苧麻expansin 家族成員鑒定與表達分析

石亞亮，鐘意成，黃坤勇，牛娟，孫志民，陳建華?，欒明寶?

(1.三亞中國農業科學院國家南繁研究院，海南 三亞 572024；2.中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410221)

擴展蛋白最早被鑒定為一種具有細胞壁松弛作用的蛋白，部分介導了植物細胞壁延伸和細胞生長。 擴展蛋白主要分為兩個蛋白家族，即α 和β 擴展蛋白亞族，他們不僅作用于細胞膨脹，還參與調節包括形態發生、果實軟化、花粉管生長等多種植物生長過程[1]。 蛋白功能被細胞壁酸性條件激活，在植物中存在一些反應機制會誘導細胞壁pH 值發生變化而影響細胞的生長[2]。 由于擴展蛋白對細胞壁具有獨特的修飾作用，先后在棉花和苧麻關于纖維發育的研究中得到關注，已有研究發現3 種編碼擴展蛋白的基因在苧麻的上部莖皮上調表達[3－4]。 一些家族成員基因在其他植物中的功能相繼被證實，涉及促進生長、改善纖維品質和鹽脅迫響應，例如水稻OsEXP4[5]、棉花GhEXPA8[6]和GbEXPATR[7]、小麥OsEXPB23[8]等。 擴展蛋白在苧麻中的研究才剛剛起步，該家族基因具體的分子功能及其對纖維細胞的發育和纖維品質的影響尚不清楚。

在Swiss－Prot 數據庫中:水稻的56 個編碼擴展蛋白的基因，包括α 亞族34 個，β 亞族19 個；擬南芥36 個編碼擴展蛋白的基因包括α 亞族25 個和β 亞族7 個；玉米4 個基因都屬于β 亞族。苧麻中通過轉錄組序列拼接和同源基因克隆的方法發現了12 個α 亞族和4 個β 亞族，共16 個編碼擴展蛋白的基因[9]。 然而，目前還未對苧麻expansin家族成員的具體數目和類型進行全面鑒定。苧麻基因組測序草圖的順利完成[10]，使利用生物信息學在全基因組水平上分離和鑒定expansin家族成為可能。 因此，本研究利用苧麻基因組數據庫對苧麻expansin家族成員及其類型進一步鑒定與分析，旨在為苧麻纖維發育候選基因挖掘奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 苧麻expansin 家族成員鑒定

在Pfam 數據庫下載擴展基因家族保守結構域數據文件(登錄號分別為PF03330 和PF01357)，利用hmmer v3.0 軟件構建苧麻expansin家族專有的保守結構域隱馬爾可夫模型文件，然后在苧麻基因組蛋白數據中搜索家族成員[11]。 將家族蛋白氨基酸序列在HMMER 網站(https:/ /www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)進行序列分析。

1.2 理化性質分析和亞細胞定位

通過ExPASy 網站(https:/ /www.expasy.org/)中的Protparam 程序分析蛋白質的分子量、等電點，利用Signal P－5.0 預測蛋白的信號肽，采用pLoc－mPlant 進行蛋白的亞細胞定位預測。

1.3 擴展基因結構及蛋白序列分析

利用在線軟件MEME(http:/ /meme－suite.org/)對擴展蛋白保守結構域進行分析。 最大motif數量設為20，其他參數為默認值。 根據苧麻基因組的DNA 序列和編碼區序列，使用TBtools 軟件[12]分析和繪制基因家族成員的基因結構圖。

1.4 基因家族系統進化分析

利用分子進化分析軟件MEGA7 的ClustalW 程序對鑒定的苧麻擴展蛋白氨基酸序列進行多重序列比對，采用鄰接法(NJ，neighbor－joining)構建系統發育樹。 在Swiss－Prot 數據庫下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，與苧麻的蛋白氨基酸序列進行比對，默認參數，bootstrap值設為500，構建NJ 進化樹。

