廣陳皮對(duì)功能性消化不良大鼠胃腸動(dòng)力的影響*

王光寧,史夢(mèng)娜,黃月,陸旻彤,楊超燕,陳艷芬

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣州 510006)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床常見(jiàn)的功能性腸胃病,由胃和十二指腸功能紊亂引起的非器質(zhì)性病變,癥狀以上腹部不適、飽脹感、脹氣等為主,可能與胃腸運(yùn)動(dòng)障礙、內(nèi)臟高敏以及精神心理因素等有關(guān)。根據(jù)FD的癥狀和臨床表現(xiàn),可將其劃歸中醫(yī)學(xué)“痞滿(mǎn)”“胃脘痛”等范疇,常用中藥有枳殼、柴胡、陳皮等[1-4]。陳皮為蕓香科植物橘及栽培變種的干燥成熟果皮經(jīng)陳化而得,具有理氣健脾、燥濕化痰的功效,可用于治療脘腹脹滿(mǎn)、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥。廣陳皮為橘的栽培變種茶枝柑的果皮,因主產(chǎn)于廣東新會(huì)也稱(chēng)為新會(huì)陳皮,2006年被評(píng)為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。廣陳皮含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等成分,可作用于消化、心血管及呼吸等系統(tǒng),具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、助消化、祛痰、調(diào)節(jié)血脂及抗氧化等藥理作用[5-9]。廣陳皮臨床主治脾胃氣滯濕阻、脘腹脹痛、不思飲食等癥,可用于治療消化不良[3,10]。陳皮自古強(qiáng)調(diào)“陳久者良”,陳化有利于藥效的發(fā)揮,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)陳化對(duì)主要成分黃酮和揮發(fā)油均產(chǎn)生影響。目前廣陳皮采用自然存貯法進(jìn)行陳化,具有耗時(shí)長(zhǎng)、損耗率高等不足。本項(xiàng)目組采用人工加熱法對(duì)廣陳皮進(jìn)行模擬陳化,可簡(jiǎn)便快速地制備陳化樣品,前期已對(duì)模擬陳化方法進(jìn)行初步考察。本實(shí)驗(yàn)采用多因素應(yīng)激干預(yù)法制造FD大鼠模型,探討不同陳化時(shí)間和方法的廣陳皮對(duì)FD模型大鼠胃腸動(dòng)力的影響,并初步探討促進(jìn)胃腸動(dòng)力作用機(jī)制,為廣陳皮的陳化研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)雄性SD大鼠42只,體質(zhì)量160～180 g,鼠齡45～50 d,購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%。

1.2藥物與試劑 廣陳皮購(gòu)于新寶堂陳皮有限公司,經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定,為茶枝柑Citrusreticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮。多潘立酮購(gòu)于西安楊森制藥有限公司(批號(hào):181028405)。大鼠5-羥色胺(5-HT)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒和大鼠胃動(dòng)素ELISA試劑盒均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)分別為MM-0442R1、MM-0491R1)。5-HT4R抗體購(gòu)于Affinity(批號(hào):33j3022)。RIPA裂解液(批號(hào):G2002)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號(hào):G2007)及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào):G2026)均購(gòu)自Servicebio公司。

1.3儀器與設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司,型號(hào):EPOCH2),病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,型號(hào):RM2235),灰度分析軟件(Alpha Innotech,alphaEaseFC)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1藥液的制備 廣陳皮溶液:分別取干燥的新皮和十年皮,純化水回流提取2次,每次30 min,過(guò)濾,合并濾液,減壓濃縮至0.5 g·mL-1。模擬陳化樣品用新皮提取濃縮液于烘箱80 ℃加熱96 h。以上樣品制備好后4 ℃冷藏備用,臨用前加純化水稀釋至0.21 g·mL-1。多潘立酮溶液:取多潘立酮(每片10 mg)60 mg,研磨至粉狀,溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液中,制成濃度為0.6 mg·mL-1混懸液。碳糊:稱(chēng)取CMC-Na 1.2 g溶于純化水120 mL中,依次加入奶粉4.8 g,白砂糖2.4 g,淀粉2.4 g,最后滴入炭素墨水使成黑色半固體糊狀物,稱(chēng)定質(zhì)量,備用。

