單質硫抑制水稻植株甲基汞累積的效應與機制

黃英梅，鐘松雄，朱憶雯，王向琴，李芳柏

1. 中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 廣東省科學院生態環境與土壤研究所/廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州510650

汞（mercury，Hg）是一類毒性很強的重金屬污染物，人類活動包括化石燃料的燃燒、有色金屬的冶煉、燒堿的制造、汞礦的干餾和水泥工業是土壤中汞污染的主要來源（Feng et al.，2008a；Wang et al.，2012；Natasha et al.，2020；Liu et al.，2022）。最新全國土壤質量調查結果顯示，大約1.6%的農用地土壤汞超過了II 類標準（總汞（total Hg，THg）質量分數為0.3－1.0 mg·kg?1，因此我國土壤汞污染問題十分嚴峻（Zhao et al.，2015a）。研究發現，在淹水的稻田土壤中，在包含hgcAB的微生物群落，如硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）、鐵還原菌（iron-reducing bacteria，FeRB）和產甲烷菌的驅動下， 無機汞可轉化為甲基汞（methylmercury，MeHg）（Gilmour et al.，2013；Parks Jerry et al.，2013；Liu et al.，2014）。甲基汞是一種神經毒素，可以積累在水稻籽粒中并通過水稻攝取威脅人類的健康（Feng et al.，2008b），例如1956 年日本發生的水俁病和1971 年伊拉克因食用受甲基汞污染的小麥導致的甲基汞中毒等可怕的歷史性甲基汞污染事件（Man et al.，2021）。受甲基汞污染的水稻植株不僅存在于汞礦區，也存在于化工廠、燃煤電廠、冶煉廠和氯堿廠附近的稻田中（Zhao et al.，2020）。在中國，汞污染地區的當地居民日常暴露甲基汞的來源中，水稻攝取這一途徑占94%－96%（Zhang et al.，2010），并且由于農作物全球化，遠離汞污染地區的居民也會由于水稻攝取暴露于甲基汞的風險下（Liu et al.，2019）。據報道，在貴州省萬山汞礦區，水稻甲基汞質量分數均值高達140 μg·kg?1（Horvat et al.，2003），即使在廢棄的汞礦附近，水稻中可食用部分甲基汞質量分數均值也高于100 μg·kg?1（Qiu et al.，2008）。因此，探明稻田土壤-水稻體系中甲基汞的吸收轉運機制，可為稻田土壤汞污染定向控制提供理論依據。

硫（Sulfur）是一種重要的營養元素，有益于植物的生長發育（Yuan et al.，2021）。植物硫不足時也會影響葉綠素的生成和蛋白質的合成，導致作物產量和品質的降低（Singh et al.，2011；Yuan et al.，2021）。研究發現，單質硫可以有效緩解稻田土壤汞污染（Li et al.，2017；Yuan et al.，2021），同時還可以降低水稻中總汞和甲基汞的累積（Rothenberg et al.，2016）。硫可以提高水稻根系中植物螯合肽（phytochelatins，PCs）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）和非蛋白類硫醇（nonprotein thiols，NPTs）等硫醇分子的合成（Li et al.，2017），這些硫醇分子對重金屬有很高的親和力，可以抑制重金屬向水稻地上部的轉運（Li et al.，2017）。與硫的其他形態相比，單質硫（elemental sulfur，S(0)）具有更高的效率、更緩慢的釋放速度以及更低廉的價格，因此單質硫在農業生產中經常被用作肥料來解決硫不足的問題（Zhao et al.，2015b；Mattiello et al.，2017）。另一方面，在新汞沉積的汞污染土壤中添加單質硫不僅可以通過促進Hg(II)-硫醇復合物（RS-Hg-SR）向硫化汞（HgS）的轉化，降低汞在根際土中的移動性（Li et al.，2017），還可以促進水稻根表鐵膜的形成，有助于降低總汞和和甲基汞在水稻籽粒的累積（Hu et al.，2007；Li et al.，2017）。然而，在以HgS 為主要形態的汞污染土壤中添加單質硫，則會增加水稻中甲基汞的累積，并通過促進HgS 向有機結合態的汞（如Hg(GS)2）或氯化汞（HgCl2）增加汞的移動性（Li et al.，2019），這種不一致的情況可能是土壤類型不同所致。