1.5 表達分析

依據本課題組已經完成的苧麻轉錄組測序結果，即2 個纖維細度差異大的品種，編號為2－25(纖維細度1312 m/g)和3－4(2788 m/g)，發芽2 周(T1)、4 周(T2)、6 周(T3)、8 周(T4)、10 周(T5)5 個不同纖維發育時期莖皮中各基因的FPKM 值[13－14]，分析其5 個發育時期的expansin家族基因表達模式。 利用與轉錄組相同的樣品材料(液氮冷凍，－80 ℃保存)，提取苧麻莖皮總RNA，RNA 提取方法和模板cDNA 的合成均按照試劑盒操作手冊。 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 用于莖皮總RNA 提取，Thermo Scientific RevertAid first－strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific， Vilnius， Lithuania)用于cDNA 合成，合成20 μL 體系cDNA，用ddH2O 稀釋一倍后備用。 根據擴展蛋白基因家族表達差異的結果在Primer 5 設計相關基因的特異性引物，以苧麻18S rRNA為內參基因， 于Bio－Rad iQ5 Real－Time PCR System (Bio－Rad， CA， USA)分析儀上進行qRT－PCR 分析，25 μL qPCR 體系，即1 μL cDNA，12.5 μL 2×SYBR qPCR Mix (北京艾德萊生物公司)， 各1 μL 上下游引物(10 μmol/L)和10.5 μL ddH2O， 程序為95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s和55 ℃30 s，40 個循環，每個樣品設3 個重復，并按照2－ΔΔCT的方法計算基因的相對表達量[15]。利用GraphPad Prism 8 軟件的Holm－Sidak 方法對表達量進行t測驗，以比較基因在品種間和時期間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 基因家族成員的鑒定及理化性質分析

通過全基因組基因家族成員挖掘，去掉結構和功能冗余的2 個候選序列，共獲得了27 個expansin基因候選序列。 在Pfam 數據庫對這些序列進行結構域注釋，發現24 個具有家族保守結構域的DPBB＿1 和Pollen＿allerg＿1，3 個缺失第二個結構域的候選序列。 對此24 個具有完整結構域基因的命名沿用苧麻基因組蛋白數據庫注釋。

比較和分析24 個苧麻擴展蛋白序列的理化性質(表1)，氨基酸數目213aa(Expansin－A23)～589aa(Expansin－B15＿3)，分子量23 253.44 Da(Expansin－A23)～62 928.18 Da(Expansin－B15＿3)，等電點4.78(Expansin－like＿2)～9.96(Expansin－A12＿1)。 預測發現5 個蛋白序列沒有信號肽，分別為Expansin－A23、Expansin－A12＿2、Expansin－A4＿1、Expansin－B15＿3、Expansin－A12＿1。 亞細胞定位結果顯示24 個苧麻擴展蛋白均位于細胞壁。

表1 苧麻擴展蛋白基本理化性質Table 1 Physical and chemical characteristics of ramie expansins

續表1

2.2 基因家族的基因結構及蛋白質基序預測

苧麻expansin家族成員外顯子數目為2～9 個，內含子數目為1～8 個。 根據MEME 分析結果，選擇其中E－value 最低為8.4e－003 的17 個保守基序作圖(圖1)。 同一進化支蛋白的結構域均保守且每個基因亞族蛋白含特有的保守基序(motif)，α 亞族蛋白特有motif 3，β 亞族特有motif 8，EXPL 支(EXPLA亞族和EXPLB亞族)特有motif 15。

圖1 擴展家族蛋白序列保守基序和基因結構與3 個特有保守基序Fig.1 Protein sequence conserved motifs and gene structure of expansin family and 3 specific motifs

2.3 苧麻expansin 家族的系統進化分析

在Swiss－Prot 數據庫下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，分別為36 和56條，與24 條苧麻蛋白氨基酸序列一起構建進化樹(圖2)。expansin家族包括EXPA、EXPB、EXPLA、EXPLB等4 個亞族，在進化樹中可分為EXPA、EXPB、EXPL 3 大類。 EXPA 類包含苧麻expansin家族的17 個基因(α 亞族)，EXPB 類包含4 個基因(β 亞族)，EXPL 類有3 個基因(1 個α 類亞族和2個β 類亞族)。

