抗豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的研制及臨床治療效果研究

毛治安

(撫順市農業特產學校，遼寧 撫順 113123)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV) 可引起各種日齡豬發生腹瀉，是目前引起養豬生產中病毒性腹瀉的最主要病原，主要危害仔豬，10 日齡內仔豬發病后死亡率達95%以上。 為防治仔豬流行性腹瀉對養豬業的危害，本試驗采用自制抗PEDV 的特異性卵黃抗體，應用于發病仔豬和受威脅的健康仔豬群，研究其在預防和治療PED 的效果。

1 試驗材料

PEDV HeB09 流行株(中國農科院北京畜牧獸醫研究所)、高產蛋雞、普通營養瓊脂；血瓊脂培養基；小鼠；PED 抗原速測卡(金標)，韓國安捷BIONOTE 公司；硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸—乙酸鈉等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；流行性腹瀉病豬、新生仔豬。

2 試驗方法

2.1 卵黃抗體的制備

選取200 只120 日齡左右的高產蛋雞，應用PEDV HeB09 株進行免疫，收集瓊擴效價1∶32 以上高免蛋，應用醋酸—醋酸鈉緩沖液法制備卵黃抗體粗提液，應用水稀釋法—硫酸銨沉淀法純化工藝進行卵黃抗體的純化并進行效價的測定。

2.2 卵黃抗體安全性檢測

2.2.1 細菌檢測 將制備的卵黃抗體液涂布普通營養瓊脂平板、血瓊脂平板培養基，37 ℃恒溫培養箱培養24～72 h，觀察有無菌落生長。

2.2.2 安全性實驗 小鼠安全性試驗: 選擇4只小鼠，兩只后腿部肌注0.5 mL PEDV 卵黃抗體，連用7 d，觀察注射部位有無腫脹、潰瘍，以及藥物吸收情況；兩只每天口服0.5 mL，連用7 d，觀察小鼠是否出現異常。 仔豬安全性試驗: 選取1 周齡仔豬4 頭。 2 只后腿部肌注5 mL PEDV 純化卵黃抗體，2 只口服10 mL粗提卵黃抗體液，連用7 d；觀察注射部位有無腫脹、潰瘍以及藥物吸收情況，觀察仔豬是否出現胃腸道不良反應。

2.3 動物治療試驗

2016 年11 月撫順市高灣某豬場109 頭仔豬發生腹瀉，其中10 日齡內仔豬34 頭，10 ～30 日齡仔豬75 頭，病豬發生水樣腹瀉，精神沉郁，不食或減食，糞便呈灰黃色，較小日齡仔豬陸續出現死亡，尸體嚴重脫水. 剖檢可見: 死亡豬小腸擴張明顯，腸壁變薄，充滿黃色液體，腸系膜充血，盲腸扁桃體出血，胃內多空虛或有未消化乳凝塊。 根據發病表現及PEDV 快速檢測試紙條檢測，最后確診為PEDV 感染。

將發病仔豬分成三組，應用高免卵黃抗體進行治療。 第一組: 糖鹽水補液組，腹腔注射，15 mL/次，每天2 次；第二組: 糖鹽水補液＋純化IgY 注射治療組，每只發病豬在糖鹽水補液的同時，肌注純化IgY 液4 mL，每天1次；第三組: 糖鹽水補液＋粗提IgY 口服治療組，每只發病豬在糖鹽水補液的同時，口服粗提IgY 液4 mL，每天1 次；連續觀察1 周。 具體分組如表1。 補液用糖鹽水配方為糖鹽水250 mL，碳酸氫鈉30 mL，慶大霉素40 萬IU，阿托品0.5 mg，地塞米松0.5 mg。 治愈標準:豬只吃食、飲水基本恢復正常，糞便固態成型。

