肌萎縮側索硬化相關免疫細胞的研究進展

蘇博洋，何正卿，黃旭升△

肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種累及上、下運動神經元的神經系統變性疾病［1］，病變主要累及大腦皮質、腦干和脊髓的運動神經元。其基本病理特點是大腦皮質運動區的錐體細胞和脊髓前角細胞變性丟失。臨床表現為進行性肌無力、肌萎縮、肌束顫動等。多數患者在起病后3～5 年因呼吸衰竭死亡［2］。越來越多的證據表明，固有免疫應答和適應性免疫應答都可影響ALS的進展［3］，因此明確ALS 過程中各類免疫細胞在兩類免疫應答反應中發揮的功能有助于了解ALS 的免疫機制。本文從單核細胞/巨噬細胞激活、自然殺傷細胞數量增加、小膠質細胞活化、星形膠質細胞增生及T淋巴細胞浸潤等參與ALS發病進行綜述。

1 單核細胞/巨噬細胞

人單核細胞主要分為3 個亞群：經典亞群（CD14+CD16-）、非經典亞群（CD14－CD16＋）、中間亞群（CD14+CD16+），這些亞群通過不同表面標記和它們在疾病中的功能而彼此區分［4］。散發性ALS（sporadic ALS，sALS）患者外周血中單核細胞的數量增加［5］，單核細胞比例發生改變，經典單核細胞和非經典單核細胞的比例均增加［6］。Cui 等［7］發現sALS 患者外周血單核細胞數量與病程呈正相關，與修訂版肌萎縮側索硬化功能評分（ALS functional rating scale revised，ALSFRS-R）呈負相關，與疾病進展速率和生存期無關。此外，在疾病進展過程中常伴隨單核-巨噬細胞系統的功能失調。Zondler等［8］發現sALS患者單核細胞的吞噬能力明顯下降，吞噬體到溶酶體的運輸明顯受損。與健康對照組相比，sALS患者外周血單核細胞產生更多白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子，且IL-6 和TNF-α與疾病嚴重程度和進展速度呈正相關［9］。這些研究提示，在ALS的發展過程中伴隨著單核細胞數量的增加，這些細胞可能通過分泌促炎細胞因子介導炎癥反應，減少外周單核細胞的激活有可能為ALS患者提供一種新的治療方法。

關于單核細胞對中樞神經系統（central nervous system，CNS）的浸潤目前尚存在爭議。在發病前1～2 個月SOD1G93A轉基因小鼠脾中的Ly6chi單核細胞具有明顯的促炎性，隨著疾病進展，Ly6chi單核細胞中的C-C趨化因子受體2和小膠質細胞中的C-C趨化因子配體2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）表達增加，導致Ly6chi單核細胞浸潤到脊髓，在使用抗Ly6C單克隆抗體治療SOD1G93A轉基因小鼠后發現，通過減少Ly6chi單核細胞對小鼠脊髓的浸潤數量而延緩疾病進展并減輕神經元損傷［10］。與上述研究結果不同的是，Zondler等［8］在SOD1G93A轉基因小鼠出生后第65天開始應用Fc融合蛋白，增加CNS中Ly6c單核細胞浸潤的數量，發現疾病進展速度有所延緩，提示單核細胞在疾病早期具有保護作用。綜上，單核細胞在ALS 的疾病進展過程中可被激活，并浸潤到CNS，但對ALS的具體作用尚不明確，需要更多研究闡明。

2 自然殺傷（NK）細胞

NK 細胞為先天免疫系統的效應淋巴細胞，是機體抵抗感染的第一道防線，不依賴抗體和補體就可直接殺傷靶細胞，其功能受到體內多種細胞因子的調控。在一項縱向隊列研究中，sALS 患者外周血中NK 細胞數量與病程呈正相關［11］。Garofalo 等［12］在SOD1G93A轉基因小鼠中發現NK 細胞在大腦皮質和脊髓中數量增多，對表達NK 細胞活化性受體（NKG2D）配體的SOD1G93A轉基因小鼠的運動神經元發揮神經毒性作用，利用TDP43A315T轉基因小鼠研究發現NK細胞耗竭可降低運動神經元退化的速度，增加存活率。上述動物實驗顯示，清除NK細胞后小鼠脊髓中的小膠質細胞數目減少，胞體體積減小。小膠質細胞可分泌IL-6、TNF-α和誘導型一氧化氮合酶等促炎因子，在清除NK 細胞后這些促炎因子的分泌均減少，表明NK 細胞在ALS 發展過程中對機體免疫應答發揮重要的調節作用［12］。有研究發現，與雌性SOD1G93A轉基因小鼠相比，雄性SOD1G93A轉基因小鼠CNS中存在更多的NK細胞，且NK細胞耗竭可導致雌性小鼠中樞神經系統的小膠質細胞數量減少，其存活率增加，但對雄性小鼠無明顯改善，這表明ALS 進展中不同性別可能存在不同的免疫機制［13］。這些研究結果提示NK細胞在ALS中發揮神經毒性作用，可直接參與到CNS小膠質細胞的炎癥反應中。不同性別之間免疫系統功能存在差異，有望作為評估ALS免疫治療時的關鍵變量。