1.4.2FD大鼠的制備 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模,按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組(7只)和模型組(35只)。正常對(duì)照組大鼠正常喂養(yǎng),自由飲水。模型組根據(jù)文獻(xiàn)采用郭氏夾尾法、不規(guī)則喂養(yǎng)和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃等多因素應(yīng)激干預(yù)法制造肝郁脾虛FD大鼠模型[11]。具體操作如下:①每只大鼠灌胃0 ℃、0.9%氯化鈉溶液2 mL,每天2次。②用長(zhǎng)海綿鉗夾住大鼠尾尖1/3處,力度以不破皮并能引發(fā)打斗為度。每籠每次刺激30 min,激怒大鼠使整籠動(dòng)物處于憤怒狀態(tài)。每天2次,中間間隔6 h。如有抓傷可用聚維酮碘溶液涂抹受傷部位。③不規(guī)則喂養(yǎng),即每只大鼠單日給食30 g,雙日禁食,每天飲水自由。3種方法聯(lián)合造模,共持續(xù)21 d。造模過(guò)程中觀察大鼠的體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)和排便情況等,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的自主活動(dòng)能力,對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

1.4.3分組及給藥 造模結(jié)束后,根據(jù)大鼠體質(zhì)量及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將模型大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、多潘立酮組、新皮組、十年皮組和模擬陳化組,每組7只。根據(jù)陳皮臨床人的最大劑量換算大鼠的等效劑量為1.05 g·kg-1,給藥劑量設(shè)為等效劑量的2倍,即為2.1 g·kg-1。多潘立酮給藥劑量為6.17 mg·kg-1。模型對(duì)照組用常溫0.9%氯化鈉溶液灌胃,多潘立酮組灌胃多潘立酮溶液,新皮組、十年皮組和模擬陳化組分別灌胃新皮水提液、十年皮水提液以及加熱模擬陳化藥液,給藥7 d。給藥期間,各組正常喂飼,飲水自由。

1.5觀測(cè)指標(biāo) 一般狀態(tài):每天觀測(cè)大鼠的體質(zhì)量、精神、毛發(fā)及糞便等。行為學(xué)評(píng)價(jià):采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)法觀察各組動(dòng)物在造模和給藥期間的自主活動(dòng)能力。在造模的第14天、第21天和給藥7 d分別進(jìn)行大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),以大鼠三爪及以上跨進(jìn)箱內(nèi)其他方格數(shù)的總格子數(shù)作為水平活動(dòng)得分,以大鼠雙前肢抬離地面及攀附敞箱四壁的總次數(shù)記為垂直活動(dòng)得分,記錄每只大鼠5 min內(nèi)的行為活動(dòng)得分。

胃殘留率和小腸推進(jìn)率:末次給藥后,所有大鼠禁食不禁水24 h。每只大鼠灌胃碳糊2 mL,30 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分別取出胃和小腸。將胃用濾紙擦凈,稱(chēng)量并記錄質(zhì)量。沿胃大彎剪開(kāi)后用4 ℃、0.9%氯化鈉溶液清洗內(nèi)容物,擦干后稱(chēng)質(zhì)量。胃質(zhì)量與胃凈質(zhì)量的差值與碳糊質(zhì)量的百分比即為胃殘留率。取出小腸后分別測(cè)量幽門(mén)與碳糊的距離和幽門(mén)到回盲區(qū)的距離,兩者比值的百分?jǐn)?shù)即為小腸推進(jìn)率。

胃竇組織病理觀察:取大鼠胃竇組織,用4%多聚甲醛固定,然后脫水、浸蠟、包埋和切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色后觀察胃竇組織病理學(xué)變化。

胃腸激素含量測(cè)定:各組大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,收集血液后在室溫下靜置30 min,于4 ℃離心20 min(3 000 r·min-1,r=8.54 cm),分離血清保存在-80 ℃冰箱中。取各組大鼠血清按照ELISA試劑盒的操作方法分別測(cè)定胃動(dòng)素和5-HT的含量。

蛋白表達(dá):取各組大鼠十二指腸于-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肳estern blotting法測(cè)定各組大鼠十二指腸中5-HT4R的蛋白表達(dá),按照操作順序進(jìn)行蛋白提取-制膠-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學(xué)發(fā)光-圖像分析。

2 結(jié)果

2.1一般狀態(tài) 在造模期間正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)有光澤,行動(dòng)靈敏,精神狀態(tài)良好,糞便形態(tài)正常。與正常對(duì)照組比較,模型組動(dòng)物從造模第7天開(kāi)始出現(xiàn)毛發(fā)散亂,形體漸瘦,有暴躁、易怒、焦躁不安的傾向,糞便質(zhì)地稀軟,有腥臭味。造模結(jié)束后模型組大鼠毛發(fā)干枯,形體明顯消瘦,精神狀態(tài)較差,易被激怒,糞便水分含量大,腥臭味明顯。與模型對(duì)照組比較,各給藥組大鼠毛發(fā)有光澤,形體恢復(fù)明顯,精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),活動(dòng)量增加,糞便形態(tài)正常。中醫(yī)認(rèn)為過(guò)激情緒會(huì)傷及肝脾從而導(dǎo)致脾胃不和,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為精神心理因素是消化不良的誘因之一,因此本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠的精神情緒變化,結(jié)果表明多因素應(yīng)激干預(yù)法造模可致大鼠情緒暴躁易怒,給藥治療后精神狀態(tài)明顯改善。