表1 患病仔豬治療分組情況

撫順市馬金豬場1 號分娩舍200 多頭仔豬發生腹瀉，死亡23 頭，患病仔豬發生不同程度的腹瀉，7 日齡內初生仔豬不食，迅速脫水；較大日齡仔豬亦出現水樣腹瀉，精神沉郁，厭食，出現口渴現象，糞便為黃色或灰色，糞便pH 檢測呈酸性。 根據流行特點、臨床表現及PEDV 快速檢測試紙條檢測確診為PEDV 感染。 應用制備的高免卵黃抗體、糖鹽水補液對其中192 頭發病仔豬進行治療，分組情況見表2。

表2 患病仔豬治療分組情況

2.4 動物預防試驗

2017 年2 月，泗水豬場豬群出現腹瀉，母豬減食、嘔吐，隨后出現水樣腹瀉，仔豬腹瀉嚴重，迅速脫水，較小日齡仔豬陸續出現死亡，在豬群內迅速蔓延，根據發病表現及PEDV 快速檢測試紙條檢測確診為PEDV 感染。對分娩舍165 頭新生仔豬進行卵黃抗體預防試驗。 試驗分卵黃抗體注射預防組(1 組)、卵黃抗體口服預防組 (2 組)、未預防組 (3組)；1 組仔豬出生當天肌注4 mL 純化IgY 提取液，隔日1 次，連用7 次；2 組出生當天口服4 mL 粗提IgY 液，隔日1 次，連用7 次；3組口服生理鹽水對照。 觀察各組仔豬的發病情況。 在不改變豬場其他生產操作的情況下，觀察卵黃抗體對于新生仔豬病毒性腹瀉的防控效果。

3 結果

3.1 抗體效價及無菌檢測結果

PEDV 卵黃抗體的純化IgY 提取液、粗提IgY 瓊擴效價均達到1∶32。 將粗提、純化產物分別接種于普通營養瓊脂培養基、血瓊脂培養基，37 ℃培養24 h，培養基表面無細菌生長。

3.2 安全性檢測結果

小鼠后腿部肌注卵黃抗體部位無腫脹、潰瘍出現，藥物吸收良好；口服給藥后小鼠精神狀態正常，未出現胃腸道癥狀。

仔豬后腿部肌注5 mL PEDV 卵黃抗體后注射部位亦無腫脹、硬結、潰瘍等情況發生，藥物吸收良好，仔豬體溫正常，精神狀態、食欲正常。 口服給藥仔豬未出現嘔吐、腹瀉等胃腸道反應。 說明制備的粗提IgY 液、純化IgY提取液安全性較好，可以應用于豬流行性腹瀉感染的臨床治療。

3.3 動物治療試驗結果

3.3.1 高灣豬場治療效果 高灣豬場109 頭發病仔豬應用糖鹽水、PEDV 特異性卵黃抗體治療后，各試驗組均有一定的治療效果，見表3。 2、3 組應用卵黃抗體注射治療組、口服治療組比單獨使用糖鹽水補液組治愈率分別高39.3%、34.1%，說明應用PEDV 特異性卵黃抗體對流行性腹瀉疾病的治療效果顯著。

表3 高灣豬場患病仔豬治療效果

3.3.2 馬金豬場治療效果 豬場1 號分娩舍192 頭仔豬發生豬流行性腹瀉疾病，根據窩數隨機分成三組，各組均腹腔注射5% 糖鹽水15 mL，每天2 次；2 組、3 組發病豬只在糖鹽水補液的同時，分別肌注5 mL 純化IgY 液、口服5 mL 粗提IgY 液，每天1 次。 治療結果如表4，10 日齡內發病仔豬由于豬只體重小、抵抗力較差，各組治愈數都較低；1 組僅使用糖鹽水補液組總治愈率僅為24.4%，2 組、3組治愈率分別達到70.1%、60.0%。

