基于非靶向代謝組學(xué)研究普洱熟茶對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

雷舒雯，張智芳，謝桂華，山 波，苗 玥，趙春燕，陳德洪，侯 艷,,*，龔加順,4,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650233）

衰老是隨著年齡的增加或者疾病的產(chǎn)生導(dǎo)致機(jī)體生理功能、結(jié)構(gòu)組織等發(fā)生退化性改變的過程[1]。延緩衰老一直是研究熱點(diǎn)，而自由基學(xué)說[2]則被認(rèn)為是與衰老密切相關(guān)的代表性理論。在延緩衰老和對(duì)抗疾病方面，二甲雙胍、雷帕霉素和白藜蘆醇干預(yù)方式已被證明能夠延長一些動(dòng)物模型的壽命，與服用這3 種藥物相比，通過改變飲食來改善代謝健康會(huì)獲得更大益處[3]。普洱熟茶是一種以云南大葉種曬青毛茶經(jīng)微生物發(fā)酵加工而成的后發(fā)酵茶[4]，可作為一種長期飲用的飲品。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，普洱熟茶可以有效提高D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老小鼠肝臟中超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低丙二醛含量，表明普洱熟茶能夠?qū)棺杂苫鶕p害，有效預(yù)防由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷，具有強(qiáng)抗氧化能力，從而延緩衰老[5]。

衰老常伴隨代謝功能紊亂[6]。腦是受衰老影響最大的器官之一[7]，在代謝過程中產(chǎn)生大量的活性氧自由基及丙二醛，這些物質(zhì)能刺激大腦神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，影響神經(jīng)元及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，最終導(dǎo)致腦衰老[8-9]。血液通過全身循環(huán)可在不同組織間進(jìn)行物質(zhì)傳遞，其中研究血清中的代謝物能整體把握機(jī)體的代謝情況，提供實(shí)時(shí)的生物信息[10-11]。本研究以D-gal皮下注射建立小鼠衰老模型，利用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry，UPLC-QE-MS）代謝組學(xué)技術(shù)，并采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal PLS-DA，O P L S-D A）方法結(jié)合變量投影重要度（v a r i a b l e importance for the projection，VIP）與非參數(shù)檢驗(yàn)共同分析對(duì)照組、D-gal衰老模型組、普洱熟茶組小鼠腦組織和血清中代謝物的變化規(guī)律，通過總體（腦組織）及外周（血清）代謝組學(xué)探尋普洱熟茶延緩衰老的潛在代謝物，揭示與普洱熟茶抗衰老作用機(jī)制有關(guān)的代謝通路，以期為普洱熟茶的作用機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，5～6 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010）；動(dòng)物飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

普洱熟茶（嘜號(hào)7262，批次1801，2018年7月5日生產(chǎn)） 云南西雙版納勐海茶業(yè)有限責(zé)任公司；D-gal美國Sigma-Aldrich公司；0.9%生理鹽水 山東齊都藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水（均為分析純）上海佰曄生物科技中心；L-2-氯苯丙氨酸（色譜純）上海恒柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Vanquish UPLC、Q Exactive HFX QE-MS、Heraeus Fresco17離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius公司；明澈D24 UV純水儀 美國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 普洱熟茶水提物的制備

普洱熟茶→粉碎→過80 目篩→1∶50（m/V）茶水比浸提（10 min/次，5 次）→趁熱過濾→減壓濃縮（（60±1）℃、0.07 MPa）→1 g/mL濃縮液裝瓶滅菌（120 ℃、15 min）→茶湯→低溫冷藏（4 ℃）[12]

普洱熟茶水提物組分中蛋白質(zhì)含量為70.64 g/kg、氨基酸含量為24.86 g/kg、總糖含量為178.34 g/kg、多糖含量為11.28 g/kg、總多酚含量為62.69 g/kg、總黃酮含量為40.61 g/kg[5]。

