豬偽狂犬病的診斷和防控效果評估

元 娜，張美美，耿 健，李向清，趙寶凱

(1. 河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071000；2. 北京大偉嘉生物技術股份有限公司，北京 100085；3. 東北農業大學動物醫學院，黑龍江 哈爾濱 150030；4. 遼寧偉嘉農牧生態食品有限公司，遼寧 葫蘆島 125199)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR) 是由皰疹病毒科，a -皰疹病毒亞科的豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 引起的一種以發熱、奇癢和腦脊髓炎為特征的急性傳染病[1]。 此病危害新生仔豬的消化系統、呼吸系統以及神經系統，可引起母豬的繁殖障礙。 感染PRV 耐過豬是病毒的長期帶毒者和排毒者[2]。 2011 年后，我國多地區出現豬PR 變異毒株并流行，引發母豬流產和豬只死亡，經濟損失嚴重[3]。 隨著PR 免疫和凈化措施的有效落地，PRV 感染案例的報道逐漸減少。 但免疫方法不科學、程序不合理以及使用疫苗毒株不匹配，不能構筑有效的免疫屏障易引起豬場發病。 2022 年12 月，山西某規?；i場發生了有典型癥狀的PR，通過4 個月的跟蹤觀察、實驗室診斷、病毒分離和中和抗體的測定，對疾病的流行特點和防控效果進行了總結分析。

1 豬場基本情況

山西某5 000 頭母豬的種豬場，母豬免疫PR C 株疫苗4 次/年，1 頭份/頭豬；仔豬24 h滴鼻1 頭份/頭豬，35 ～45 日齡免疫1 頭份/頭豬。 從2021 年12 月9 日開始，母豬出現流產且以妊娠中后期為主，病豬體溫升高，采食量下降；產房母豬產死胎、木乃伊胎和弱子比例升高；仔豬出生后2 周內出現死亡現象，病死率達70%以上，主要表現為神經癥狀，頭歪向一側，共濟失調，同時伴有呼吸困難。 對病死仔豬進行剖檢，可見腦膜明顯充血、出血，腦脊髓液增多；肺臟出血；腹股溝淋巴結腫大、出血，顏色呈紫黑色。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品 采集流產母豬血拭子4 份，流產胎兒2 頭，發病仔豬的腦組織、扁桃體、肺臟、淋巴結各3 份；隨機采集2021 年12 月、2022 年1 月、3 月和4 月母豬的血清共計332份；豬場使用的C 株弱毒疫苗和HB2000 弱毒疫苗各1 瓶。

2.1.2 主要試劑及儀器 核酸提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；PRV gE 基因實時熒光定量PCR 檢測試劑盒、豬瘟病毒(CSF)實時熒光定量RT -PCR 檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) 實時熒光定量RT -PCR 檢測試劑盒購自美國IDEXX；PRV gB 和gE 抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX；DL 2000 DNA Marker 購自北京康為世紀生物科技有限公司；LA Taq、GC Buffer 購自寶生物工程(大連) 有限公司；高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、細胞消化液購自Thermo Fisher；Vero細胞由本實驗室保存；PRV 陰性血清和PRV陽性血清由本實驗室保存。 PCR 儀、凝膠成像系統購自Bio -Rad；熒光定量PCR 儀購自美國ABI；CO2培養箱購自SANYO。

2.2 方法

2.2.1 生產指標 2021 年12 月至2022 年4月，以月為單位記錄和計算平均流產率、死胎率、木乃伊率、窩均總仔數、窩均活仔數、窩均健仔數和仔豬成活率。

2.2.2 樣品處理 血拭子樣品加入1 mL 滅菌生理鹽水，渦旋振蕩，于-80 ℃反復凍融3次，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，取上清進行DNA 及RNA 提?。涣鳟a胎兒及組織樣品剪取約2 g 組織，按1∶5 質量比加入滅菌生理鹽水，研磨成勻漿，于-80 ℃反復凍融3 次，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，取上清進行DNA 及RNA 提取。

2.2.3 病毒DNA 及RNA 提取 參照核酸提取試劑盒說明書進行操作。

2.2.4 實時熒光定量PCR 及RT-PCR 檢測

用商品化的實時熒光定量PCR 及RT -PCR 檢測試劑盒分別檢測CSFV、PRRSV 和PRV。

2.2.5 引物設計與合成 根據GenBank 中PRV Ea 株(登錄號: KU315430.1) gC 基因上下游保守序列設計一對特異性引物，預期PCR產物約1 748 bp，具體信息見表1，引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

2.2.6 gC 基因擴增及測序分析 取PRV 陽性病料、PRV HB2000 疫苗液、PRV C 株疫苗液提取DNA，使用gC 1F、gC 1R 引物進行PCR擴增。 PCR 擴增體系50 μL: 上下游引物各2.5 μL，LA Taq 酶0.5 μL，DNA 模板4 μL，補充無菌雙蒸水至總體積50 μL。 反應條件為:95 ℃5 min，95 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃30 s，30 個循環；72 ℃延長10 min，4 ℃保存。 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀記錄結果。 將gC 基因擴增產物送到北京金唯智生物技術有限公司測序。 應用DNAman軟件和MEGA 軟件對測序結果進行序列比對分析，繪制遺傳進化樹。

