷酶抑制肽氨基酸組成規律后，通過氨基酸分析等方法了解親本蛋白的氨基酸組成，能在一定程度上判斷該底物開發成α-葡萄糖苷酶抑制肽的潛力（圖2）。燕麥蛋白的Pro、Leu、Ala、Arg相對含量均處于較高水平（分別為6.59%、8.39%、6.90%和6.39%），由其制備得到的α-葡萄糖苷酶抑制肽GDVVALPA和DVVALPAG的“Pro＋Ala＋Leu”占比達50%[25]，已被證明是制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的優質蛋白來源。依據此思路，提高親本蛋白Pro、Leu、Ala等氨基酸的含量有助于制得高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽。植物性蛋白來源中的薏仁醇溶蛋白（Pro所占摩爾比為8.21%～8.3%，Leu為16.64%～17.09%，Ala為11.03%～11.12%）[26]和菜籽餅粕蛋白（Pro含量為3 468.70 μg/100 mg，Leu為4 308.65 μg/100 mg，Ala為22 410.17 μg/100 mg）[27]，和富含Pro的魚類膠原蛋白[28]都可作為生產α-葡萄糖苷酶抑制肽的優質原材料，亟待開發與研究。

1.2 凈電荷、等電點、疏水性與α-葡萄糖苷酶抑制活性的關系

如表1所示，62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽凈電荷范圍在－4～＋3，其中高活性的多肽為0或＋1，與Ibrahim等[6]的結果一致。此外，高電荷肽AEEEYPDL（電荷為－4，IC50＝5 580 μmol/L）和CGKKFVR（電荷為＋3，IC50＝621.23μmol/L）的α-葡萄糖苷酶抑制活性遠低于其他多肽，可見高電荷會大幅削弱其抑制活性。本文同時發現，多肽等電點對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響微乎其微（Pearson相關系數r＝－0.160）。

根據相關性分析可知，疏水性與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關性較低（Pearson相關系數r＝0.207），Ibrahim等[6]也論證了這一點。但最近幾年的研究也表明，α-葡萄糖苷酶抑制肽與α-葡萄糖苷酶分子的結合存在大量疏水相互作用模式，在燕麥肽[25]、熒光假單胞菌環肽[46]和油麻子肽[48]的肽-酶結合模式中都證明了這一點。另外，其他非共價作用力也積極參與肽-酶作用過程，Mollica等[8]借助計算機輔助篩選出的4 個小肽均通過多種方式（氫鍵、親水相互作用、疏水相互作用、＆#x1d70b;-陽離子相互作用）與α-葡萄糖苷酶相互作用。以上結果與多肽的親水/疏水性平衡、特有酸堿性質（pH值和凈電荷）所支配的構象能量平衡、結合位姿密切關聯。

2 α-葡萄糖苷酶抑制肽的安全性

2.1 毒性

基于ToxinPred服務器中1 805 個有毒肽、3 593 個無毒肽構建肽數據集，采用支持向量機（suppport vector machine，SVM）監督機器學習算法[49]（輸入SVM閾值＝0.0）對所選62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的毒性進行預測，由表1可知，全部多肽均無毒。作為膳食蛋白制備的食源活性肽，對其安全性的評價仍存在爭議，尤其是利用新基底、新加工工藝和非消化酶配制及提取的新肽，其安全性在實驗室階段尚未得到充分論證[50]。目前，除針對各腫瘤細胞的體外毒性實驗外[51]，關于食物蛋白源形成毒性蛋白的證據有限，但通過對有毒活性肽的結構參數進行研究，現已初步了解到有毒活性肽的部分結構特征。現有的證據表明，有毒活性肽可能具有以下特征[49,52]：1）肽段中帶有LKL、KWK、FKK、KKLL和CYCR序列；2）肽段中出現以聚谷氨酰胺（poly Q）為基序的重復序列；3）肽段中出現以Cys為基序的蝎毒素樣結構域（識別的基序為CN37CN3-6CN0-5CN1-4CN4-13C，“C”表示Cys，“N”表示氨基酸，“3～7”表示氨基酸的潛在數量）的重復序列。活性肽除具有上述結構表征而表現出毒害作用外，其服用劑量和持續服用時間等因素也不容忽視。研究表明，辣木籽蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽KETTTIVR經過軟件擬合預測并無毒性，但Wang Xuefeng等[53]在紅細胞毒性實驗中發現當多肽質量濃度超過4 mg/mL時，細胞溶血率高達7.18%，表明其在高質量濃度下可對紅細胞產生藥物毒性。綜上，即使本文發現α-葡萄糖苷酶抑制肽不含有毒肽的結構特征，但如將α-葡萄糖苷酶抑制肽作為功能性產品干預T2DM，還需進行系統和完整的體內和臨床試驗，以便進一步保證其安全性。

