免疫微環境調控轉移性肝癌機制研究進展

郭駒 謝裕安

轉移性肝癌(MLC)是起源于胃腸道和非胃腸道的繼發性癌癥,也是癌癥高死亡率的主要原因[1]。肝轉移的存在預示著包括乳腺癌、腎癌和肺癌等多瘤種的不良預后。約25%初診結直腸癌(CRC)和40%～50%晚期CRC患者發生肝轉移[2]。若不治療MLC,患者中位生存期將縮短至6～12個月,5年生存率僅為9%[2]。MLC的發生主要因肝臟豐富血供,約25%心輸出量流經肝,2/3經門靜脈匯入,由消化道靜脈供應支持胃腸腫瘤擴散至肝臟。除脈管系統外,肝臟微環境也是促癌細胞轉移的主要因素,針對腫瘤微環境(TME)治療是一個熱門且極具前景的領域[3]。本綜述以結直腸癌肝轉移(CRLM)為例,結合肝臟免疫反應、肝臟微環境和臨床試驗,探討MLC免疫微環境的調控,旨在通過TME預防和治療MLC。

1 肝臟獨特的免疫微環境決定了轉移性癌細胞的命運

1.1 肝臟的先天性固有免疫應答 肝臟免疫系統已經進化到從門靜脈進入肝臟,對外界刺激無反應的階段。當被急性抗原攻擊時,肝臟可啟動并維持有效的免疫反應,如轉移性癌細胞進入肝臟啟動免疫反應。一旦進入肝臟,癌細胞就會遇到一個多樣而獨特的細胞內環境。它還在抗原呈遞和對病原體、入侵細胞的反應中發揮重要作用。肝臟中NK細胞數量最多,占所有肝淋巴細胞的1/2[4]。這些在其他組織中很少發現的固有細胞,通過篩選缺乏細胞標記的靶點,在對抗感染和清除癌細胞中發揮著關鍵作用。此功能可識別下調抗原呈遞分子(如MHC-I)的病原體和癌細胞,作為逃避適應性免疫的機制并清除它們。肝臟中還有一個獨特的NK細胞群,即恒定NK T細胞群(iNKT)。這些細胞來源于胸腺CD4-CD8-雙陰性前體,發育成CD4+CD8+雙陽性細胞,分布于肝、脾、肺等器官[5]。在肝臟中,它們過表達趨化因子受體CCR5和CXCR3,并介導趨化因子受體向炎癥部位募集。正常情況下,iNKT細胞獨立于血流并沿著血竇壁爬行尋找配體。當被激活時,它們可通過結合內皮細胞和巨噬細胞上的CD1d分子牢固地粘附在LSEC上,并獲得效應產生強烈的抗腫瘤作用。

除常駐KC細胞外,表達CCR2、Ly6C單核細胞也從骨髓中招募以響應炎癥觸發。肝臟病態下,可發現這些細胞數量增加,在CCR2-/-小鼠中,它們的缺失被證實可使炎癥減輕[6]。中性粒細胞也被募集至肝臟炎癥部位,中性粒細胞表達CD44、siglec-9[7]、siglec-10[8]和VLA4,介導與LSEC上血管粘附分子粘附。

1.2 肝臟的獲得性適應性免疫應答 肝臟的免疫反應獨特適應并平衡了對來自腸道的食物和微生物抗原的沖擊,同時保持著對威脅生命的病原體和入侵癌細胞的反應,該平衡作用通過抗原呈遞細胞(APC)來實現。非病態下,APC被編碼為觸發T細胞擴增而誘導免疫耐受,而無細胞毒性[9]。這種T細胞無反應狀態可以解釋肝移植的相對成功以及由HBV、HCV引起的慢性肝炎[10]。LSEC可將抗原呈遞給T細胞,它們表達PD-L1且在抗原存在時呈遞抗原導致免疫細胞衰竭。對無細胞毒性T細胞表達的PD-1無反應。LSEC抑制產生干擾素(IFN)的Th1細胞,但促進表達IL-4的Th2細胞生長,從而誘導免疫耐受。

KC細胞是構成肝臟的另一主要APC。KC表達清道夫受體、toll樣受體(TLR)、核苷酸結合寡聚化域樣受體和其他受體,用于感知、內化病原體和凋亡細胞[11]。它們位于肝竇內,是與募集到肝臟的T細胞相互作用的最佳場所。這種相互作用基礎條件下不會引起T細胞活化,可能與MHC-II分子、共刺激分子B7-1和B7-2表達低于其他APC(如DC)有關。此外,KC抗原呈遞可導致PD-L1上調和免疫抑制分子釋放[11]。在炎性因子、PolyI:C或病原體相關分子(如TLR3和TLR9配體)存在下,KC可轉化為T細胞激活APC,在這些條件下MHC-II類分子表達增加。此外,KC還能有效激活iNKT,從而有助于抵抗非MHC表達細胞的反應性。該情況下,KC可能由不同發育和壽命的亞細胞群組成。因此,這些細胞可能代表具有不同抗原呈遞能力的細胞亞群[12]。

