基于生物信息學分析關鍵miRNAs在肺鱗癌發生發展中的功能及意義

陳利軍 張天明 第伍丹琲 劉蓓莉 王虹

據報道,肺癌的發病率和死亡率非常高[1]。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的病理類型,約占肺癌的85%～90%[2]。肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)是非小細胞肺癌中第二大病理亞型,約占非小細胞肺癌的20%～30%[3]。晚期LUSC患者的5年生存率不到5%,因此早期診斷和預后的有效及特異性生物標志物對LUSC的臨床治療非常重要[4]。miRNA是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA,長度約為21～25個核苷酸[5]。miRNA主要通過與mRNA的3’UTR結合直接降解mRNA或抑制其蛋白翻譯負向調控靶基因表達[6]。miRNA可參與多種生物學過程的調控,如增殖、凋亡、細胞周期及DNA修復等。研究表明,miRNA的異常表達可能與非小細胞肺癌的發生發展密切相關[7]。因此,本研究旨在利用生物信息學方法探究關鍵miRNAs在肺鱗癌發生發展中的功能及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 miRNA芯片數據來源 芯片數據通過美國國家生物信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得,篩選到GSE17681數據集進行后續分析,該數據集包含36個樣本,其中肺癌樣本17例,對照樣本19例,芯片平臺是GPL9040 (febit Homo Sapiens miRBase 13.0),種屬為Homo sapiens。

1.2 差異miRNA篩選 利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geO2r/acc=GSE17681)在線分析工具對GSE17681數據集中肺癌樣本和對照樣本的miRNA表達進行差異分析,利用SangerBox軟件繪制火山圖,對原始數據進行去重等處理后,按照|logFC|>2,P<0.05的條件篩選出差異miRNAs。

1.3 差異miRNA靶基因預測 利用miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)[8]數據庫分別對排在前3位的上調miRNA和下調miRNA的靶基因進行預測。

1.4 靶基因GO和KEGG富集分析 利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對預測的靶基因進行富集分析,包括基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。

1.5 蛋白互作網絡及miRNA-基因互作網絡的構建與分析 利用STRING(https://string-db.org/)[10]數據庫構建靶基因間的蛋白互作網絡(protein-protein interaction,PPI)及miRNA-基因互作網絡,以TSV格式導出結果,然后導入Cytoscape(版本3.6.0)進行交互分析,利用插件cytoHubba分析(MCC算法)關鍵miRNA及其調控的Hub靶基因。

1.6 關鍵miRNA及其調控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)[11]數據庫對關鍵miRNA及其調控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達情況進行分析。

1.7 關鍵miRNA在肺鱗癌中的表達情況與預后分析 利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background)[12]工具對差異表達的關鍵miRNA對肺鱗癌生存狀況的影響進行分析。

1.8 統計學分析 應用SPSS 20.0統計軟件,計量資料不符合正態分布采用中位數(下四分位數,上四分位數)表示,2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異miRNA篩選及靶基因預測結果 通過對GSE17681數據集分析,共篩選出116個差異表達的miRNA,其中表達上調的miRNA有93個,表達下調的miRNA有23個。根據logFC值,排在前3位的上調miRNA分別是hsa-miR-19a、hsa-miR-210、hsa-miR-339-5p,預測的靶基因共1 040個;排在前3位的下調miRNA分別是hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-126、hsa-miR-1283,預測的靶基因共285個。見圖1。

圖1 差異表達miRNA火山圖;紅色為上調的miRNA,綠色為下調的miRNA

2.2 靶基因GO和KEGG富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示,差異表達miRNA靶基因的生物學過程(biological process,BP)主要涉及轉錄調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、信號轉導、凋亡過程、細胞增殖等;細胞組分(cellular component,CC)主要涉及核、細胞質、胞質溶膠、核質、細胞外泌體、細胞器等;分子功能(molecular function,MF)主要涉及蛋白質結合、金屬離子結合、DNA結合、RNA結合、ATP結合、轉錄因子活性等。KEGG通路富集分析結果顯示,差異表達miRNA靶基因主要涉及癌癥途徑、HTLV-I感染、MAPK信號通路、胞吞作用、Rap1信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路等。見表1、2。

表1 差異表達miRNA靶基因GO功能富集分析結果

表2 差異表達miRNA靶基因KEGG通路富集分析結果

2.3 蛋白互作網絡及miRNA-基因互作網絡分析結果 利用STRING數據庫分別構建了前3位上調和下調miRNA靶基因的PPI網絡。然后利用Cytoscape軟件的cytoHubba插件篩選到上調miRNA前10位Hub靶基因為TP53、AKT1、MYC、PTEN、MAPK1、CCND1、ESR1、TNF、MDM2、ACTB,下調miRNA前10位Hub靶基因為MYC、VEGFA、MAPK8、FGF2、SOD2、PKM、TFRC、SOCS3、FOXO3、HNRNPDL。再利用Cytoscape軟件構建miRNA-基因互作網絡,篩選到調控Hub靶基因最多的上調關鍵miRNA為hsa-miR-19a、下調關鍵miRNA為hsa-miR-126。hsa-miR-19a、hsa-miR-126調控的Hub靶基因分別為TNF、PTEN、MAPK1、ESR1、CCND1、AKT1、ACTB、TP53、VEGFA和TFRC、SOCS3、MYC、MAPK8、HNRNPDL、FOXO3。見圖2。