2.2 致敏性

本文使用Allergen FP v.1.0服務器對α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性進行預測，該web服務器內包含2 427 個過敏原和2 027 個非過敏原的蛋白質數據集，數據集的蛋白質中氨基酸序列由5 個E-描述符（E1：氨基酸疏水性；E2：氨基酸分子質量；E3：氨基酸的螺旋形成傾向；E4：氨基酸相對豐度；E5：β鏈的形成傾向）所描述，同時使用自動交叉協方差（auto-cross covariance，ACC）的蛋白質序列挖掘工具[54]對數據集內蛋白質的序列長度進行統一，判別系數“Tanimoto”將蛋白質區分為過敏原或非過敏原。通過上述預測模型，有35 條α-葡萄糖苷酶抑制肽被鑒定為潛在過敏原，這些多肽與數據集內已知的過敏原具有類似的氨基酸組成或肽基序，并帶有抗原表位[55]。作為過敏原的蛋白或多肽（有B細胞表位）被免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）抗體識別并結合后觸發IgE與肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面FcεR受體的交聯反應，進而激發免疫，釋放炎癥介質、前列腺素和白三烯，進而引發過敏[56]。由表1可知，被鑒定為過敏原的α-葡萄糖苷酶抑制肽鏈長度在3～16范圍內，以三肽、四肽、七肽和八肽為主。但一般來說，過敏肽以長鏈居多，短肽因缺乏三級結構，IgE與FcεR受體的交聯能力較差，不易誘發過敏反應[57]，Yap等[58]利用AlgPred在線平臺對180 條抗糖尿病肽進行致敏性預測，篩選出了54 條過敏肽，鏈長在12～23之間。目前沒有足夠的證據完整表述過敏肽的基序，現主要通過一些數據庫對待測肽段的過敏潛力進行初步預測，可用的數據庫包括Allergome（http://www.allergome.org/）、WHO/IUIS（http://www.allergen.org/）、過敏原蛋白結構數據庫（structural database of allergenic proteins，SDAP）（http://fermi.utmb.edu/SDAP/）、BIOPEP-UWM數據庫（http://www.uwm.edu.pl/biochemia）和Allergen FP v.1.0在線平臺（www.ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）等。例如，有研究者通過BIOPEP-UWM數據庫成功預測了多條κ-酪蛋白過敏肽（RPKHPIKHQG、NENLLRFFVA和FFVAPFPEVFGK）[59]；Singh等[60]通過Allergen FP v.1.0在線平臺對玉米、大麥、小麥等谷物貯藏蛋白所制得的二肽（PF、AF、SF、QF、IF、KF、WA和WQ）進行致敏性預測，發現均不存在過敏性。另外，從表1中可以觀察到，這35 條過敏肽中有12 條具有胃腸道消化酶抗性，比例達到1/3以上。有報道稱，具有胃腸道消化酶抗性的多肽更易引發機體過敏，原因在于胃腸道消化酶抗性肽一般具有緊湊結構，保護了致敏抗原表位的完整構象，尤其是當肽段中帶有足夠數量的半胱氨酸時，由于其形成的二硫鍵所產生的強大空間位阻，不僅有助于阻止水解物的切割效應，也會對過敏肽的抗原表位進行保護[61]。

當食物親本蛋白本身就是潛在過敏原時，該蛋白會攜帶能引發過敏等不良反應的B細胞表位，其在活性肽制備過程中也不可避免地被釋放，但可以通過蛋白酶水解、菌種發酵、加熱、輻射、高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）等方式[62]破壞IgE與表位的結合以降低食源蛋白的致敏性。主要原理是通過加工處理破壞抗原表位，或使表位構象發生改變，進而降低抗原性。目前對蛋白抗原性消減領域研究最多的是β-伴大豆球蛋白，已有文獻指出，熱處理[63]、HHP[64]、超高壓處理[65]均可通過改變β-伴大豆球蛋白的二、三、四級結構，影響其免疫原性，同時也暴露出更多的疏水區域，打斷其二硫鍵，有利于蛋白被消化酶水解，破壞多處線性抗原表位。盡管有研究指出，過敏源的主要特征（尤其是帶有過敏潛力的活性肽結構特征）未被完整描述，但通過上述途徑可在一定程度上避免產生帶有致敏原性的活性肽。本文的分析結果提示未來在進行α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究時，需格外關注所制得α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性。