1.3.2 動(dòng)物分組、建模

將30 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）、D-gal模型組（D-gal）和普洱熟茶組（Pu-erh tea extractions，PTEs），每組各10 只。對(duì)照組頸背部皮下注射10 mL/kgmb0.9%生理鹽水；其他組頸背部皮下注射500 mg/kgmbD-gal溶液，持續(xù)8 周建立小鼠衰老模型。在建模的第9周開始，普洱熟茶組灌胃3 g/kgmb普洱熟茶水提物（根據(jù)日本東京桑野研究所推薦成人每日平均用茶量為6 g[13]，按人體標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg計(jì)算得成人每日推薦用茶量為0.1 g/kgmb。小鼠與人的等效劑量比約為10∶1[13]，即每只小鼠應(yīng)注射劑量為1 g/kgmb普洱熟茶水提物。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[5]，本實(shí)驗(yàn)采用3 g/kgmb普洱熟茶水提物作為灌胃劑量），對(duì)照組和D-gal模型組灌胃等量蒸餾水，持續(xù)8 周。實(shí)驗(yàn)期間小鼠每7 d稱質(zhì)量1 次，按體質(zhì)量變化調(diào)整注射及灌胃劑量。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮實(shí)驗(yàn)于第14周進(jìn)行，為期6 d，前5 d進(jìn)行定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)，第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練3 次，每次訓(xùn)練將小鼠從迷宮入口放入，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，并在水中用綠色棍子指引小鼠尋找迷宮出口，記錄小鼠從進(jìn)入水中到找到迷宮出口所用時(shí)長，即為逃避潛伏期。若小鼠5 min內(nèi)未找到迷宮出口，則記錄本次逃避潛伏期為300 s，并將小鼠引導(dǎo)到出口。第6天空間探索實(shí)驗(yàn)撤去引導(dǎo)物，同樣將小鼠從迷宮入口放入水中，讓小鼠在迷宮中自由尋找出口，同時(shí)記錄其到達(dá)出口所需時(shí)長。

1.3.4 樣本采集及保存

18 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠摘眼球取血，用1.5 mL離心管取小鼠全血，離心管斜面置于冰盒1 h后，3 500 r/min離心5 min，收集血清，－80 ℃凍存待測。取血后，將小鼠脊椎脫臼處死，冰上取出腦組織，用4 ℃生理鹽水沖洗腦組織表面殘血，濾紙吸干水分，液氮速冷，樣品保存于－80 ℃冰箱中待測。

1.3.5 UPLC-QE-MS代謝組學(xué)分析

代謝物提取：稱取50 mg腦組織樣品，加入1 000 μL提取液（V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）＝2∶2∶1，含內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸1 μg/mL），渦旋混勻30 s，35 Hz研磨處理4 min，超聲5 min（冰水浴），重復(fù)步驟3 次，－40 ℃靜置1 h，將樣品4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測。所有樣品另取等量上清液混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品上機(jī)檢測。

UPLC 條件：使用Vanquish UPLC 儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。采用梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9.0～9.1 min，40%～95% B；9.1～12.0 min，95% B。流動(dòng)相流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣體積3 μL。

MS條件：采用Q Exactive HFX MS儀在Xcalibur軟件控制下進(jìn)行MS、MS/MS數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘層氣體流量為30 arb，輔助氣體流量為10 arb，毛細(xì)管溫度為350 ℃，全MS分辨率為60 000，MS/MS分辨率為7 500，NCE模式下碰撞能量為10/30/60 eV，噴霧電壓為4 kV（正離子模式）、3.8 kV（負(fù)離子模式）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，再與BiotreeDB（V2.1）自建MS/MS數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。對(duì)XCMS程序包提取得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用SIMCA 14.1程序進(jìn)行PLS-DA和OPLS-DA，再進(jìn)一步采用單變量統(tǒng)計(jì)分析，得到P值。選擇VIP＞1且P＜0.05的代謝物作為差異代謝物，將得到的差異代謝物數(shù)據(jù)利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

由表1可知，在5 d定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組小鼠逃避潛伏期均縮短。與第1天相比，第5天對(duì)照組、D-gal模型組、普洱熟茶組小鼠逃避潛伏期分別縮短58.42%、50.54%、32.57%。

表1 普洱熟茶對(duì)小鼠在水迷宮中逃避潛伏期的影響Table 1 Effect of ripe Pu-erh tea on the escape latency of mice in water maze

由圖1可知，在第6天空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，D-g a l模型組小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著延長（P＜0.05）；與D-gal模型組相比，普洱熟茶組小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著縮短18.12%（P＜0.05）。結(jié)果表明機(jī)體的衰老會(huì)引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力衰退，給予普洱熟茶能夠提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖1 普洱熟茶對(duì)小鼠在水迷宮中第6天到達(dá)平臺(tái)時(shí)間的影響Fig.1 Effect of ripe Pu-erh tea on the time it took for mice to reach the platform on day 6 in water maze