3 小膠質細胞

小膠質細胞是CNS中主要的免疫細胞，對神經系統的穩態維持起著重要作用，當腦內發生病變時，小膠質細胞可快速遷移增殖并啟動免疫反應。Tondo 等［14］通過11C-PK11195正電子發射計算機斷層成像掃描發現在攜帶SOD1突變的ALS 患者大腦枕葉、顳葉、小腦和延髓中均存在轉位因子蛋白的表達水平增加，提示有活化的小膠質細胞，為進一步分析ALS發病過程中小膠質細胞的功能狀態、活化位置提供了依據。小膠質細胞存在2種表型，M1毒性表型可產生活性氧和促炎細胞因子，M2 保護性表型可產生抗炎細胞因子及神經營養因子。動物實驗顯示，在SOD1G93A轉基因小鼠疾病早期小膠質細胞主要為M2 型［15］。此外，小膠質細胞可通過吞噬異常蛋白起到神經保護作用，髓樣細胞2上表達的觸發受體（trigger receptor on myeloid cell 2，TREM2）是一種位于小膠質細胞表面的受體。最新研究表明，TREM2缺乏會損害小膠質細胞對病理性TAR DNA 結合蛋白43（TAR DNA binding protein-43，TDP-43）的吞噬清除能力，而且在ALS 患者大腦皮質和脊髓中存在TDP-43 和TREM2 的相互作用，因此在ALS中TREM2可能介導了小膠質細胞的神經保護作用［16］。

在SOD1G93A轉基因小鼠疾病晚期小膠質細胞主要為M1型［15］。有研究表明，超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）或TDP-43 在細胞內聚集是M1 表型產生炎癥反應的關鍵因素［17-18］。此外，SOD1G93A轉基因小鼠中病理性SOD1可激活小膠質細胞核苷酸結合寡聚化結構域樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體，從而促進炎癥反應［19］。上述研究提示，小膠質細胞在ALS中具有神經保護和細胞毒性功能，SOD1或TDP-43的錯誤折疊和聚集可促進小膠質細胞活化，誘導其神經毒性，加劇運動神經元的損傷，TREM2和NLRP3可能是潛在的治療靶點。

4 星形膠質細胞

星形膠質細胞尚未被確認為免疫細胞，但可通過調節免疫反應損傷運動神經元。Granatiero 等［22］研究發現抑制胰島素樣生長因子1受體信號通路可降低人源SOD1G93A誘導性多能干細胞來源的星形膠質細胞的增殖速度并減弱其對運動神經元的毒性作用。不僅如此，星形膠質細胞還可以通過產生眾多的細胞因子來影響運動神經元的活性［23］。SOD1G93A轉基因小鼠脊髓中可檢測到來源于星形膠質細胞的NLRP3炎癥小體和IL-1β，兩者水平隨疾病進展而升高，可引起運動神經元周圍的炎性反應［24］。SOD1G93A轉基因小鼠運動神經元上的主要組織相容性復合物Ⅰ類（MHCⅠ）分子表達量減少，這使得運動神經元對星形膠質細胞介導的神經毒性更敏感，易致更多運動神經元死亡，增強運動神經元上MHCⅠ的表達能夠使運動神經元免受星形膠質細胞介導的神經毒性，小鼠的運動能力和生存率均得到改善［25］。這提示MHCⅠ的表達可影響疾病的進展，對運動神經元具有保護作用。一項涵蓋所有公開的ALS（患者和小鼠模型）星形膠質細胞測序數據進行的薈萃分析顯示，星形膠質細胞中可發現缺氧信號通路的激活，還可導致細胞內谷氨酸的含量增加，介導神經炎癥和氧化應激反應，從而損害運動神經元［26］。因此，減少或逆轉星形膠質細胞介導的炎性反應可能是治療ALS 的方法之一，深入研究星形膠質細胞在疾病過程中的功能變化有助于明確潛在的治療靶點。