3 α-葡萄糖苷酶抑制肽的生物利用度

3.1 胃腸道消化酶的抗性

采用Expasy在線平臺的“PeptideCutter”工具（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）模擬胃腸道消化酶的水解，選用胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的消化酶抗性進行考察，并通過BioPEP-UWM數據庫（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start_biopep.php）的“搜索活性片段”功能將釋放的肽序列進行生理活性匹配（表4）。α-葡萄糖苷酶抑制肽在進入消化系統后，會面臨胃腸腔內不穩定環境和酶降解的生物屏障，pH值的波動影響多肽的電離程度、降解作用和傳遞效率[66]，接觸的消化酶和肽酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰彈性酶、羧肽酶A/B和刷邊肽酶（羧肽酶M和氨基肽酶A/N/P/W），切割后不可逆地改變多肽結構和生物活性。活性肽在胃腸環境下的抗性主要體現在兩個方面：一是肽段本身缺乏消化酶的切割位點；二是由于特定氨基酸殘基組成和序列干擾酶活性位點的空間或靜電排列，從而阻止酶切反應的發生。本文所研究的α-葡萄糖苷酶抑制肽中有25 條對胃腸道消化酶耐受，其中鏈長在3～7的肽段占76%，這25 條胃腸道消化酶抗性肽平均分子質量為554.56 Da，且大部分肽段分子質量在300～500 Da之間。大多數抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽含有P r o 殘基（如P G G P、QPHQPLPP和IPP等），推測Pro可通過環化鄰近氨基酸側鏈使其回到肽主鏈，從而保證肽的剛性結構，進而限制蛋白水解酶對鄰近氨基酸殘基的切割作用[16]，考慮到電荷性質、疏水性等特性，本文總結了關于胃腸道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽可能的結構特征（圖2）：1）鏈長3～7；2）分子質量300～500 Da；3）pH 7.0時凈電荷為0或＋1；4）低疏水性；5）肽段中出現數量較多的Pro。上述歸納的具有胃腸道消化酶抗性的α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特點與Ahmed等[67]總結的胃腸道內穩定肽（主要是ACE抑制肽、抗氧化肽）的序列特征一致，在符合胃腸道內穩定肽結構特征普遍性的同時保證了胃腸道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽的獨特性。

表4 α-葡萄糖苷酶抑制肽的胃腸道消化酶抗性及裂解肽生物活性、Caco-2滲透性、腸道吸收率、生物利用度評分Table 4 Gastrointestinal digestive enzyme resistance, Caco-2 permeability, intestinal absorption rate, bioavailability scores of α-glucosidase inhibitory peptides

3.2 小腸黏液層的滲透

黏液層是覆蓋腸道上皮的保護性屏障，可分為外層黏液（松散黏液）和內層黏液（堅硬黏液）[68]，黏液屬于一種水凝膠，覆蓋有黏蛋白、脂類、細胞碎片和細菌等物質[69]，該屏障主要通過兩種機制調控多肽滲透效率[70]：一是多肽與帶負電荷黏蛋白特異性結合；二是由黏蛋白纖維構成的網狀結構阻隔多肽的滲透。其中，黏蛋白是黏液的主要功能成分，其主體構成是質量分數占50%～80%的糖蛋白，由于其末端唾液酸和硫酸鹽基團的存在，使黏蛋白在黏液中攜帶負電荷[71]。由于上述黏液層的特點使得親水性和帶凈正電荷的多肽在跨越該屏障時占優勢（圖2）。Sun Xiaohong等[72]通過體外模型發現陽離子肽（KIPAVF、KMPV）和高度親水的零電荷肽（MANT、TNGQ和PASL）與黏蛋白有強結合活性，而高疏水指數的未帶電肽（YMSV、QIGLF）與黏蛋白結合能力較弱。對照本文總結的α-葡萄糖苷酶抑制肽結構特征，疏水性、0或＋1凈電荷狀態使α-葡萄糖苷酶抑制肽在黏液層滲透時會有阻力，今后可考慮搭配食品級滲透增強劑（檸檬酸、脂肪酸和殼聚糖等）[73]以提升其滲透效率。