2.2 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠腦組織代謝物變化的影響

采用PLS-DA法將經(jīng)過預(yù)處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS腦組織代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，結(jié)果表明3 組樣本能夠被明顯區(qū)分，說明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠腦內(nèi)代謝物發(fā)生顯著變化（圖2A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證3 組樣本的分離，并篩選關(guān)鍵代謝物，進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果表明對(duì)照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數(shù)據(jù)模型有較好的擬合度及預(yù)測能力（圖2B、D）。其中對(duì)照組和D-gal模型組＝0.679，＝0.992，Q2＝0.829；D-gal模型組和普洱熟茶組＝0.631，＝0.968，Q2＝0.681。通過置換檢驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，200 次置換檢驗(yàn)后對(duì)照組和D-gal模型組的截距R2＝0.826，Q2＝－0.597（圖2C），D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.924，Q2＝－0.340（圖2E），表明模型有較好的預(yù)測能力與可靠性。

圖2 小鼠腦組織的PLS-DA散點(diǎn)圖、OPLS-DA圖及置換檢驗(yàn)圖Fig.2 PLS-DA and OPLS-DA scatter plots of mouse brain samples and permutation test of OPLS-DA model

為了進(jìn)一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關(guān)差異代謝物，根據(jù)VIP＞1、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，通過KEGG在線數(shù)據(jù)庫篩選鑒定出26 種差異代謝物，主要分為甘油磷脂類、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酰類、核苷等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中18 種代謝物表達(dá)上調(diào)，8 種代謝物表達(dá)下調(diào)（表2）。

表2 普洱熟茶干預(yù)衰老小鼠腦組織的差異代謝產(chǎn)物Table 2 Differential metabolites in the brain tissue of ripe Pu-erh tea-treated mice versus aging mice

2.3 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠血清代謝物變化的影響

采用PLS-DA法將經(jīng)過預(yù)處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS血清代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，結(jié)果表明3 組樣本能夠被明顯區(qū)分，說明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠血清代謝物發(fā)生顯著變化（圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證3 組樣本的分離情況，并篩選關(guān)鍵代謝物，進(jìn)行了OPLS-DA分析，結(jié)果表明對(duì)照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數(shù)據(jù)模型有較好的擬合度及預(yù)測能力（圖3B、D）。其中對(duì)照組和D-gal模型組：＝0.650，＝0.901，Q2＝0.220；D-gal模型組和普洱熟茶組：＝0.583，＝0.980，Q2＝0.735。通過置換檢驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，200 次置換檢驗(yàn)后對(duì)照組和D-gal模型組的截距R2＝0.897，Q2＝－0.370（圖3C），D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.881，Q2＝－0.568（圖3E），表明模型有較好的預(yù)測能力與可靠性。

圖3 小鼠血清的PLS-DA散點(diǎn)圖、OPLS-DA圖及置換檢驗(yàn)圖Fig.3 PLS-DA and OPLS-DA scatter plots of mouse serum samples and permutation test of OPLS-DA model

為了進(jìn)一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關(guān)差異代謝物，根據(jù)VIP＞1、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，通過KEGG在線數(shù)據(jù)庫篩選鑒定出11 種差異代謝物，主要分氨基酸、有機(jī)雜環(huán)化合物、脂肪酸類、植物激素等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中6 種代謝物表達(dá)上調(diào)，5 種代謝物表達(dá)下調(diào)（表3）。

表3 普洱熟茶干預(yù)衰老小鼠血清的差異代謝產(chǎn)物Table 3 Differential metabolites in the serum of aging mice versus ripe Pu-erh tea-treated mice

