工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌的抑菌活性

朱春暉，程菊娥，周英，解嘯，黃妃蘭，孫書娥，張德詠

(1.湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125；2.西雙版納傣族自治州農業科學研究所，云南 景洪 666100)

工業大麻是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis)一年生草本植物，是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻，其植株的化學成分復雜，含有多酚類、黃酮類、生物堿類、萜類等大量活性物質，具有一定的抗菌性[1]。 目前工業大麻的抗菌作用研究主要是針對大腸桿菌、金色葡萄球菌等細菌的拮抗作用[2－4]，針對真菌特別是植物病原真菌的研究甚少。 楊帆等[5]的研究表明，工業大麻植株的花提取物對大豆疫霉病菌、小麥赤霉病菌和玉米小斑病菌抑制活性比較好。 辣椒白絹病是由齊整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)侵染所引起的辣椒土傳病害，主要危害莖基部和根部[6]。 辣椒炭疽病是由刺盤孢屬和長圓盤孢屬侵染所引起的，為發生在辣椒上的病害[7]。 本研究選取的是辣椒刺盤孢菌(Colletotrichum capsici(syd. )Butl.)。 稻瘟病是一類重要的作物病害，可引起水稻大幅度減產，病原菌為稻梨孢(Pyricularia oryzaeCav.)，屬半知菌亞門真菌[8]。 本研究選取3 個工業大麻品種云麻7 號、云麻8 號、云麻10 號的雌雄花，采用乙醇溶液進行提取，分別測試提取液對辣椒白絹病菌、辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌菌絲生長的抑制率，探討工業大麻花提取物對植物病原真菌的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

云麻7 號、云麻8 號和云麻10 號的雌花和雄花，均由云南省西雙版納傣族自治州農業科學研究所在勐海試驗基地采集提供，雄花在始花期采收，雌花在盛蕾期采收，采集時均在距頂部15～20 cm處截斷，采集后曬干備用；

試驗中所用乙醇為95%乙醇；

供試植物病原菌:辣椒白絹病菌、辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌，由湖南省植物保護研究所實驗室分離保存。

1.2 研究方法

1.2.1 工業大麻雌花和雄花活性物質的提取

將采集的云麻7 號、云麻8 號、云麻10 號的雌雄花樣品曬干、粉碎，每份樣品各稱取100 g，分別加入500 mL 95%的乙醇溶液，冷浸(0 ℃)24 h，離心(3000 r/min，5 min，4 ℃)，真空抽濾，濾渣重復提取3 次，合并濾液，減壓蒸餾(45 ℃)，得到云麻7 號、云麻8 號、云麻10 號的雌雄花提取物，避光冷藏備用(4 ℃)。

1.2.2 工業大麻花提取物對3 種植物病原菌的抑菌活性測定

工業大麻花提取物對植物病原菌的活性測定采用菌絲生長速率法。 將工業大麻花提取物分別加入95%的乙醇溶液，配置成不同質量濃度的供試液，濃度由低到高分別為50、100、200、400、800 mg/mL。 分別取1 mL，加入50 mL 溫度為45 ℃的PDA 培養基中，搖勻，平均倒入3 個直徑為9 cm的滅菌培養皿中，冷卻后即制得終濃度分別為1、2、4、8、16 mg/mL 的培養基平板。 在無菌條件下，將培養好的病原菌分別接入直徑10 mm 的供試菌餅，每個菌種設3 皿重復。 以每50 mL 培養基中加入1 mL 95%乙醇溶劑的培養基平板作為空白對照，恒溫(25 ℃)培養7～10 d，待對照平板長滿后，采用十字交叉法量取菌落圈直徑，并取其平均值作為處理菌落直徑，計算抑制率，運用DPS 7.05 軟件對數據進行統計分析，并采用Duncan 新復極差法對抑制率進行差異性檢驗。

根據濃度和抑制率數據，采用DPS 7.05 統計軟件求毒力回歸方程和相關系數，計算有效中濃度EC50值。

2 結果與分析

2.1 工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌的抑制效果

工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌的抑制效果見表1～3。

表1 工業大麻花提取物對辣椒白絹病菌抑制效果Table 1 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on pepper sclerotium blight(Sclerotium rolfsii Sacc.)

表2 工業大麻花提取物對辣椒炭疽病菌抑制效果Table 2 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on pepper anthracnose (Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)

表3 工業大麻花提取物對稻瘟病菌抑制效果Table 3 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on rice blast (Pyricularia orzyae Cav.)

