針灸干預呼吸機相關性肺炎模型大鼠及NETs機制的研究*

黃 杰 張巧梅 鄧揚嘉

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410036；2.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；3.重慶市中醫院，重慶 400011）

呼吸機相關性肺炎（VAP）指氣管插管或氣管切開患者接受機械通氣48 h 后發生的肺炎，是導致患者脫機困難、住院時間延長、治療費用增加的疾病［1-2］。研究發現：NETs 水平可作為反映肺組織損傷的重要指標［1-3］；腸源性感染患者感染狀態可用NETs 水平來反映［1］。故我們推測，同樣屬于感染性疾病的VAP，NETs可能參與其發病機制。

針灸通過穴位刺激，具有疏通經絡、扶正祛邪等作用［2］。艾灸通過溫熱刺激，激活穴位局部的熱敏感免疫細胞、特異感受器等，達到溫通溫補的作用［3］。劉兵等提出針灸介入防治COVID-19 的可行性與可靠性，并提出了獨特“針灸方案”［4］。研究發現在常規治療基礎上溫和灸治療呼吸機相關性肺炎的療效顯著，可減輕肺部感染［5］。本研究利用VAP 模型大鼠，初步探索針灸減少VAP 模型大鼠炎性反應的作用機制，為深入研究針灸、NETs抑制劑預防和治療VAP患者的可能機制提供科學依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級成年雄性健康大鼠，體質量（300±10）g，由成都藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2020-034。SD 大鼠自購回后保持其自由飲水、進食，溫度21～25 ℃，適應性喂養1 周后進入實驗。實驗設計經重慶威斯騰生物實驗動物福利倫理委員會審議同意并批準。

1.2 試藥與儀器

NETs 抑制劑（鹽酸尼索西汀）。大鼠CITH3 酶聯吸附測定試劑盒：江萊生物（中國，JL47058）。MPO 比色法測試盒：伊萊瑞特，武漢（CAT：E-BC-K074-M）。Sytox Green：美國Thermo Fisher（S7020）。PBS：上海生工，中國（B040100）。RPMI-1640 培養基：美國Gibco（A4192301）。一次性毫針（華佗牌，0.25 mm×25 mm），艾條（南陽市漢艾艾制品有限公司）。小動物呼吸機：安徽正華生物儀器設備有限公司（DW-3000 型）。酶聯免疫檢測儀：美國Thermo Fisher。低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。顯微外科手術器械包：上海手術器械廠（SSW-3型）。

1.3 分組與造模

將80 只成年雄性健康SD 大鼠分為對照組、模型組、針灸組、針灸+NETs 抑制劑組，每組20 只。20%烏拉坦腹腔注射麻醉，取仰臥位，使用喉鏡將氣管導管插入聲門，通過聽雙肺呼吸音確定導管插在氣管內，于大鼠口腔行氣管插管后接小動物呼吸機，呼吸機參數設定為：潮氣量（V）12 mL/kg，呼吸頻率70次/min，吸入氧濃度（FiO2）1.0。連續通氣48 h后，5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，豎起固定板＞45°，以微量注射器經氣管導管注入0.2 mL 3×108cfu/L 銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55 mL 氣體，并保持體位5 min。經氣管注入PA 菌液6 h 后，檢測大鼠肺組織病理變化呈小葉性肺炎特征，肺泡灌洗液和肺組織中的PA 細菌培養陽性［6］，以確保成功誘導出大鼠VAP模型。

1.4 針灸及給藥方法

針灸組、針灸+NETs 抑制劑組取大鼠穴位定位參考《實驗動物常用穴位名稱與定位》第2 部分：大鼠［7］。肺俞：第3 胸椎下兩旁肋間，背正中線旁開6 mm。大椎：第7 頸椎與第1 胸椎間，背部正中。風門：第2 胸椎下兩旁肋間，背正中線旁開6 mm。大椎直刺5 mm，肺俞、風門各斜刺6 mm，留針30 min，運用平補平瀉手法每10分鐘行針1次，每日2次，共7次；針刺治療結束后將點燃的艾條，距相同穴位皮膚表面2 cm 處施溫和灸，施灸15 min，每日2 次，共7 次。針灸+NETs 抑制劑組按體質量0.8 μmol/L/290～340 g 的劑量鞘內注射NETs抑制劑。