圖2 苧麻expansin 家族進化樹Fig.2 Expansin family phylogenetic tree in ramie

2.4 基因家族成員的表達分析

5 個發育時期的expansin家族基因表達模式如圖3 所示，9 個基因在兩個品種間存在明顯的差異表達情況，其中BnEXPA16、BnEXP－like－3 和BnEXPA20 僅在品種3－4 的T3、T4 及T5 期上調表達，BnEXP－like－1 和BnEXPA7 僅在品種2－25 的T4 期上調表達，BnEXPA8－2、BnEXPB3、BnEXPA23 和BnEXPA11 僅在品種2－25 的T2 期上調表達。 兩個苧麻品種5 個生長期內，在T1 和T2 期都上調表達的有BnEXPA2－1、BnEXPA2－2、BnEXP－like－2、BnEXPA8－1、BnEXPA12－1、BnEXPA8－2、BnEXPA1、BnEXPA15、BnEXPA4－1、BnEXPA13。 在T3、T4 和T5 期都上調表達的有BnEXPB15－1、BnEXPB15－2 和BnEXPB15－3。

圖3 苧麻expansin 家族基因表達量熱圖Fig.3 Gene expression heatmap of expansin family in ramie

根據轉錄組數據分析結果和相關差異表達基因的功能分析，選擇BnEXP－like－3 和BnEXPB15－2 這兩個基因做進一步分析(特異性引物序列見表2)，熒光定量PCR 結果(圖4)顯示，5 個時期苧麻莖皮中兩個基因的表達量呈現顯著差異(p<0.01)，兩個基因在品種3－4 表達量明顯高于2－25 的表達量。

表2 expansin 家族基因特異qRT－PCR 引物(5’→3’)Table 2 Expansin family genes specific qRT－PCR primers (5’→3’)

圖4 BnEXP－like－3(左)和BnEXPB15－2(右)在兩個苧麻品種莖皮5 個時期的相對表達量Fig.4 Expression level of BnEXP－like－3(left) and BnEXPB15－2(right) of stem bark at five growth stages of 2 varieties

3 討論與結論

苧麻中鑒定出的4 種擴展蛋白亞族的蛋白，包括α 亞族17 個、β 亞族4 個、α 類亞族1 個和β類亞族2 個。 蛋白質的氨基酸序列分析表明，可依據其特有的保守基序區分不同亞族的擴展蛋白，苧麻expansin家族α 亞族蛋白特有motif 3，β 亞族特有motif 8， α 類亞族和β 類亞族共特有motif 15。 表達分析結果顯示，expansin家族成員在不同品種和時期存在表達差異，且BnEXP－like－3 與BnEXPB15－2 兩個基因在品種3－4 中各個時期的相對表達量均高于2－25。 目前被報道與纖維發育相關的擴展蛋白基本屬于如EXP1、EXPA2、EXPA8 等所在的成員數量占有優勢的α 亞族[3－4，6－7]，而鮮有α 類亞族和β 亞族的成員。 另外，有研究發現，苧麻纖維細度還受光照、濕度、溫度等生態環境因素的影響[16]。 本研究首次發現在兩個在纖維細度不同的兩個品種間呈表達差異的BnEXP－like－3 與BnEXPB15－2，其所在亞族的蛋白被報道與植物抗逆性相關，如啟動子序列存在脫落酸、生長素、水楊酸等激素誘導元件和對干旱、高溫等非生物脅迫的響應元件的OfEXLA1[17]，及被證實由磷酸鹽饑餓誘導且能夠提高大豆磷效率的GmEXPB2[18]。 因此，BnEXP－like－3和BnEXPB15－2 是否具有通過對苧麻生長環境響應而影響纖維細度的功能值得深入探討。

棉花中發現了兩個擴展蛋白基因，GbEXPA2 通過增加結晶纖維素含量影響纖維細胞厚度，GbEXPATR是編碼一個缺失Pollen＿allerg＿1 結構域的蛋白基因，同屬于擴展蛋白α 亞族，過表達GbEXPATR纖維會產生更長、更結實的薄壁纖維[7]。 在本研究中也發現了3 個缺失第二結構域的蛋白，其中兩個有信號肽，但與擴展蛋白家族各個亞族的蛋白相似性不高，其功能有待進一步研究。