3.3 腸道運輸的途徑

α-葡萄糖苷酶抑制肽在小腸黏膜處發揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的同時，也具有對α-淀粉酶、DPP IV酶和葡萄糖轉運體（glucose transporter，GLUT）家族等抗糖尿病靶標的抑制功能，在體內吸收并進入體循環后通過多種途徑協同調控T2DM，這種現象已在體外抗T2DM靶酶活性抑制實驗、細胞及動物實驗中得到了驗證[19,74]。據此推測，未能與α-葡萄糖苷酶充分接觸并反應的α-葡萄糖苷酶抑制肽可根據其分子質量、氨基酸組成和凈電荷等結構特征通過以下一種或多種途徑穿越小腸上皮細胞層進入到下一循環，如PepT1介導的滲透、細胞旁運輸、轉胞吞作用和被動跨細胞擴散。表5總結歸納了關于生物活性肽轉運途徑的特征信息[75]。在表4中，本文借助ADMETlab在線平臺預測了62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的Caco-2滲透性和腸道吸收率。其中，人腸道Caco-2細胞通常用于體外測定多肽的口服生物利用度，且為降低體內與體外實驗的區間誤差，常采用Caco-2與分泌黏液的人結直腸癌上皮細胞HT-29共培養[76]。如表4所示，4 個環肽Cyclo（PL）、Cyclo（PV）、Cyclo（PF）和Cyclo（HP）的Caco-2滲透性（推薦值：最佳lgPapp應大于－5.15）和人體腸道吸收率明顯高于其他α-葡萄糖苷酶抑制肽，生物利用度評分也都在0.55的高水平。一般來說，具有較強構象彈性的環肽可通過細胞旁轉運，并且其Caco-2細胞滲透性顯著高于線形肽，Pauletti等[77]的環六肽Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-X-Ala-NH2細胞轉運實驗也證明了這一點。有研究發現，鏈長與表觀滲透系數（Papp）呈反比，Hong等[78]研究報道的Papp排序為Gly-Sar＞Gly-SarSar＞Gly-Sar-Sar-Sar＞Gly-Sar-Sar-Sar-Sar，和Osborne等[79]報道β-酪啡肽-7（YPFPGPI）的Papp遠低于β-乳球蛋白二肽（YL）都體現了這種關聯，但在本文分析中并未體現這一點，這可能涉及了其他因素（電荷、疏水性等）。多肽的氨基酸序列也會影響其生物利用度。具體來說，C端氨基酸帶正電和N端出現Cys、Leu、Met、Pro、Val和Ile有助于提升其滲透性[80-81]。依據以上分析和各轉運途徑特點，可在一定程度上了解并判斷已篩查的α-葡萄糖苷酶抑制肽所采用的轉運途徑和轉運效率，進一步明確其在體內吸收、分布、代謝和排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）情況（圖2）。

表5 生物活性肽在腸道上皮細胞中的轉運Table 5 Transport of bioactive peptides in intestinal epithelial cells

3.4 代謝酶屏障

多肽通過腸屏障和抵抗P-gp后轉經肝門靜脈系統，肝屏障中存在大量代謝酶，可針對性滅活親脂類物質[82]。代謝酶屬于CYP-450家族，包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4這些參與多肽代謝的人類CYP酶，其對分子的初級代謝起關鍵作用，整個過程被稱為首過代謝[83]。在這個過程中，多肽物質通過CYP-450家族與功能性氧化酶混合反應催化以實現多種官能團羥基化，從而完成生物轉化[84]，期間涉及N—和O—脫烷基化、甲基化、乙酰化和硫酸化等反應，最終影響多肽的生物活性。但是，對于α-葡萄糖苷酶抑制肽在此階段生物利用度的研究明顯不足，作為進入血液循環的關鍵一環，深入探究該屏障對α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影響規律有助于闡明α-葡萄糖苷酶抑制肽作為多功能降糖肽的結構潛力和應用前景。

4 結 語

隨著T2DM患病率的逐年上升，近些年人們將對治療手段或替代藥物的關注放在天然食物活性成分的提取或制備上，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽在預防和干預T2DM中已展現出巨大的潛力。明晰高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特點有助于更有效率、更有針對性地進行食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽段的篩選，并進一步分析和判斷其安全性、生物利用度等生物學特點。

盡管現階段關于高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結構特征有一定的研究，但大都停留在氨基酸組成及排序、分子質量、疏水性等結構參數的單一解釋上，未建立起整合各結構特性的構效關系研究體系。研究肽-酶分子作用機制的工具主要借助于分子對接技術，未積累足夠數據填補生化實驗與虛擬對接之間的信息誤差，未來研究可運用X射線晶體學、表面等離子體共振等新興技術深入探究食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽與α-葡萄糖苷酶的作用模式。此外，在該類活性肽的研究與開發中，人們將目光集中到了制備工藝的優化、活性的提升及作用機制的解析上，而忽視了對其安全性的評價和對毒性肽及過敏肽結構特征的系統性總結，本文對該方面進行了初步探討，但未深入討論食物蛋白提取、預處理和制備過程中導致肽的分解、外消旋和環化等其他情形，這些局限使其作為功能性食品或藥物的安全性和功效無法得到保證。目前，關于該抑制肽的活性研究雖較多，但均停留在體外驗證階段，對體內吸收部分未能充分考慮。其次，小腸上皮細胞刷狀緣是肽發揮活性的重要場所，在研究時易被忽視，外翻腸套實驗可在體外模擬情況下顧及到該部位[24]，從而使實驗結果更接近人體真實情況。未來也需多關注食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽攝入后在胃腸道、小腸黏膜、小腸上皮細胞及肝臟代謝等過程中的活性保持、轉運效率、代謝組學等情況，這不僅可以了解其在各轉運階段降解、代謝及受損的狀況，也可為明確食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的多功能研究提供數據支撐，以促進降糖肽的開發利用。