2.4 差異代謝物的聚類分析

篩選得到的差異代謝物通過層次聚類分析能夠更直觀地顯示樣本之間的關(guān)系以及代謝物在不同樣本中表達(dá)模式上的差異。如圖4所示，根據(jù)上方樣本聚類的樹狀圖，小鼠腦組織樣本可分成兩個(gè)區(qū)域，D-gal模型組的6 個(gè)平行樣本為第一區(qū)域，普洱熟茶組和對(duì)照組為第二區(qū)域，D-gal模型組的代謝物顏色比其他兩組深；第二區(qū)域兩組樣本分支離得越近，說明這兩個(gè)樣本所有代謝物的表達(dá)量變化趨勢越接近。小鼠血清樣本中代謝物能夠明顯區(qū)分為D-gal模型組和其他兩組，但普洱熟茶組和對(duì)照組樣本代謝物的表達(dá)模式極接近，未完全區(qū)分。硫酸膽固醇能夠通過減少氧化應(yīng)激來調(diào)節(jié)腦代謝[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-gal模型組小鼠腦內(nèi)硫酸膽固醇、二磷酸腺苷核糖等代謝物表達(dá)明顯下調(diào)，表明小鼠處于氧化損傷狀態(tài)。肌肽已被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用，其可穿透血腦屏障，降低與多種病理狀況有關(guān)的氧化應(yīng)激[15]。脂類物質(zhì)與體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、老化速度等密切相關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果表明，給予普洱熟茶干預(yù)后，組氨酸代謝通路相關(guān)代謝物肌肽以及PC（15:0/15:0）、PE（22:2/14:0）等甘油磷脂代謝通路相關(guān)代謝物表達(dá)明顯升高（圖4A），提高了衰老小鼠的抗氧化應(yīng)激能力。D-gal模型組小鼠體內(nèi)前列腺素D2、5’-磷酸吡哆醛代謝物表達(dá)明顯下調(diào)，給予普洱熟茶干預(yù)后其表達(dá)明顯上調(diào)（圖4B），表明花生四烯酸代謝通路和VB6代謝通路被顯著激活。

圖4 小鼠腦組織（A）及血清（B）樣本潛在生物標(biāo)志物的聚類熱圖Fig.4 Clustering heatmaps of potential biomarkers for mouse brain (A)and serum (B) samples

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

將篩選出的差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，如圖5A所示，小鼠腦組織中篩選到甘油磷脂代謝、VB6代謝、組氨酸代謝和嘌呤代謝通路，其中甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路最為顯著。如圖5B所示，小鼠血清中篩選到VB6代謝和花生四烯酸代謝通路，其中VB6代謝通路最為顯著。為了更直觀地了解代謝通路映射出的12 個(gè)關(guān)鍵代謝物，采用箱形圖比較3 組間這12 種物質(zhì)的含量豐度差異（圖6）。結(jié)果顯示普洱熟茶能夠延緩小鼠衰老，與D-gal組相比，其腦組織中伴隨著組氨酸代謝通路相關(guān)代謝物肌肽，VB6代謝通路相關(guān)代謝物吡哆醛，甘油磷脂代謝通路相關(guān)代謝物PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、LysoPC（P-18:1）、PE（22:2/14:0）、LysoPC（18:2）、PS（20:5/18:1）、PC（15:0/15:0）以及嘌呤代謝通路相關(guān)代謝物二磷酸腺苷核糖表達(dá)量的顯著上調(diào)；血清中伴隨著花生四烯酸代謝通路相關(guān)代謝物前列腺素D2以及VB6代謝通路相關(guān)代謝物5’-磷酸吡哆醛表達(dá)量的顯著上調(diào)。

圖5 小鼠腦組織（A）和血清（B）樣本潛在生物標(biāo)志物的KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble maps of potential biomarkers for mouse brain (A) and serum (B) samples

圖6 小鼠腦組織和血清樣本潛在生物標(biāo)志物的分布箱形圖Fig.6 Box plots showing the distribution of potential biomarkers for mouse brain and serum samples

3 討 論

本研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了普洱熟茶對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老模型小鼠的干預(yù)作用。在衰老過程中大腦的學(xué)習(xí)與記憶功能極易受損[18]，D-gal衰老模型引發(fā)小鼠學(xué)習(xí)與記憶損傷的機(jī)制可能是體內(nèi)的醛糖還原酶和半乳糖氧化酶等途徑被激活，產(chǎn)生大量活性氧，引起腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的膽堿乙酰化轉(zhuǎn)移酶等蛋白質(zhì)氧化損傷，使乙酰膽堿合成減少，同時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞核進(jìn)行攻擊，使半胱氨酸蛋白酶等凋亡基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，尤其使膽堿能和谷氨酸能神經(jīng)纖維發(fā)生退變[19]。本研究結(jié)果表明D-gal模型組小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著延長，這與肖瀛等[20]的研究結(jié)果一致，說明機(jī)體的衰老會(huì)引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的衰退，衰老模型建立成功；普洱熟茶具有顯著干預(yù)衰老小鼠記憶減退的作用。