從表1 可以看出，辣椒白絹病菌的抑制率隨著工業大麻花提取物濃度的升高而升高。 當濃度為1 mg/mL 時，云麻8 號雌花和雄花提取物對辣椒白絹病菌抑制率最低，均為18.04%；濃度為16 mg/mL時，云麻7 號雄花提取物對辣椒白絹病抑制率最高，為91.37%。

從表2 可以看出，辣椒炭疽病菌的抑制率隨著工業大麻花提取物濃度的升高而升高。 濃度為1 mg/mL時，云麻10 號雄花提取物對辣椒炭疽病菌抑制率最低，為11.76%；濃度為16 mg/mL 時，云麻7 號雌花提取物對辣椒炭疽病菌抑制率最高，為81.96%。

從表3 可以看出，稻瘟病菌的抑制率隨著工業大麻花提取物濃度的升高而升高。 濃度為1 mg/mL時，云麻10 號雄花提取物對稻瘟病菌抑制率最低，為14.12%；濃度為16 mg/mL 時，云麻10 號雌花提取物對稻瘟病菌抑制率最高，為76.86%。 綜上所述，3 個不同品種的工業大麻花提取物對3 種不同植物病原真菌的抑制濃度具有一定差異，3 種植物病原真菌的抑制率隨著工業大麻花提取物濃度的升高而升高。 辣椒白絹病菌各個濃度的抑制率整體要低于辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌的。 辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌相同濃度下抑制率相互間差異較小。

2.2 工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌的抑菌毒力

工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌的抑菌毒力統計結果見表4～6。 由表4 可以看出，6種工業大麻花提取物對辣椒白絹病菌的抑菌毒力存在差異:云麻7 號雄花提取物對辣椒白絹病抑制濃度最低，EC50值為4.660 1 mg/mL；而云麻8 號雄花提取物對辣椒白絹病抑制濃度最高，EC50值達到了32.377 0 mg/mL。

表4 工業大麻花提取物對辣椒白絹病菌的抑菌毒力Table 4 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extracts against pepper sclerotium blight (Sclerotium rolfsii Sacc.)

表5 工業大麻花提取物對辣椒炭疽病菌的抑菌毒力Table 5 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extractst against pepper anthracnose(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)

表6 工業大麻花提取物對稻瘟病菌的抑菌毒力Table 6 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extracts against rice blast(Pyricularia orzyae Cav.)

由表5 可以看出，6 種工業大麻花提取物對辣椒炭疽病菌的抑菌毒力有差異:云麻7 號雌花提取物對辣椒炭疽病菌抑制濃度最低，EC50值為3.114 9 mg/mL；而云麻7 號雄花提取物對辣椒炭疽病菌抑制濃度最高，EC50值達到了6.513 5 mg/mL。

由表6 可以看出，6 種工業大麻花提取物對稻瘟病菌的抑菌毒力有差異:云麻7 號雌花提取物對稻瘟病菌抑制濃度最低，EC50值為4.631 0 mg/mL；而云麻8 號雄花提取物對稻瘟病菌抑制濃度最高，EC50值達到了8.252 0 mg/mL。

3 討論與結論

現有研究表明，工業大麻提取物對大豆胞囊線蟲、南方根結線蟲、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌等都有抑制效果[9－14]，另有報道在工業大麻提取物中發現具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡且表現出廣譜抗腫瘤作用的化合物[15]。 本研究選取具有代表性的3 種植物病原真菌作為研究對象，檢測工業大麻花提取物對植物病原真菌的抑菌效果。

研究表明[12，14，16]，工業大麻葉提取物對金黃色葡萄球菌和李斯特菌的最低抑菌濃度分別為7.81、15.63 mg/mL，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為6.25 mg/mL。 本研究選取的工業大麻花提取物最低濃度為1 mg/mL 時均有抑菌效果，其中濃度為1 mg/mL 時對辣椒炭疽病菌的最低抑制率是云麻10 號雄花提取物的11.76%，對辣椒白絹病菌的最高抑制率是云麻10 號雄花提取物的37.25%。

楊帆等[5]采用溶劑浸提法提取的工業大麻花、葉、莖和根4 種不同器官的粗提物，對大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)3 種病原物均具有一定的抑菌活性，其中工業大麻花的提取物對小麥赤霉病菌的抑制活性最佳，抑制率可達50%。 因此本研究選取工業大麻花提取物作為研究對象，雌花和雄花分別提取，比較雌花、雄花提取物的抑菌活性差異。 本研究工業大麻花提取物濃度達到16 mg/mL 時，對3 種植物病原真菌的抑菌率均接近或超過50%，抑菌活性更高。

張正海等[2，4，16]研究發現，工業大麻提取物成分Fr5 餾分(石油醚和乙酸乙酯1∶1 提取后的餾分5)破壞金黃色葡萄球菌、李斯特菌的細胞壁和細胞膜結構，導致細胞膜通透性增加，內容物和電解質外泄，進而影響菌體能量代謝并造成質膜氧化損傷，抑制細胞生長，最終使細菌生長受到抑制。 本研究發現工業大麻花提取物對3 種植物病原真菌均有抑制作用，為植物源真菌殺菌劑的應用提供了參考。 但是本研究中工業大麻花提取物對植物病原真菌起抑制作用的具體成分及抑菌機理尚不清楚，有待下一步深入研究。