然而，當前的研究主要集中在單質硫降低水稻甲基汞累積效應方面，缺乏單質硫對甲基汞在土壤-水稻體系中遷移轉運機制影響的研究。據此，本研究通過土壤盆栽實驗，研究了單質硫（100 mg·kg?1）對汞污染土壤甲基汞質量分數、水稻植株的生長以及甲基汞吸收轉運的影響，進一步闡明了單質硫對土壤-水稻體系抵御重金屬脅迫的關鍵作用，有助于制定稻田汞污染修復策略。

1 材料和方法

1.1 供試土壤和水稻

盆栽試驗用土為貴州省貴陽市萬山汞礦周邊汞污染稻田表層土壤（ 27°32′57.52″N ，109°12′47.38″E）。土壤的總汞和甲基汞的質量分數分別為 (40.3±0.950) mg·kg?1和 (7.35±1.48) μg·kg?1。土壤酸堿度（pH）、陽離子交換力（cation exchange capacity，CEC）、總碳、有機質和總硫分別為(7.33±0.20)、(26.0±0.10) cmol·kg?1、2.82%±0.02%、(31.5±2.40) g·kg?1和 (1.62±0.01) g·kg?1。供試水稻品種為日本晴（Nipponbare，Oryza sativaL.japonica）。

1.2 盆栽試驗與樣品采集

土壤經自然風干、去除雜物、碾碎并過0.85 mm 篩網，后用于盆栽試驗。在先前的研究中，為了探究汞污染土壤中添加單質硫對水稻汞的累積和分配的影響，設置了0、50、100、500 mg·kg?1單質硫處理組進行探究。研究發現，低劑量的硫處理可以同時降低水稻中總汞和甲基汞的累積，同時發現，100 mg·kg?1單質硫處理比50 mg·kg?1單質硫處理下水稻根部總汞和甲基汞質量分數下降更明顯（Li et al.，2017）。前期研究發現，單質硫處理可能有利于水稻根部對汞的固定，因此，以100 mg·kg?1為單質硫的處理濃度。本研究共設計對照（Control）和單質硫（Sulfur，100 mg·kg?1）2 個處理組，每個處理設置3 個重復。每盆裝7 kg土壤，將單質硫與土壤混勻，淹水自然老化1 周后每盆栽種4 株水稻苗，整個生育期保持3 cm 深上覆水。在水稻成熟期（第105 天），采集整株水稻，并將水稻植株分為根、莖、葉、籽粒，同時收集水稻根際土壤樣品，并將其分成兩份，一份快速冷凍于?80 ℃超低溫冰箱保存以備微生物分析，另一份與植物樣品一起進行冷凍干燥（?78 ℃，10 Pa）（Alpha 2-4 LD plus，Christ，Germany）。隨后，對土壤樣品進行研磨，對干燥后的植物樣品進行稱質量、粉碎后過0.075 mm 篩網，轉入自封袋中備用。

1.3 生長參數和理化指標分析

使用便攜式多參數數字分析儀（HQ40d；Hach，Loveland，Colorado，USA）原位測定土壤Eh 和pH，使用刻度尺測量水稻株高，使用便攜式葉綠素熒光分析儀（SPAD-502 Plus CHLOROPHYLL METER）（Konica Minolta (China) Investment Co.，Ltd.，Shanghai）測量水稻第1 葉的相對葉綠素水平。使用離子色譜檢測SO42?（ICS-600，Thermo Fisher，USA）（Ontiveros-Valencia et al.，2012；Shu et al.，2016）；使用總有機碳分析儀（Shimadzu，Japan）檢測土壤中溶解性有機碳（dissolved organic carbon，DOC）（Chen et al.，2018；Zhang et al.，2023）；使用(NH4)2S2O3試劑（0.013 5 mol·L?1，Sigma-Aldrich，USA）提取土壤中生物可利用的MeHg（Zhu et al.，2015），并分別利用CuSO4-methanol 試劑和KOH 溶劑提取土壤和植物樣品中的MeHg（Man et al.，2021），隨后將提取液中的MeHg 經過二氯甲烷萃取、超純水反萃取、乙基化、捕集后，利用氣相色譜冷蒸汽原子熒光（GCCVAFS，Brooks Rand model III，Seattle，USA）進行測量（USEPA，1998）。為進行質量控制，加入標準物質CC580（河口沉積物）和TORT-3（龍蝦肝胰腺）與土壤和植物樣品同時進行提取，MeHg 回收率分別為103%－131%和117%－129%（n=3）。重復樣品的數據標準差（standard deviation，SD）在7%范圍內，分析空白中MeHg 質量濃度低于1.55 ng L?1。