5 CD4＋T細胞

淋巴細胞分類中CD4＋T 細胞屬于T 輔助細胞，占總T 淋巴細胞的40%，其數量可直接反映機體的免疫功能。研究顯示，sALS患者外周血中CD4＋T淋巴細胞數量減少，隨著這種細胞數量的減少，ALS 患者更容易發生認知障礙，因此外周血CD4＋T 細胞數量被認為是ALS 患者認知功能損害的一個預測因子［27］。然而，有些sALS 患者外周血中CD4+T 細胞未減少，其免疫抑制表型如Treg、CTLA4+T細胞和PD-1+CD4＋T細胞隨疾病進展而增多［28］。這種不同可能是由個體免疫應答異常引起。與對照組相比，sALS患者外周血CD4+T細胞的數量隨著疾病進展呈下降趨勢，且其下降速度與ALSFRS-R評分下降呈負相關［11］。上述研究提示CD4＋T細胞在ALS進展過程中有保護作用，其數量的變化與疾病進展有關，但目前尚未闡明CD4＋T細胞在疾病進展中的作用機制。

6 CD8＋T淋巴細胞

CD8＋T 細胞又稱為細胞毒性T 淋巴細胞，占總T 淋巴細胞的30%，CD8分子是MHCⅠ類限制性T細胞識別抗原的輔助受體，能夠與MHCⅠ類分子結合而輔助T細胞抗原受體識別其提呈的抗原，在機體適應性免疫應答中起著重要作用。SOD1G93A轉基因小鼠和sALS 患者的脊髓中均有CD8＋T 細胞的浸潤，且CD8＋T細胞的數量與存活的運動神經元數量呈負相關；脊髓灰質中活化的CD8＋T細胞可以產生γ-干擾素，促進運動神經元上MHCⅠ的表達，并通過Fas細胞凋亡信號轉導通路和顆粒酶途徑發揮細胞毒性作用，選擇性地殺死運動神經元［29］。CD8+T 細胞數量的下降保護了SOD1G93A轉基因小鼠頸膨大處的運動神經元，延長了其生存時間［30］。此外，Nardo等［31］發現SOD1G93A轉基因小鼠受損的腰骶段運動神經元中CCL2、MHCⅠ和補體C3 等免疫分子顯著增加，伴有周圍神經系統中CD8+T淋巴細胞和巨噬細胞的大量浸潤，浸潤后的CD8＋T 細胞能促進周圍神經系統中運動軸突和神經肌肉接頭的髓鞘再生。綜上，CD8＋T細胞和運動神經元之間存在特異的MHCⅠ依賴性相互作用，從而促進運動神經元死亡。但CD8＋T細胞不僅具有神經毒性，也可以起到保護運動神經元的作用。

7 調節性T細胞（Treg）

Treg 的表型主要為CD4+CD25+Treg，是一類具有負性調節作用的T 細胞亞群，占外周血CD4＋T 細胞數的5%～10%，其特征是在細胞內表達叉頭狀轉錄因子P3（FoxP3）。FoxP3是Treg 發育成熟和發揮功能的關鍵轉錄因子。Treg 可通過主動調節的方式抑制正常機體內自身反應性T 細胞的活化與增殖，當Treg細胞的活性和數量處于異常狀態時易導致機體免疫功能失調。

有多項研究對ALS 進展中各個時期的Treg 數量進行了探索。疾病早期，SOD1G93A轉基因小鼠中的Treg可浸潤CNS，發揮抑制炎癥反應的作用［32］。疾病晚期，SOD1G93A轉基因小鼠體內的Treg 數量減少，效應T 細胞的增殖能力變強，由此提示Treg功能異常，加快了疾病的進展速度［33］。上述研究表明，疾病早期Treg 數量增加可以減弱神經炎癥反應，是介導神經保護功能的淋巴細胞亞群。疾病晚期Treg數量下降，神經保護功能減弱或消失。值得關注的是，Treg可以調節小膠質細胞、效應T 細胞等免疫效應細胞，促進運動神經元周圍形成抑制炎癥反應的微環境，從而使運動神經元的生長受到保護。Sheean 等［33］在SOD1G93A轉基因小鼠中通過IL-2 誘導內源性Treg 增殖，可顯著抑制小膠質細胞向促炎表型轉換，從而延緩疾病的進展速度。此外，與健康對照組相比，sALS患者外周血中的Treg對效應T細胞增殖的抑制能力較差，表明ALS 患者外周血中的Treg 存在功能障礙，將功能障礙的Treg 進行體外擴增后，其對效應T淋巴細胞增殖的抑制能力可恢復到健康對照組Treg的水平，這表明進行體外擴增后的Treg可能提供了一種新的細胞療法來減緩疾病的進展［34］。

8 小結

ALS的發病機制較為復雜，近些年越來越多的研究表明ALS的免疫系統存在異常，免疫細胞被激活可導致ALS中樞和周圍神經系統形成慢性促炎環境，驅動免疫反應的細胞群在數量或功能上的差異都可影響本病的進展。這些免疫細胞的相關作用對于判斷ALS 的進展及針對患者的個性化治療提供了診斷依據和治療的靶點，今后需要更多的研究討論其具體作用機制，有望發掘出新的治療方法。