樹突狀細胞(DC)是淋巴系統經典APC。肝臟中已鑒定出幾種亞型,即CD11b+、CD11chigh、CD1c+、髓系DC(mDC)和CD123+、漿細胞樣DC(pDC)。小鼠中還發現了另外兩種淋巴相關DC,即CD11c+CD8+DC和 CD11c+NK1.1+DC,目前它們的作用尚未完全清楚[9-11]。肝源性mDC和pDC是較差的T細胞激活劑,因為它們會產生IL-10以及T細胞不刺激其增殖。髓源性祖細胞分化產生高水平IL-10,但低水平IL-12的肝DCs部分受肝基質源性巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)調節[13]。

此外,pDC還產生IL-27和IDO,它們是已知的抗炎介質,分別通過誘導Treg和代謝色氨酸來抑制T細胞活性。發現肝臟pDC表達低Delta4/Jagged1 Notch配體比率,傾向于Th2細胞分化/細胞因子產生,并促進CD4+T細胞凋亡。Tregs也能導致pDC較差的T細胞活性和肝固有免疫耐受。另外,肝臟pDC表達PD-L1,且與LSEC類似,可通過PD-1參與誘導T細胞耗竭。人DC脂質含量也有助于確定其是否具有免疫原性或耐受性,低脂質含量易產生耐受性。盡管肝臟mDC和pDC抗原呈遞可抑制T細胞活化,而CD11c+CD8+DC會產生Th1型反應,導致IL-12和TNF-α的產生。CD11c+NK1.1+DC細胞具有溶細胞活性,可產生T細胞活化的細胞抗原,且可產生激活免疫T細胞的細胞因子。因此,肝臟中T細胞活化和細胞毒性T細胞(CTL)的產生取決于局部 DC 種群之間的活性平衡。肝細胞還可將抗原呈遞給初始T細胞,并在MHC-II抗原下誘導適應性T細胞免疫。這被認為是一種針對感染性顆粒,尤其是病毒的保護機制。然而,它們是否對入侵癌細胞產生免疫反應尚不清楚[14]。最后,位于Disse空間并持續暴露于血源性抗原的HSC也可表達MHC決定簇并將抗原呈遞給T細胞。然而,與肝臟其他APC相似,HSC的抗原呈遞通過PD-PD-1/PDL-1途徑和IL-6、IL-10、TGF-β產生導致免疫抑制[15],并通過誘導Treg細胞來完成。此外,HSC還可以CD44依賴性方式將血液中單核細胞轉化為髓源性抑制細胞(MDSC),從而增加免疫抑制。

總之,雖然多種肝細胞類型可將抗原呈遞給循環T細胞,但這可能會導致免疫抑制。這取決于促免疫原性和抗免疫原性反應之間的平衡。

2 肝臟的促轉移性腫瘤微環境

2.1 KC在癌細胞轉移中發揮的作用 KC參與膽固醇代謝、病原體清除和局部免疫誘導等肝內活動。卵黃囊前體KC祖細胞在胚胎發育早期植入肝臟,并在肝臟中持續補充以維持正常的內環境穩態。然而,在廣泛損傷、輻射或感染后,這些天然細胞可能被骨髓前體細胞所取代[12]。成熟KC通過各種受體檢測、結合和內化病原體及相關分子。隨后它們被激活,產生細胞因子和趨化因子,提醒其他免疫細胞注意有害病原體,充當免疫哨兵角色[14]。

KC甚至可在癌細胞進入肝臟之前促進轉移,因其有助于形成擴張性轉移。Costa-Silva等[16]描述了胰腺癌模型中的復雜相互作用,其中KC吸收并響應癌細胞釋放含有巨噬細胞遷移抑制因子的外泌體,導致其釋放TGF-β并誘導由HSC分泌的纖連蛋白合成。該過程支持癌細胞歸巢至肝臟,以及轉移、粘附和生長。另一項研究中,循環腫瘤細胞通過Talin-1粘附在肝血管腔側的纖連蛋白沉積物上,Talin-1是粘著斑的主要成分,可增加轉移灶的形成[17]。一旦癌細胞進入肝臟,KC發揮雙重作用,介導相反的促轉移和抗轉移。轉移早期,它們清除并殺死循環腫瘤細胞,但隨后促進轉移生長。Wen等[18]在肝轉移試驗中注射癌細胞之前從小鼠中去除KC,發現腫瘤集落形成顯著增加。此外,血竇中的循環腫瘤細胞可粘附在KC上以啟動吞噬作用。已知配體如吞噬識別靶點Dectin-2可能介導KC對癌細胞的吞噬作用,但也記錄了Dectin-2獨立吞噬作用[19]。癌細胞在被吞噬時是否存活仍然未知。KC可通過產生細胞毒性水平的NO來殺死停滯的癌細胞。此外,它們促進NK介導的循環腫瘤細胞殺傷。NK細胞耗竭明顯減少了腫瘤細胞對KC的粘附。是否由癌細胞生存能力下降所致尚不清楚,但似乎是一個合理的解釋。KC可被激活以分泌TNF-α,在足夠濃度下具有殺瘤作用。因此,KC可在外滲前導致循環腫瘤細胞的死亡和吞噬,并限制其轉移。如前所述,KC還具有重要的免疫作用,包括可能不利于進一步轉移的抗原呈遞。