MeHg 生物富集因子B：

式中：

w(rice)——水稻MeHg 平均質量分數；

w(soil)——土壤MeHg 質量分數（Pandey et al.，2016；Shu et al.，2016；Buscaroli，2017）。

MeHg 轉運系數T：

式中：

w(stem/leaf/grain)——水稻莖/葉/籽粒中MeHg 質量分數；

w(root/stem/leaf)——水稻根/莖/葉中MeHg 質量分數（Man et al.，2021）。

1.4 土壤微生物DNA 的提取和功能基因的定量檢測

準確稱量0.25 g 冷凍的土壤樣品，用DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN Inc.，USA）進行土壤微生物DNA 的提取，隨后對編碼異化亞硫酸鹽還原酶（dsr，dissimilatory sulfite reductase）dsrA、dsrB基因進行絕對定量（Dranguet et al.，2017；Zhou et al.，2020）。實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）反應體系為25 μL，2 種基因引物（表1）和qRT-PCR 反應條件參考先前報道（Zhou et al.，2020），使用CFX 384 real-Time PCR Detection System（BioRad，USA）進行擴增反應，根據濃度和閾值形成標準曲線，擴增效率為90%－115%。

表1 實時熒光定量PCR 所用引物序列與擴增條件Table 1 Lists of primer pairs and thermal cycling parameters for qRT-PCR

1.5 統計分析

根據3個生物學重復計算數據的平均值和標準差，采用SPSS 18.0 統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗分析比較每個參數在各個處理間差異顯著性，使用SigmaPlot 14.0 軟件（Systat Software, Inc.）對試驗結果進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 單質硫對土壤和(NH4)2S2O3 提取態中甲基汞（MeHg）質量分數的影響

由圖1 可知，對照土壤中MeHg 質量分數為8.21 μg·kg?1，添加單質硫處理后，土壤中MeHg 質量分數顯著下降11.6%（P<0.01）。先前的研究發現，土壤中單質硫可以被還原為硫化物S2?，其可以與Hg 結合形成穩定的、不溶的HgS，難以被微生物利用，抑制汞的甲基化過程，導致MeHg 質量分數的下降（Li et al.，2017）。(NH4)2S2O3提取態MeHg 水平可以指示稻田土壤中可被植物吸收利用的MeHg 的水平（Shu et al.，2016）。如圖1所示，對照土壤中(NH4)2S2O3提取態MeHg 質量分數為 0.017 6 μg·kg?1，單質硫處理組土壤中(NH4)2S2O3提取態MeHg 質量分數降低至0.013 8 μg·kg?1，顯著下降了21.8%（P<0.05）。這表明單質硫可以顯著降低土壤中和可被植物所利用的MeHg 質量分數，從而降低土壤中MeHg 被水稻吸收的幾率。

圖1 對照和單質硫（100 mg?kg?1）處理組土壤和(NH4)2S2O3提取態甲基汞質量分數Figure 1 MeHg contents in soils and (NH4)2S2O3 extract in control and S(0) (100 mg?kg?1) treatments

