基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜技術的急性百草枯中毒患者早期血漿代謝組學研究*

楊娜,張天祺,蔣陳曉,2,羅雪梅,朱懷軍,王敏

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院1.藥學部;2.急診醫學科,南京 210008)

百草枯是一種季銨鹽類高效、廣譜除草劑,其在土壤中發揮作用后可很快失去活性[1]。然而,百草枯對人體毒性很強,經口攝入后致死率60%～80%[2]。百草枯可造成人體多處臟器損傷[3],其中肺部病變及功能受損最為顯著[4]。急性中毒癥狀可在1 d內出現肺水腫,1～3 d內出現急性呼吸窘迫綜合征,部分患者度過急性期后可在1～2周內發生肺間質纖維化,最終導致呼吸衰竭[5]。少數患者即使存活,肺部功能也嚴重受損且生活質量下降[6]。百草枯尚無特效解毒劑,其毒性機制尚不明確,且臨床研究匱乏。即使采取多種處理措施也很難改善預后,中毒程度較輕的患者,采取適當急救措施即可有很高的生存率[7-8]。因此,早期預測對于急性期采取合理的治療措施具有很高的指導意義[9]。近年來,pentraxin-3等相關血液指標對百草枯中毒預后的預測價值引起關注[10]。 筆者擬通過超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)對百草枯中毒患者早期血漿進行代謝組學研究,旨在進一步了解百草枯急性中毒的早期相關機制,并尋找潛在的預后參考生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部百草枯中毒患者早期血漿檢測樣本12例。納入標準:①誤服百草枯中毒后24 h內血漿樣本;②百草枯濃度測定值大于定量限。排除標準:①患者合并惡性腫瘤;②患者合并重要臟器功能障礙性疾病;③患者中毒前服用其他藥物或毒物。對照組樣本為健康人群血漿樣本12例。

1.2儀器及試劑 Exion LC AD超高效快速液相色譜(美國 AB SCIEX公司);TripleTOF 5600+型高分辨質譜(美國 AB SCIEX公司);TGL-16.5M冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);DW-HL340超低溫冰箱(Thermo Fisher公司,美國),乙腈(色譜純,德國Merck公司)。

1.3色譜條件與質譜條件 色譜條件:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);柱溫:40 ℃;進樣器溫度:4 ℃;流動相為水相(A):0.1%甲酸溶液,有機相(B):乙腈。梯度洗脫程序如下:0.0～1.0 min,10%～30%(B);1.0～19.0 min,30%～95%(B);19.0～20.0min,95%(B);20.0～25.0 min,95%～10% (B)。流速為0.4 mL·min-1,進樣體積為5 μL。

質譜條件:電噴霧離子源,采用正、負離子監測模式;正負電壓:5 500 V/-4 500 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣壓力:379.2 kPa;輔助加熱氣壓力:379.2 kPa;氣簾氣壓力:241.3 kPa;去簇電壓:±80 V;碰撞能為35 V,碰撞能分散度15 V;一級質譜全掃描范圍為100～1000 Da;動態背景扣除模式;采用信息依賴采集 (nformation-dependent acquisition,IDA) 模式對符合IDA標準的離子進行MS/MS碎片離子采集。

1.4樣本制備 各組平行取血漿樣本40 μL,分別加入冰乙腈160 μL,渦旋振蕩5 min,高速離心(4 ℃,14 000 r·min-1,10 min,r=8.6 cm)2次后,取上清液100 μL于進樣小瓶進行UPLC-QTOF-MS分析,進樣體積5 μL。

1.5質譜數據分析流程 UPLC-QTOF-MS原始數據文件采用開源數據處理軟件XCMS,對數據進行保留時間校準、峰濾噪、峰識別、及峰對齊。對包含質荷比、保留時間、峰面積等信息的二維數據陣進行分析。參照質控數據篩選原則、缺失值填補、數據歸一化及標尺化處理后,將篩選出的變量導入SIMCA-P 13.0版軟件(Umetrics,瑞典),并進行主成分分析(principle component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminate analysis,OPLS-DA)。 差異代謝物篩選選取OPLS-DA模型VIP參數值>1和顯著性差異P<0.05的變量,同時滿足差異倍數(fold change,FC)<0.833或>1.2,經人類代謝組數據庫鑒定。對差異代謝物導入MetaboAnalyst采用熱圖(Heatmap)分析。