2.2體質(zhì)量變化 在造模期間,正常對(duì)照組大鼠的平均體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng),增速較快。與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。第21天時(shí)模型組與正常對(duì)照組的平均體質(zhì)量相差較大,見(jiàn)圖1。表明該造模方法可明顯抑制大鼠體質(zhì)量增加。

圖1 大鼠造模期間平均體質(zhì)量變化趨勢(shì)

給藥1周后,多潘立酮組、新皮組、十年皮組和模擬陳化組的大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,具體見(jiàn)圖2。表明給藥干預(yù)后有助于FD大鼠體質(zhì)量的恢復(fù)。

圖2 大鼠給藥期間平均體質(zhì)量變化趨勢(shì)

2.3行為學(xué)得分 與正常對(duì)照組比較,造模期間模型組大鼠的水平和垂直得分明顯減少,說(shuō)明多因素應(yīng)激干預(yù)法造模能顯著降低大鼠的自主活動(dòng)水平。見(jiàn)表1。

表1 大鼠造模期間水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分

綜合造模期間一般情況、體質(zhì)量變化以及行為學(xué)評(píng)分說(shuō)明采用郭氏夾尾、不規(guī)則喂養(yǎng)和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃等方法可較好地制造FD大鼠模型。

由給藥后各組大鼠行為學(xué)得分結(jié)果可知,與正常對(duì)照組比較,模型組的水平得分和垂直得分均降低。連續(xù)給藥7 d后,新皮組、十年皮組以及模擬陳化組大鼠的水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分均高于模型對(duì)照組 [F(5,36)=2.155,F(5,36)=2.027,P<0.05或P<0.01],說(shuō)明廣陳皮能提高FD大鼠的自主活動(dòng)水平。具體見(jiàn)表2。

表2 大鼠給藥后水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分

2.4胃殘留率和小腸推進(jìn)率 結(jié)果見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠的胃殘留率明顯上升,小腸推進(jìn)率明顯下降(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,各廣陳皮給藥組大鼠的胃殘留率下降、小腸推進(jìn)率升高 [F(5,36)=2.010,F(5,36)=8.891,P<0.05或P<0.01],其中新皮組和十年皮組大鼠的小腸推進(jìn)率升高明顯。

表3 6組大鼠的胃殘留率和小腸推進(jìn)率比較

2.5胃竇組織的病理觀察 各組大鼠胃竇組織HE染色病理結(jié)果見(jiàn)圖3。可知,正常對(duì)照組和模型對(duì)照組及各給藥組均未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性改變,胃竇組織無(wú)潰瘍及炎性浸潤(rùn)等明顯病理特征。

A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.多潘立酮組;D.新皮組;E.十年皮組;F.模擬陳化組。

2.6胃動(dòng)素和5-HT含量 各組大鼠血清中胃動(dòng)素和5-HT含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠血清中胃動(dòng)素和5-HT的含量均明顯下降(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較,各廣陳皮給藥組大鼠血清中胃動(dòng)素和5-HT的含量明顯升高 [F(5,36)=4.841,F(5,36)=5.032,P<0.05或P<0.01],其中新皮組和模擬陳化組大鼠血清中的胃動(dòng)素含量顯著升高;新皮組和十年皮組大鼠血清中的5-HT含量顯著升高。

表4 6組大鼠血清中胃動(dòng)素和5-HT的含量

2.75-HT4R蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖4。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠十二指腸中的5-HT4R蛋白表達(dá)量下降,各給藥組大鼠十二指腸中的5-HT4R蛋白表達(dá)量顯著升高;與模型對(duì)照組比較,各陳皮給藥組和多潘立酮組的5-HT4R蛋白表達(dá)量顯著升高 [F(5,12)=40.378,P<0.05或P<0.01]。表明本實(shí)驗(yàn)采用多因素應(yīng)激干預(yù)法造模可下調(diào)FD大鼠十二指腸中5-HT4R蛋白表達(dá),廣陳皮不同給藥組大鼠十二指腸的5-HT4R蛋白表達(dá)量顯著升高,與正常對(duì)照組比較也明顯升高,說(shuō)明廣陳皮不僅能回調(diào)FD模型大鼠十二指腸的5-HT4R蛋白表達(dá),也可上調(diào)正常大鼠的5-HT4R蛋白表達(dá)。