表4 馬金豬場患病仔豬治療效果

3.4 動物預防試驗結果

對分娩舍15 窩、165 頭新生仔豬進行PEDV 特異性IgY 預防試驗。 結果見表5，圖1。 IgY 口服預防組、注射預防組仔豬出現均發病仔豬，由表可見口服預防組的發病率為61.1%，注射預防組發病率42.9%，而生理鹽水對照組因為缺乏抗體保護整窩仔豬全部發病，發病率100%。 在現場觀察中，發病后全窩仔豬都會出現腹瀉癥狀。 不過在經過后續的治療(這三組發病仔豬同時進行藥物的腹腔補液，和豬場以前的操作方案一樣)，其中口服預防組的死亡率為63.6%，注射預防組的死亡率為58.3%，而對照組的死亡率達到94.5%。由此可以說明特異性IgY 可以降低新生仔豬的PEDV 發病率和死亡率，對豬場控制豬群流行性腹瀉有一定的幫助。

圖1 動物預防試驗結果

表5 泗水豬場新生仔豬卵黃抗體預防效果

4 討論與分析

本試驗中PEDV 特異性卵黃抗體臨床治療應用結果表明，發病仔豬肌注純化IgY、口服粗提IgY 液治愈率都達到55%以上，說明粗提、純化的IgY 具有很好的抗病毒活性。

2 個豬場肌注給藥、口服給藥的總治愈率分別為68.1%、58.0%，肌注IgY 給藥的治愈率比口服給藥高10%，治療效果更好。 分析其原因主要是雖然粗提卵黃抗體液中IgY 的含量高于純化IgY，但經口服給藥后，胃內酸性環境會破壞一部分IgY 的生物活性[1]，以及胃蛋白酶、胰蛋白酶對IgY 的分解作用，使能夠在消化道內發揮抗病毒作用的有效IgY 量下降，隨著豬只日齡的增長，胃內pH 下降，逐漸達到成年豬2.5 ～3.5 的水平，口服卵黃抗體活性被破壞快，因此可以考慮開發IgY 的緩釋制劑及保護劑[2]。 而肌注給藥的IgY 吸收后直接入血，不會引起抗體活性下降，血液中PEDV抗體效價迅速上升，通過抗原抗體的特異性結合發揮抗病毒作用。

卵黃抗體經粗提去脂后口服給藥的治愈率為58.0%，與應用PEDV SD 株制備的卵黃抗體液對自然發病豬場病豬治療效果(治愈率67%) 接近[3]，雖然本試驗口服給藥在治愈率上比純化IgY 注射給藥途徑低，但是粗提去脂方法簡單，生產成本比較低，相比較比純化卵黃抗體更容易在基層養殖業中推廣使用。

不同日齡段仔豬經糖鹽水補液、卵黃抗體給藥后的治療效果顯示10 日齡內仔豬的總治愈率僅為21.2%，10 ～30 日齡仔豬的治愈率可達80.5%。 主要因為10 日齡內仔豬體重、免疫力較低，一旦發生腹瀉迅速發生脫水，而隨著病豬日齡的增加，豬只的抵抗力增加，及時采取補液、特異性抗體療法死亡豬只數量明顯下降，治療效果良好。

應用制備的卵黃抗體純化產物、粗提去脂液預防給藥后，新生仔豬的發病率比對照組分別降低了57.1%、38.9%，發病豬的死亡率分別降低了36.2%、30.9%，說明PEDV 特異性卵黃抗體的預防給藥對豬場控制豬群尤其是新生仔豬的流行性腹瀉有一定的幫助。 通過卵黃抗體預防實驗、治療試驗結果看出，PEDV 卵黃抗體緊急預防、治療給藥是控制疫情蔓延、減少豬場經濟損失的有效措施。 同時，針對此病的發生，應加強生產管理，包括豬舍溫濕度的控制、定期消毒等操作，母豬產前做好病毒性腹瀉疫苗的普免，提高豬群的免疫狀態和抵抗力，以預防流行性腹瀉的流行，提高豬場的經濟效益。