圖2 靶基因PPI圖及miRNA-基因互作網絡圖;A miRNA-基因互作網絡圖,紅色圓點為上調miRNA,藍色圓點為下調miRNA,黃色圓點為靶基因;B 上調miRNA前10位Hub靶基因PPI圖,圓點顏色越深基因排序越前;C 下調miRNA前10位Hub靶基因PPI圖,圓點顏色越深基因排序越前

2.4 關鍵miRNA調控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達分析結果 將hsa-miR-19a、hsa-miR-126 兩個關鍵miRNA調控的Hub靶基因在UALCAN數據庫肺鱗癌中的表達進行分析。與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a調控的Hub靶基因PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB表達降低,TP53、VEGFA表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);肺鱗癌組hsa-miR-126調控的Hub靶基因SOCS3、FOXO3表達降低,TFRC、MYC、MAPK8表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 關鍵miRNA調控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達 M(P25,P75)

2.5 關鍵miRNA在肺鱗癌中的表達情況與預后分析結果 將hsa-miR-19a、hsa-miR-126 兩個關鍵miRNA在UALCAN數據庫肺鱗癌中的表達進行分析。與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a表達升高,hsa-miR-126表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。Kaplan-Meier Plotter分析結果示,肺鱗癌中hsa-miR-19a高表達組總體生存期高于低表達組,hsa-miR-126高表達組總體生存期低于低表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3,表4。

表4 關鍵miRNA在肺鱗癌中的表達情況 M(P25,P75)

圖3 關鍵miRNA生存分析;A hsa-miR-19a高表達在肺鱗癌中的生存曲線;B hsa-miR-126高表達在肺鱗癌中的生存曲線

3 討論

非小細胞肺癌是肺癌的主要病理類型,早期不易診斷,一經確診疾病已進入晚期,多數患者已失去手術治療機會而采取化療,但是化療耐藥等使得患者治療效果往往不佳,患者的5年生存率較低[13,14]。因此尋找生物標志物及治療靶點對肺癌患者的早期診斷、治療及預后有重要意義。研究表明,miRNA是一組內源性非編碼小RNA,與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關[15]。

本研究通過對GEO數據庫GSE17681數據集中肺癌樣本和正常樣本進行分析,篩選出116個差異表達的miRNA,然后對排在前3位的上調和下調miRNA的靶基因進行了預測。GO和KEGG富集分析結果發現靶基因的生物學過程主要涉及轉錄調控、信號轉導、凋亡過程、細胞增殖等,靶基因主要富集在MAPK信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路等。通過構建PPI網絡及miRNA-基因交互網絡,分別篩選出上調miRNA和下調miRNA的前10位Hub靶基因,并得到調控這些Hub靶基因最多的關鍵上調和下調miRNA分別是hsa-miR-19a和hsa-miR-126。UALCAN數據庫肺鱗癌中的驗證表達結果發現與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a表達升高,hsa-miR-126表達降低。研究表明,miR-19a是miR-19家族研究最多的致癌miRNA,其主要通過抑制細胞凋亡及抑癌磷酸酶和張力蛋白同源物發揮致癌活性,也可誘導腫瘤細胞對化學治療藥物產生抗性而導致化療失敗[16]。hsa-miR-126是一類腫瘤抑制因子,能抑制腫瘤的增殖、遷移及血管發生[17]。Jiao等[18]研究發現,hsa-miR-126在非小細胞肺癌中顯著下調,其下調與hsa-miR-126基因上游啟動子 CpG 島超甲基化有關。

肺鱗癌組hsa-miR-19a調控的Hub靶基因PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB表達降低,TP53、VEGFA表達升高;肺鱗癌組hsa-miR-126調控的Hub靶基因SOCS3、FOXO3表達降低,TFRC、MYC、MAPK8表達升高。這些結果表明hsa-miR-19a、hsa-miR-126在肺鱗癌的發生發展中可能通過靶向調控上述基因發揮作用。此外,hsa-miR-19a高表達及hsa-miR-126低表達均與肺腺癌較長的總體生存率有關。研究表明,miRNA-19a過表達與肺癌的病理生理有關[19],并且與肺癌細胞的預后、轉移及增殖有關。Pan等[20]研究發現在非小細胞肺癌細胞系中miR-19a-3p的上調顯著抑制了細胞增殖、遷移和侵襲,并通過下調UBAP2L的表達而發揮抑癌作用。Liu等[21]研究發現miR-126-3p可能通過靶向調控CCR1基因來抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Sun等[22]報道miR-126高表達與非小細胞肺癌的較高總體生存率呈正相關。

綜上所述,本研究證實了hsa-miR-19a、hsa-miR-126在肺鱗癌組織中表達異常,是肺鱗癌發生發展中的關鍵miRNAs,可能通過靶向調控PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB、TP53、VEGFA、SOCS3、FOXO3、TFRC、MYC、MAPK8等Hub基因發揮作用,并與肺鱗癌的總體整存率有關。因此,hsa-miR-19a、hsa-miR-126可能作為肺鱗癌早期診斷和預后的有效生物標志物。