A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.新皮組;D.十年皮組;E.模擬陳化組;F.多潘立酮組。①與正常對(duì)照組比較,t=3.952,P<0.05; ②與正常對(duì)照組比較,t=-10.157～-5.160,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,t=-11.410～-7.443,P<0.01。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為怒傷肝思傷脾,肝木乘脾土,肝氣郁結(jié)致使胃失和降、脾失健運(yùn)而出現(xiàn)消化不良,因此本實(shí)驗(yàn)采用夾尾刺激可激怒大鼠并引發(fā)打斗,結(jié)合不規(guī)則飲食和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃模擬功能性消化不良癥狀。造模期間,模型對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,暴躁易怒,自主活動(dòng)明顯減少,胃竇組織無(wú)明顯器質(zhì)性病變,說(shuō)明該方法可較好地模擬FD的癥狀。給藥治療后各給藥組的體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯高于模型對(duì)照組,精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),自主活動(dòng)也明顯增加,胃殘留率和小腸推進(jìn)率也明顯改善,說(shuō)明廣陳皮可改善FD模型大鼠的消化不良癥狀,促進(jìn)胃腸動(dòng)力。與模型對(duì)照組比較,新皮、十年皮組和模擬陳化組均可促進(jìn)胃排空和小腸推進(jìn),新皮和十年皮的促進(jìn)小腸推進(jìn)作用更明顯。表明不同陳化時(shí)間廣陳皮對(duì)FD大鼠胃腸動(dòng)力的促進(jìn)作用差異不明顯。

胃腸激素是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)自身胃腸道運(yùn)動(dòng)的特殊小分子肽活性物質(zhì),主要由消化系統(tǒng)中的內(nèi)分泌細(xì)胞所分泌。胃動(dòng)素是消化道常見(jiàn)的激素之一,具有促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)作用和分泌作用。各廣陳皮給藥組均能促進(jìn)FD大鼠胃動(dòng)素的分泌,其中新皮促進(jìn)胃動(dòng)素分泌作用強(qiáng)于十年皮組,與模擬陳化樣品相近。表明廣陳皮可通過(guò)促進(jìn)胃動(dòng)素分泌增強(qiáng)胃腸動(dòng)力,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[12]。

5-HT是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì),參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)和分泌功能。人體內(nèi)90%的5-HT 存在于消化道黏膜,外周神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT 幾乎全部由位于胃腸腺腔底部的腸嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生貯存和再攝取[13]。研究表明5-HT 通過(guò)對(duì)胃腸動(dòng)力、分泌和內(nèi)臟敏感性等影響從而在FD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,廣陳皮能夠促進(jìn)FD大鼠血清中5-HT分泌,其中新皮組和十年皮組5-HT含量高于模擬陳化組,說(shuō)明不同陳化方法對(duì)5-HT的影響存在差異。5-HT通過(guò)作用于不同受體來(lái)調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng),其中與胃腸道關(guān)系較為密切的興奮性受體有5-HT4R等。5-HT4R受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,在腦和外周組織均有分布,在外周主要分布于胃腸道、膀胱和心臟,參與胃腸道平滑肌收縮,激活神經(jīng)元細(xì)胞釋放乙酰膽堿從而促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)的蛋白免疫印跡法結(jié)果表明廣陳皮可上調(diào)FD大鼠十二指腸5-HT4R蛋白表達(dá),推測(cè)廣陳皮可能是通過(guò)5-HT與十二指腸中的5-HT4R受體結(jié)合來(lái)增強(qiáng)腸動(dòng)力。

廣陳皮中主要含有黃酮類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)成分,其中黃酮類(lèi)成分具有促消化、抗炎及抗氧化等藥理作用[15-16];揮發(fā)油具有平喘、止咳、抗變應(yīng)性炎癥、抗氧化和抗菌的作用[17],是其主要的活性成分。本項(xiàng)目組前期研究和文獻(xiàn)報(bào)道[7,18-19]均表明隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng),主要黃酮類(lèi)成分橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量均有增加,揮發(fā)油類(lèi)成分的種類(lèi)和相對(duì)含量均發(fā)生變化,酯、酸、醇類(lèi)成分增加。黃酮類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)成分在陳化過(guò)程中量變和質(zhì)變與藥效的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,廣陳皮可促進(jìn)FD模型大鼠的胃腸動(dòng)力,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)胃動(dòng)素和5-HT的分泌及十二指腸中5-HT4R蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。新陳皮、10年陳皮和模擬陳化樣品均可促進(jìn)胃腸動(dòng)力,陳化時(shí)間對(duì)FD大鼠的促胃腸動(dòng)力作用影響不明顯,初步確定模擬陳化方法可行。筆者在下一步實(shí)驗(yàn)中將優(yōu)化廣陳皮模擬陳化條件并全面比較模擬陳化與自然陳化樣品的藥效作用差異,為廣陳皮人工模擬陳化提供更多科學(xué)依據(jù)。