1.5 標本采集與檢測

麻醉狀態下腹主動脈采血，放于無抗凝管中靜置1～2 h 后離心（3 000 r/min，20 min，4 ℃），吸取上層血清-20 ℃保存用于ELISA 檢測。采用經預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）進行大鼠肺泡灌洗，收集灌洗液，離心后置于-20 ℃保存用于ELISA檢測。

1.5.1 激光共聚焦檢測大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達差異 佛波酯（PMA）誘導NETs形成：1）將細胞接種于培養孔板爬片中，加入PMA使其終濃度為300 ng/mL，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養3 h；2）孵育結束后，加入Sytox Green 和Hochest 混合染色液37 ℃染色5～10 min；3）染色結束后用PBS 清洗1 次，用4%多聚甲醛室溫固定10 min；4）固定結束后用PBS 清洗1 次，加入封片劑進行封片，共聚焦觀察。

1.5.2 ELISA 檢測大鼠H3 表達 從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃。設置標準孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。樣本孔中加入待測樣本50 μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL，空白孔，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，用封板模封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μL），靜置1 min，吸水紙上拍干，重復洗板5 次。每孔加入底物A、B 各50 μL，15 min 內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.5.3 MPO 測定 1）對照管：取350 μL 雙蒸水、20 μL待測樣本、20 μL試劑五（澄清劑）加入1.5 mL EP管中。測定管：取20 μL待測樣本、20 μL試劑五，350 μL顯色劑加入1.5 mL EP 管中。2）渦旋混勻3 s，37 ℃準確反應30 min。3）向2）中各管加入5 μL試劑八（酸試劑），渦旋混勻3 s，60 ℃水浴10 min。4）取出后，3 000×g，離心10 min。5）取300 μL 上清液于酶標板中，酶標儀460 nm處，測定各孔OD值。

1.5.4 H3 的測定 繪制標準物和OD 值的回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。參照文獻［8］測定MPO。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達差異

見圖1。激光共聚焦顯微鏡下，中性粒細胞在接受PMA刺激4 h后，產生大量綠色細胞外網絡結構，從顯微結構和組成成分上可鑒定為NETs（圖中紅色虛線處）。VAP 大鼠模型外周血和肺泡灌洗液中均存在NETs，外周血中明顯高于肺泡灌洗液中，在4組的分布中，模型組＞針灸組＞針灸+NETs抑制劑組＞對照組。

圖1 各組大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達（400倍）

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液中H3、血清中H3水平比較

見表1。與對照組比較，模型組、針灸組、針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3 表達均明顯增高（P＜0.05）。與模型組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3 表達明顯降低（P＜0.05），針灸組肺泡灌洗液、血清中H3 表達相近（P＞0.05）。與針灸組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3表達明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液、血清H3、MPO比較

2.3 各組肺泡灌洗液中MPO、血清中MPO比較

見表1。對照組比較，模型組、針灸組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達均明顯增高（P＜0.05），針灸+NETs抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，針灸組、針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達均明顯降低（P＜0.05）。與針灸組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

ICU 中患者常需要接受機械通氣治療，其可以有效糾正患者呼吸功能障礙，改善患者肺部通氣量，是ICU救治工作中重要組成部分，但患者較易發生VAP［9-10］。而對于VAP 治療主要是使用抗生素為主的綜合治療，隨著多重耐藥細菌的產生，其治療難度增加。Castanheira FVS 研究發現當炎癥反復發生或刺激物持續存在時，過度的NETs 會造成組織損傷［11］。研究發現，NETs 參與急性呼吸窘迫綜合征患者肺損傷的形成機制［12］。Fousert E 等提出NETs 過量產生或清除不及時可參與多種炎癥性疾病的發病過程［13］。VAP 脫機困難的一個重要原因即炎癥反復發作、抗生素反復使用致抗感染無效，進而發展成急性肺損傷，因此，我們推測，對于炎癥反復的VAP，NETs 也參與其發病機制。所以如何減少過度的NETs 是治療包括VAP 在內的炎性疾病的一種新的研究方向。