2 結果

2.1兩組人群人口統計學資料比較 共入組血漿樣本24例,其中誤服百草枯中毒后24 h內血漿樣本和健康對照人群血漿樣本各12例,見表1。兩組人群性別、年齡構成一致,腎功能指標肌酐、尿酸以及腎小球濾過率(glomeruar filtration rate,GFR)均差異無統計學意義。兩組天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)比較差異無統計學意義,但組內個體差異大。百草枯中毒組丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平顯著高于對照組。

表1 兩組人口統計學資料比較

2.2主成分分析PCA 本研究基于前期方法[11],采用UPLC-QTOF-MS對兩組人群進行血漿代謝組學分析。對質量控制(quality qontrol,QC)樣本總離子流(total ionchromatogram,TIC)圖疊加后顯示隨行 QC 樣本色譜輪廓圖變異小、重疊度高(圖1),說明本試驗建立的 UPLC-Q-TOF/MS方法在樣本進樣分析過程中具有較好的穩定性。通過XCMS軟件對色譜峰進行提取校準后正離子和負離子模式下分別得到色譜峰2 214和2 053個。經80%去零規則消除缺失值、數據歸一化及標尺化處理后,進一步進行PCA分析。PCA圖中每個點代表血漿代謝組成成分的得分。通過PCA得分圖可觀察樣本的聚集、離散及離群點,樣本點靠的越近說明代謝組組成越接近,而離的越遠說明樣本間代謝組差異越大。見圖2。結果顯示,QC樣本點聚集良好,證明該分析方法具有良好的可重復性。正離子模式計算出R2X(cum)=0.668,Q2(cum)=0.504;負離子模式計算出R2X(cum)=0.672,Q2(cum)=0.494。百草枯中毒組較健康對照組呈現一定的分離度,且中毒組PCA得分圖顯示出較大的個體差異。

圖1 質量控制樣本的總離子流重疊圖

圖2 血漿樣本PCA和OPLS-DA結果

2.3OPLS-DA分析 進一步采用OPLS-DA對百草枯中毒和健康人群的血漿樣本進一步區分,見圖2。百草枯中毒和健康人群血漿互相分離,代謝輪廓有明顯區別。預測成分對差異的解釋水平(正離子模式:R2Y=0.983;負離子模式:R2Y=0.978)和預測水平(正離子模式:Q2=0.77;負離子模式:Q2=0.71)較好。通過200次置換檢驗計算出每組截距,其中正離子模式下模型參數R2=0.874,Q2=-0.405;負離子模式下模型參數R2=0.867,Q2=-0.398,其數值均<1,判定模型穩定可靠,預測性好,不存在過擬合。

2.4差異代謝物篩選與分析 基于OPLS-DA模型,比較兩組人群血漿中的差異代謝物,選取VIP參數值>1、顯著性差異P<0.05并同時滿足FC<0.833或>1.2的變量,經二級譜庫對差異化合物進行精確鑒定分析,見表2。正、負離子模式下共篩選出差異化合物48個,包含磷脂、氨基酸、飽和或不飽和脂肪酸等。采用MetaboAnalyst5.0對差異代謝物進行通路富集分析后發現,主要涉及亞麻酸和亞油酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成、同型半胱氨酸降解等通路。對代謝物的水平分析發現,中毒組血漿中脂肪酸及磷脂[溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)]等變化顯著(P<0.05),見圖3。采用火山圖結合統計顯著性量度(P值)和變化幅度(倍數)進一步分析顯示,有23種差異化合物在兩組中變化超過2倍(圖4A),包含8種不飽和脂肪酸、6種磷脂、2種氨基酸等。其中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)變化最為顯著,在百草枯中毒組血漿中水平比健康對照組分別高16.2倍(P<0.05)和17.9倍(P<0.05),其他差異代謝物變化均在4倍以內。亞油酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、LysoPC(16：0) 和LysoPC(17：0) 在百草枯中毒組血漿中水平顯著低于健康對照組。

N01—N12:健康對照組;B01—B12:百草枯中毒組。

A.中毒及對照組差異化合物火山圖; B.L-乳酸;C.二十碳二烯酸;D.4-羥丁酸;E.甜菜堿;F.苯丙氨酰苯丙氨酸;G.1-磷酸鞘氨醇;H.溶血磷脂(20：1);I.溶血磷脂酰乙醇胺(22：6)。①與存活組比較,t=3.26～3.54,P<0.01;②與存活組比較,t=2.33～2.71,P<0.05。