2.2 單質硫對土壤性質的影響

施加單質硫，對土壤理化性質有顯著影響。相比對照組，單質硫處理組中土壤Eh、pH 均下降（圖2a、b），而DOC 質量分數顯著提高10.0%（P<0.01）（圖2c）。DOC 質量分數的提高與硫的氧化還原有關，該過程抑制DOC 的還原降解（Wang et al.，2020）。對照土壤中SO42?質量分數為27.0 mg·kg?1，單質硫處理組土壤SO42?的質量分數顯著提高到60.3 mg·kg?1（提高124%，P<0.01）（圖2d）。此外，qRT-PCR 結果顯示，單質硫處理組中dsrA和dsrB基因拷貝數相比于對照組分別提高80.8%（P<0.01）和28.1%（P<0.05）（圖2e）。dsrA和dsrB基因編碼異化亞硫酸鹽還原酶，它可以在硫酸鹽還原過程中催化亞硫酸鹽轉化為硫化物，因此可作為硫酸鹽還原菌的標志（Gao et al.，2022）。硫酸鹽還原菌具有雙重效應，即在甲基汞的產生和去甲基化過程中起重要作用（Zhou et al.，2020）。具體而言，一方面，淹水稻田土壤形成的厭氧環境有利于硫酸鹽還原菌、鐵還原菌、產甲烷菌等包含hgcAB的微生物群落驅動無機汞的甲基化過程（Gilmour et al.，2013；Parks Jerry et al.，2013；Liu et al.，2014），導致水稻中MeHg 的大量累積（Zhang et al.，2010），另一方面，稻田土壤中也同時發生MeHg 的去甲基化過程（Zhou et al.，2020），在相對較低的Hg 濃度下，硫酸鹽還原菌、產甲烷菌和好氧甲烷氧化菌驅動了氧化去甲基化過程（Oremland Ronald et al.，1991；Kronberg et al.，2018）。因此，結果表明單質硫處理提高了土壤中SO42?的質量分數，刺激了硫酸鹽還原菌的活性，而硫酸鹽還原菌可能在參與汞甲基化過程的同時，參與了去甲基化過程，在一定程度上促進了MeHg 的降解，進而影響土壤中MeHg 質量分數，但具體的機制需要進一步研究。

圖2 對照和單質硫（100 mg·kg?1）處理組土壤理化性質和功能基因拷貝數的檢測Figure 2 Determination of physicochemical properties and functional gene copies of soils in control and S(0) (100 mg?kg?1) treatments

2.3 單質硫對水稻植株生長的影響

與對照相比，單質硫處理組中水稻株高顯著增加（P<0.05）（圖3a），水稻根、莖、葉和籽粒的生物量分別提高26.8%、64.7%（P<0.01）、40.0%和40.4%（P<0.01）（圖3b）。相似地，有研究發現，在汞污染的水培液中添加單質硫（100 mg·L?1）可以提高水稻植株的株高、根長和鮮物質質量（Huang et al.，2024），并且發現添加硫也能改善汞脅迫下生菜和歐洲油菜的生長（Najafi et al.，2020；Yuan et al.，2021）。與對照相比，單質硫處理組中水稻葉片的相對葉綠素水平（SPAD）顯著提高27.4%（P<0.01）（圖3c），表明汞脅迫下添加單質硫可以促進水稻植株的光合作用能力，促進植株的生長。亦有研究發現，植物缺硫會導致水稻光合作用器官合成葉綠素的水平急劇下降（Lunde et al.，2008），這進一步證實單質硫在汞污染稻田土壤-水稻體系中具有促進水稻生長的作用。

圖3 對照和單質硫（100 mg?kg?1）處理組水稻生長指標的檢測Figure 3 Determination of rice growth parameters in control and S(0) (100 mg?kg?1) treatments