中醫學尚無關于VAP 的病名診斷，但根據其癥狀，可歸屬于“咳嗽”“發熱”等范疇。《黃帝內經》云“正氣存內，邪不可干”，需機械通氣的患者往往因久病導致其正氣虧虛，御邪無力，邪毒乘虛而入，肺失清肅；肺主宣降，通調水道，肺失清肅則水道不通，積聚成痰，痰郁而化熱，痰熱互結，壅閉于肺，患者主要以發熱、咳嗽、氣促等為臨床表現［14］。

基于以上實驗結果及NETs 在VAP 模型大鼠的可能機制，我們使用了針灸和NETs 抑制劑兩種方式對VAP模型大鼠進行干預。本研究針灸選穴肺腧屬足太陽膀胱經，刺之可補益肺臟，止咳平喘，起到扶正之功；大椎屬督脈，為手足三陽經與督脈的交會穴，被稱為“諸陽之會”，統攝一身之陽，是邵老治療肺系病的要穴［15］，刺之可清瀉肺熱，起到祛邪之用，兩個穴位相互配合，共奏扶正祛邪之效；風門屬足太陽膀胱經，為風邪出入之門戶，搜風要穴，主治感冒、咳嗽、發熱等外感病癥、肺系病癥，刺之可疏風解表、宣肺平喘［16］，以上諸穴相互配合，增強VAP 患者正氣，使外邪不再侵入的同時祛除體內毒邪。

本研究發現NETs 確實存在于VAP 模型大鼠中，并且導致模型大鼠炎癥惡化。本研究中模型組和針灸組，模型組和針灸+NETs抑制劑組的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平存在明顯差異，而針刺組和針灸+NETs 抑制劑組的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平表達相近，故我們推測針灸對于減少肺泡灌洗液、血清中MPO 水平優于NETs 抑制劑；而針灸減少VAP 模型大鼠的NETs的機制可能是通過降低其肺泡灌洗液、血清中MPO 水平來實現的。模型組和針灸+NETs抑制劑組的肺泡灌洗液中H3、MPO 水平、血清中H3、MPO 水平均存在明顯差異，故我們推測針灸+NETs 抑制劑協同減少模型大鼠NETs的表達，其機制可能是通過降低肺泡灌洗液及血清中MPO、H3的水平來實現的，其中，尤以肺泡灌洗液及血清中MPO水平為著。

本研究的局限和展望：1）盡管鹽酸尼索西汀溶液可有效降低NETs的水平，但使用轉基因動物可以進一步增加研究結果的可信度。2）本研究模型組和針灸組肺泡灌洗液及血清中H3水平無明顯差異，而杜沂嵐等發現經肺腧穴中藥離子導入聯合振動排痰干預慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者療效確切［17］。有研究報道電針足三里穴預處理可誘導大鼠對肺損傷的耐受性［18］，可以顯著減輕大鼠肺組織損傷程度，同時抑制肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-β）的表達［19］，下一步研究有望通過在針灸的基礎上配合腧穴中藥離子導入及電針治療，可能會得出更多陽性結果，進一步降低VAP 大鼠NETs 水平，豐富VAP 的治療方式。3）劉芬等通過提取大鼠肺組織胞外囊泡（Ti-EVs）后發現，Ti-EVs 組肺內NETs 熒光強度較膿毒癥組明顯增加，Ti-EVs 加重肺內炎癥反應，促進NETs 形成［20］。這可能提示減少Ti-EVs 也會減少NETs 的形成，進而減輕炎癥反應，對于同樣存在NETs 的VAP，Ti-EVs 可能也存在于其發病機制中，下一步研究可以嘗試減少Ti-EVs 的形成，進一步探索預防和治療VAP的新方法。