表2 兩組人群差異代謝物

百草枯中毒組12例患者中有6例出現急性百草枯中毒后死亡。進一步分析發現,百草枯中毒組較健康對照組血漿中顯著變化的48種差異化合物中,有8種化合物在中毒存活和死亡亞組中差異顯著,見圖4。除苯丙氨酰苯丙氨酸外,包括LysoPE(22：6)、LysoPC(20：1)、L-乳酸、二十碳二烯酸、4-羥丁酸、甜菜堿、1-磷酸鞘氨醇在內的7種化合物在中毒死亡組中水平顯著高于存活組。值得一提的是,LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)變化同樣最為顯著,在死亡組中水平分別為存活組水平的14.5倍(P<0.05)和16.4倍(P<0.01)。以上提示,二者在百草枯急性中毒及致死相關毒性機制中發揮重要作用。

3 討論

目前針對百草枯中毒尚無特效解毒劑,對于其中毒預后的早期評估對臨床采取合理措施具有一定指導意義。代謝組學是系統生物學的重要組成部分,是一種研究生物系統受到刺激后代謝產物的變化或其隨時間變化的一種技術手段[12]。近些年來,代謝組學技術在疾病預后評估、藥物/毒物作用機制及干預靶點發現等多方面廣泛應用[13-14]。現階段,由于急性百草枯中毒較為罕見,臨床樣本較難獲得,針對百草枯中毒后的代謝組學研究多集中在動物水平。有研究表明,百草枯中毒大鼠肺組織氨基酸代謝、脂肪代謝等代謝途徑可能參與了百草枯中毒致肺損傷的病理進程[15]。其中,棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸代謝物變化趨勢與本研究中血漿代謝組學結果一致。

研究發現,急性百草枯患者中毒早期血漿中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)升高最為顯著,且死亡患者血漿中水平顯著高于存活患者。值得關注的是,二者皆為磷脂類物質。研究表明,LysoPC為強促炎遞質,可通過激活和募集黏附分子、生長因子、單核細胞和巨噬細胞來增強炎癥,也可通過調節免疫細胞的功能參與免疫反應。在輸血或直徑≤2.5 μm的顆粒物所致的急性肺損傷過程中,LysoPC水平均顯著上調[16]。臨床研究還發現,作為促肺纖維化介質溶血磷脂酸的合成前體,血漿LysoPC可作為特發性肺纖維化的潛在生物標志物。以上提示,血漿LysoPC水平與百草枯中毒所致肺功能損害及肺纖維化具有密切關聯。血漿LysoPE與肺癌的發生發展密切相關[17-18],LysoPE對于非小細胞肺癌具有較高的診斷效能(AUC:0.78)和靈敏度(94.75%)[19],提示LysoPE與肺部生理病理狀態存在密切關聯。

不飽和脂肪酸二十碳二烯酸為促炎遞質,且血漿不飽和脂肪酸水平與肺功能呈負相關,這與死亡患者血漿中水平顯著高于存活患者相一致[20]。本研究還發現死亡患者血漿中包括L-乳酸和4-羥丁酸在內的單羧酸類化合物水平顯著高于存活患者。二者是細胞重要的分解代謝產物,同時可作為底物參與到其他生物代謝途徑中。二者在血漿中的較高水平不僅說明中毒患者機體處于顯著的代謝異常狀態,負責其轉運的單羧酸轉運體(monocarboxylate transporter,MCT)的表達或活性是否存在異常還需要進一步考察,而MCT功能失調被證實與肺、腎臟等多種臟器疾病進程密切相關[21]。與所篩選的其他差異代謝物不同,苯丙氨酰苯丙氨酸被發現在死亡患者血漿中水平顯著低于存活患者,有研究表明苯丙氨酰苯丙氨酸可以影響蛋白質的合成和分泌,與內皮細胞功能密切相關[22],而其與急性百草枯中毒后所致的各臟器嚴重損傷之間的關聯還需要進一步探究。

綜上所述,本研究通過UPLC-QTOF-MS技術對急性百草枯中毒患者早期血漿進行代謝組學研究,可為急性百草枯中毒預后早期評估提供參考,為中毒所致肺損傷提供新的干預靶點。