2.4 單質硫對植株中甲基汞質量分數的影響

對照組中整株水稻和籽粒中MeHg 質量分數分別為16.9 μg·kg?1和39.2 μg·kg?1，而單質硫處理組中整株水稻和籽粒中MeHg 質量分數分別下降至13.9 μg·kg?1和33.5 μg·kg?1，下降率為17.8%（P<0.01）和14.7%（P<0.05）（圖4a）。與對照組相比，單質硫處理組中水稻葉片和莖的MeHg 質量分數分別下降8.05%和6.05%，而根部MeHg 質量分數增加了16.9%（圖4a）。此外，對照組中水稻籽粒中MeHg 質量的比例為86.4%，而單質硫處理組中水稻籽粒中MeHg 質量的比例降低至83.1%，但根和莖中MeHg 質量的比例與對照組相比，分別提高了20.9%和25.7%（圖4b），表明添加單質硫后降低了水稻籽粒中MeHg 的分配，可能與單質硫提高了MeHg 在水稻根部和莖部的分配有關。對照組中水稻植株MeHg 的富集因子為2.06，而單質硫處理組中水稻植株MeHg 的富集因子顯著下降至1.91（P<0.01）（圖4c），表明添加單質硫能抑制水稻從土壤中吸收MeHg，可能與添加單質硫后土壤MeHg 質量分數的降低有關（Li et al.，2017）。與對照組相比，單質硫處理降低了水稻根部到莖、葉片MeHg 的轉運（表2），這可以用來解釋添加單質硫后水稻葉片和莖中MeHg 質量分數下降，而根部MeHg 質量分數升高。此外，單質硫處理組中根、莖和葉到籽粒MeHg 的轉運系數下降，表明單質硫處理抑制了其他部位到水稻籽粒MeHg 的轉運，導致水稻籽粒MeHg 質量分數下降（圖4a）。

表2 對照和單質硫（100 mg?kg?1）處理組水稻植株甲基汞的轉運系數Table 2 The translocation factor of MeHg of rice plants in control and S(0) (100 mg?kg?1) treatments

圖4 對照和單質硫（100 mg?kg?1）處理組水稻不同組織的甲基汞質量分數和分配及甲基汞的生物富集因子Figure 4 The contents and distribution of MeHg in different tissues of rice plants and bioaccumulation factors of MeHg in control and S(0) (100 mg?kg?1) treatments

水稻籽粒中MeHg 的生物積累被認為主要通過水稻根部從土壤中吸收MeHg（Strickman et al.，2017），MeHg 進入水稻根細胞后，可以與巰基結合形成甲基汞-半胱氨酸復合物（MeHg-cysteine），隨后以一種類似于營養物質的形式在植物體內被轉運，并最終分配至水稻籽粒中累積（Tang et al.，2020）。本結果表明，單質硫處理組水稻籽粒MeHg累積的下降，可能與單質硫處理降低了土壤MeHg的質量分數、抑制了水稻植株從土壤中吸收MeHg和MeHg 在水稻植株內的轉運過程有關。

2.5 相關性分析

相關性分析表明，整株水稻MeHg 質量分數、水稻籽粒中MeHg 質量分數與土壤(NH4)2S2O3提取態MeHg 質量分數之間均具有顯著正相關關系（圖5a、b）。土壤(NH4)2S2O3提取態MeHg 可被水稻直接吸收利用，其質量分數的降低可以導致水稻籽粒中MeHg 質量分數的下降。同時，我們發現土壤中DOC 質量分數、SO42?質量分數與土壤(NH4)2S2O3提取態MeHg 質量分數之間均具有顯著負相關關系（圖5c、d）。在之前研究中發現，DOC 通過將二價汞還原成零價汞降低Hg 的生物有效性，從而減少MeHg 的產生（Tang et al.，2020），而在汞污染土壤中添加硫酸鹽可以通過促進土壤中有機結合態（RS-Hg-SR）向殘渣態（HgS）的轉化，同時促進水稻根表鐵膜的形成，降低水稻植株中MeHg的累積（Li et al.，2017）。

圖5 水稻甲基汞質量分數和土壤理化指標與土壤(NH4)2S2O3提取態甲基汞質量分數之間的相關性分析Figure 5 Correlations analysis between MeHg contents in rice plants and physicochemical properties in soils and MeHg contents in (NH4)2S2O3 extract

3 結論

在汞污染土壤中添加單質硫降低了土壤和(NH4)2S2O3提取態中MeHg 的質量分數，刺激了硫酸鹽還原菌的活性，其可能在參與汞甲基化過程的同時參與厭氧環境下去甲基化過程，在一定程度上促進了MeHg 的降解。單質硫處理可以提高水稻光合作用能力，從而促進水稻植株的生長。此外，單質硫處理抑制了水稻植株從土壤中吸收MeHg 的過程以及MeHg 在水稻植株內的轉運過程，尤其是其它部位到水稻籽粒的轉運，從而導致水稻籽粒中MeHg 累積的下降。本研究為降低汞污染地區水稻植株中MeHg 的生物累積以及稻田MeHg 污染修復提供了理論支持。