磷脂酰膽堿是生物合成乙酰膽堿的重要前體，與機(jī)體自由基的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、老化速度等密切相關(guān)[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)多烯磷脂酰膽堿在一定程度上可以減輕阿爾茨海默癥模型大鼠的行為學(xué)及形態(tài)學(xué)改變，對(duì)其突觸結(jié)構(gòu)的完整性具有一定的保護(hù)作用[23]。本研究中D-gal致衰老小鼠在行為學(xué)中表現(xiàn)出記憶力減退的現(xiàn)象，普洱熟茶組小鼠腦組織中PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）含量顯著提高，磷脂合成的增加可促進(jìn)神經(jīng)突起的生長，增加突觸和樹突觸的數(shù)量，促進(jìn)大腦的學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)[24]。LysoPC是磷脂的降解產(chǎn)物，其含量的異常很大程度上意味著甘油磷脂代謝的紊亂。LysoPC含量隨年齡的增加而減少，提示機(jī)體內(nèi)存在能量代謝障礙和氧化損傷[25]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，D-gal模型組小鼠體內(nèi)LysoPC（P-18:1）、LysoPC（18:2）豐度降低，給予普洱熟茶灌胃后，其在衰老小鼠體內(nèi)的豐度顯著升高，說明普洱熟茶可有效改善D-gal致衰老小鼠機(jī)體內(nèi)的甘油磷脂代謝紊亂。

肌肽對(duì)阿爾茨海默癥、帕金森病、腦卒中等許多老年相關(guān)性疾病均有積極的調(diào)節(jié)作用[26]，可以延緩衰老[27]。Aydin等[28]通過肌肽干預(yù)D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠，證實(shí)肌肽能夠顯著抑制由衰老導(dǎo)致的蛋白質(zhì)羰基含量的增加，這可能與肌肽的抗氧化及抗糖化作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)灌胃普洱熟茶顯著提高了D-gal致衰老小鼠腦組織中肌肽的豐度，表明普洱熟茶能夠有效緩解氧化應(yīng)激，抑制D-gal引起的組氨酸代謝紊亂，恢復(fù)肌肽水平，從而延緩衰老。

V B6是吡哆素一類的總稱，主要以吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺及其磷酸酯衍生物5’-磷酸吡哆醛、5’-磷酸吡哆醇、5’-磷酸吡哆胺6 種形式存在。吡哆醇、吡哆胺和吡哆醛被吸收后可經(jīng)促進(jìn)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞中。吡哆醇和吡哆胺被吡哆醛激酶磷酸化后，肝臟可利用其經(jīng)黃素依賴性酶的作用轉(zhuǎn)化為5’-磷酸吡哆醛，生成的5’-磷酸吡哆醛部分被保留在肝細(xì)胞中，部分則被釋放到血液中與白蛋白緊密結(jié)合[29-30]。5’-磷酸吡哆醛不僅能夠作為輔酶參與人體內(nèi)氨基酸反應(yīng)，還能應(yīng)用于β-羰基酰胺類藥物合成、生物活性研究等領(lǐng)域[31]，如治療帕金森綜合征[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織和血清共有的代謝通路是VB6代謝通路，說明這條通路起關(guān)鍵性作用。D-gal致衰老小鼠腦組織中吡哆醛的豐度和血清中5’-磷酸吡哆醛的豐度均顯著降低，普洱熟茶干預(yù)后其豐度均顯著升高，表明普洱熟茶對(duì)VB6代謝通路有調(diào)控作用，推測小鼠腦組織中的吡哆醛經(jīng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟后生成5’-磷酸吡哆醛，隨后釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中5’-磷酸吡哆醛的豐度改變。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明普洱熟茶的干預(yù)可顯著改善小鼠學(xué)習(xí)記憶減退。本研究基于UPLC-QE-MS代謝組學(xué)方法，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究D-gal致衰老小鼠在普洱熟茶干預(yù)下的腦組織和血清代謝變化，鑒定分析出37 種差異代謝產(chǎn)物。通過差異代謝物和代謝通路相關(guān)性分析，篩選出4 條腦組織代謝通路，甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路為最顯著的關(guān)鍵代謝通路，映射出肌肽、PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、PS（20:5/18:1）等10 個(gè)關(guān)鍵代謝物；篩選出2 條血清代謝通路，VB6代謝通路為最顯著的關(guān)鍵代謝通路，映射出前列腺素D2和5’-磷酸吡哆醛2 個(gè)關(guān)鍵代謝物。這些代謝物可能為延緩衰老的潛在生物標(biāo)志物。未來可進(jìn)行代謝物在體驗(yàn)證，進(jìn)一步解析其在延緩衰老過程中的重要作用。