2.2.7 病毒分離培養 將PRV 陽性腦組織剪碎研磨勻漿后，反復凍融3 次，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清，經0.22 μm 濾器過濾除菌。 取0.5 mL 接種長滿單層Vero 細胞的25 m2底面積細胞瓶，37 ℃吸附1 h 后，棄吸附液，加入含2% FBS 的DMEM 培養液5 mL，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，待CPE 達80%左右收毒，反復凍融2 次，4 ℃、4 000 r/min 離心5 min，取上清液接種Vero 細胞進行擴大培養。

2.2.8 ELISA 抗體檢測 將采集的2021 年12月、2022 年1 月和2022 年3 月共300 份血清按IDEXX 抗體檢測試劑盒使用說明書檢測PRV gE 和gB 抗體。

2.2.9 PRV 中和抗體測定 將免疫C 株疫苗后2 個月和免疫HB2000 疫苗后2 個月的共65份血清過濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min 后，用無血清DMEM 將待檢血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 進行稀釋。 用無血清DMEM 將PRV 病毒液稀釋成200 TCID50/0.1 mL，取上述不同稀釋度的待檢血清200 μL 分別加入等量200 TCID50/0.1 mL 的病毒液，充分混勻，37 ℃培養1 h 后接種已長成良好單層的Vero 細胞，每個稀釋度接種4 孔，每孔0.1 mL，同時設正常細胞對照、不加病毒液的血清毒性對照、陽性血清對照、陰性血清對照及病毒回歸對照(100 個TCID50、10 個TCID50、1 個TCID50、0.1 個TCID50)。 置37 ℃、5% CO2培養箱培養5 ～7 日，觀察并記錄細胞病變情況。 當正常細胞對照孔、血清毒性對照孔不出現CPE，且病毒回歸試驗結果符合，100 個TCID50 孔應全部出現CPE，0.1 個TCID50 應全部不出現CPE 時，實驗成立。 按Reed -Muench 法計算中和效價。

3 結果與分析

3.1 生產指標

由表2 可知，2021 年12 月，豬場流產率、死胎率、木乃伊率開始升高，最高分別達到3.90%、26.13% 和8.63%，采取措施后，2022 年4 月分別低于2021 年12 月；仔豬的窩均總仔數、窩均活仔數、窩均健仔數和仔豬成活率均出現波動，先降低后升高，2022 年4 月接近或高于2021 年12 月。

表2 2021 年12 月～2022 年4 月生產性能

3.2 qPCR 檢測結果

15 份樣本檢測PRV 核酸為陽性，檢測CSFV 和PRRSV 核酸為陰性。

3.3 PRV gC 基因擴增及測序分析

對PRV 陽性樣品、C 株疫苗液、HB2000疫苗液的gC 基因進行擴增，擴增片段為1 748 bp (圖1)。 對測序結果進行同源性比對分析，結果顯示，其與國內2012 年后流行變異毒株TJ、CD2019 和SN2018 等毒株同源性高達100%，而與國內外經典毒株如Bartha、Becker 和Kaplan及LA 毒株同源性僅為95.9%～99.3%；與市場上商品活疫苗HB2000 同源性為99.7%，與C 株疫苗同源性為95.82%(圖2)。 說明此毒株為國內流行變異毒株。

圖1 gC 基因PCR 擴增電泳

圖2 gC 基因同源性分析

應用MEGA7.0 軟件繪制遺傳進化樹，結果如圖3 所示，PRV 毒株與國內經典強毒株Ea、Fa、2012 年之后的變異強毒株及HB2000疫苗株親緣關系較近，處于同一分枝，而與國外經典毒株Bartha、Becker、Kaplan 及國內疫苗株C 株親緣關系相對較遠，處于不同分枝。

圖3 gC 基因遺傳進化分析

3.4 病毒分離培養

病料處理液接種Vero 細胞后24 h 后開始出現CPE，細胞腫脹變圓、細胞融合或拉網，48h 后成片脫落，將分離毒株命名為PRV -TZ。

3.5 ELISA 抗體檢測

對gE 和gB ELISA 抗體進行分析，由表3可知，不同月份gB 抗體陽性率均為100.00%，gE 抗體陽性率隨著月份及感染時間的推遲呈上升趨勢，從2020 年12 月的15.00%上升到2021 年3 月的84.62%。

表3 PRV gE-ELISA 和gB-ELISA 抗體檢測結果

表4 中和抗體檢測結果

3.6 PRV 中和抗體測定

測定C 株疫苗免疫后2 個月和HB2000 疫苗免疫后2 個月共65 份血清的PRV 中和抗體，由表可知，使用PRV C 株疫苗免疫后2 個月即發病前，針對此毒株的母豬血清中和抗體水平較低，使用同源性較高的HB2000 疫苗免疫后2 個月，針對此毒株的gE 抗體陰性的母豬血清中和抗體水平較高，其中中和抗體1∶32 的比例達到68.75%。

4 討論

綜合豬場的發病情況、臨床癥狀以及實時熒光定量PCR 檢測結果和不同月份gE 抗體陽性率，確診豬場感染了PRV。 PRV 可以通過直接接觸、皮膚傷口或空氣等途徑傳播。 PRV 侵入機體后先在咽黏膜和扁桃體處增殖形成原發感染灶，再通過嗅神經、三叉神經和吞咽神經的神經鞘淋巴傳播至腦和脊髓，在此進行大量復制，以異染色質形式存在并形成潛伏感染[4]。 在潛伏狀態下當受到外界的刺激時可被激活，并通過口、鼻或生殖道的分泌物散毒。2021 年12 月gE 抗體陽性率為15.00%，說明豬場部分豬只攜帶PRV，天氣突然降溫和連續3 天的斷電刺激豬只排毒成為此次發病的誘因。

PR 目前尚無特效藥，預防該病仍以疫苗免疫為主，目前商品化的疫苗主要有缺失gE基因的Bartha-k61、缺失3 個基因的HB2000和自然基因缺失的C 株疫苗。 若免疫方法和程序不合理，豬群的抗體水平不達標，豬場仍存在爆發PR 的風險。 該豬場全群免疫4 次/年PRV C 株疫苗，2021 年12 月PRV gB 抗體陽性率為100%，但豬場仍然暴發了疾病，這可能跟所使用的疫苗對此毒株交叉保護作用差有關，也可能跟免疫效果的評價方法有關。 嚴偉東[5]研究表明，Bartha K61 株活疫苗對傳統毒株有良好保護效果，而對流行變異毒株不能提供完全保護。 馬晶晶[6]攻毒試驗證實，偽狂犬活疫苗C 株免疫仔豬后，80%免疫仔豬獲得保護。 為了進一步研究發病原因，對從該場分離的PRV 毒株進行gC 基因片段擴增測序，比對結果表明此毒株與國內2012 年后流行變異毒株TJ、CD 2019 和SN2018 等毒株同源性高達100%，為2010 年后流行的變異PRV 毒株，與豬場所使用的PRV C 株疫苗同源性為95.8%，推測免疫C 株疫苗對該場流行的PRV 變異毒株交叉保護作用較差，無法為豬群提供完全的免疫保護。

根據報道，國內各地已先后分離到多株新流行的PRV 毒株，存在毒力增強和抗原位點發生突變的現象[7-9]。 PRV 的基因組為雙股線性DNA，約150kb，可編碼70 ～ 100 種蛋白質[10]。 gB 蛋白作為PRV 的主要免疫原蛋白，能誘導宿主產生中和抗體；gC 蛋白是PRV 的免疫原蛋白和主要毒力蛋白；gE 蛋白是PRV主要毒力蛋白[11]。 2011 年后分離的PRV 變異新毒株其gE 毒力基因上發生了多個位點插入或基因點突變導致毒力增強；gB 和gC 主要免疫基因與以前毒株相比發生了基因的插入或缺失以及點突變，導致產生中和抗體位點發生突變[12-16]。 中和抗體是針對完整的病毒抗原決定簇，因此，檢測中和抗體可反應機體的保護作用。

測定發病前母豬血清中針對此毒株的中和抗體效價，中抗體陽性率為100%，達到1∶16的比例為36.36%，達到1 ∶32 的比例為0.00%，說明免疫C 株疫苗不能刺激機體產生針對此毒株的較高中和抗體。 替換成與該毒株同源性較高的HB2000 疫苗免疫后，再次檢測gE 抗體陰性的母豬血清中和抗體，≥1∶32 的比例達到了68.75%，此時豬群生產指標恢復正常，可能使用同源性較低的疫苗毒株免疫豬群是此次豬場發病的主要原因，推斷當豬群中和抗體≥1∶32 的比例達到60%以上時，可保護gE 陽性豬場的豬群不發病。 gB ELISA 抗體檢測試劑盒只是檢測gB 抗體，無法詳細了解豬群實際的保護作用[17]，研發出與中和抗體相關性較高的檢測方法對PR 免疫效果的監測有重大意義。

母豬感染PRV 后表現出不同的臨床癥狀，妊娠前期感染返情率可高達90%[18]，中期或者后期感染可出現流產或產死胎，臨產母豬感染，會因垂直傳播直接引起后代仔豬患病[19，20]。 此豬場規模較大，有4 條生產線，發病期內，不同懷孕階段母豬均出現癥狀，導致本場整體的流產率、死胎率和木乃伊胎率較高，斷奶仔豬成活率較低，歷時4 個月時間，給豬場帶來了較大的經濟損失，因此，研究PR 發病原因、免疫方法和評估免疫效果對PR防控具有重大意義。