KC衍生的細胞因子可能有益于在KC初始攻擊后存活并成功滲出的癌細胞。接種癌細胞后,骨髓來源的骨髓細胞可能會產生重大影響。值得注意的是,KC在轉移中的作用很大程度上取決于KC的消耗量。然而,由于主要的KC消耗技術利用了其吞噬功能,這些技術也去除了其他吞噬細胞。因此,在其他不同骨髓細胞群的募集和參與之前,在轉移早期可很好地評估KC的具體作用。

2.2 中性粒細胞在癌細胞轉移中的作用 癌細胞進入肝臟引發的最早病變之一是中性粒細胞的募集。通常,中性粒細胞被募集到炎癥部位,它們沿著血管內皮表面滾動離開血流。炎癥狀況下,由于促炎趨化因子的釋放,中性粒細胞表面的碳水化合物配體與內皮表面誘導的P和E選擇素結合相對較低。這種滾動之后中性粒細胞整合素激活,后由高親和力相互作用觸發中性粒細胞停滯。該外滲模式似乎在肝小靜脈后毛細血管中起作用,但與CD44-HA相互作用被認為在血竇中不起作用[20]。與KC類似,腫瘤相關中性粒細胞(TAN)可同時具有促轉移和抗轉移功能。據報道,中性粒細胞參與在CRLM中具有促腫瘤作用,首先,中性粒細胞/淋巴細胞比率增加與結腸癌轉移進展的加快有關,當考慮中性粒細胞絕對數水平時,數據又是相互矛盾的[21]。研究表明,中性粒細胞總數越多,預后越差[22]。

實驗模型中,中性粒細胞已被證明可促進肝轉移級聯反應中的幾個步驟。胰腺癌基因工程小鼠模型(GEMM)中,它們的存在被證明有助于肝轉移前生態位的形成。中性粒細胞胞外殺菌網的產生可大大增強癌細胞在肝轉移早期的駐留。一旦MLC形成,中性粒細胞可進一步加速癌細胞生長。Gordon-Weeks等[23]證實,腫瘤條件下的中性粒細胞可產生FGF2并促進肝臟轉移性生長。阻斷FGF2可降低小鼠肝細胞集落建立數周后的轉移負荷。中性粒細胞也影響適應性免疫,在MLC的GEMM模型中,中性粒細胞影響由CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫,而中性粒細胞可具有不同的分化狀態,且有不同的抗腫瘤或促腫瘤功能[24]。這些稱為N1和N2的功能狀態可受TGF-β和IGF1的影響。因此,中性粒細胞浸潤可在該過程的不同階段促進轉移進展。

2.3 單核/巨噬細胞和骨髓來源抑制細胞(MDSC)被招募至轉移部位 包括巨噬細胞和MDSC的骨髓細胞也被募集至肝臟,它們通常可促進轉移集落擴大。與正常肝臟相比,CRLM中巨噬細胞的數量增加,且CRC患者循環單核細胞數量增加與不良預后相關[25]。募集的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)通常促進MLC生長,耗竭時減小轉移性集落的大小。多種趨化因子能募集這些促轉移巨噬細胞,阻斷其作用可減少轉移性生長。Kitamura等[26]將CCL9和CCL15確定為不同CRC細胞分泌的趨化因子,能募集CCR1+巨噬細胞,阻斷CCR1可減少巨噬細胞募集和肝轉移性生長。

TAM能以免疫依賴和獨立的方式促進癌細胞轉移性生長。其巨噬細胞促血管生成并攜帶VEGFR1受體,使其對腫瘤源性VEGF產生反應;巨噬細胞也對癌細胞產生的補體作出反應。結腸癌細胞產生一種活性形式的補體因子C5a,可與巨噬細胞上C5a受體結合導致更多的巨噬細胞募集,從而使它們極化為M2樣表型,促進轉移性生長。相反,缺乏C5aR可導致M2巨噬細胞數量減少和肝轉移負荷減少[27]。

胰腺癌模型中,MLC內巨噬細胞分泌顆粒蛋白,激活HSC并將其轉化為產生ECM的肌成纖維細胞,從而促進轉移性生長。Lim等[28]研究了巨噬細胞是否改變轉移癌細胞的基因表達,以及這些變化是否影響肝臟轉移性生長。MLC小鼠巨噬細胞的耗竭導致癌細胞中S100A8和S100A9表達增加并降低ANGPTL7的表達。當癌細胞與從MLC中分離的巨噬細胞共培養時,也觀察到相同的現象。癌細胞中S100A8或A9下調降低了它們產生MLC的能力,并沒改變它們的皮下生長,表明該作用具有肝臟特異性。相反,ANGPTL7表達上調降低了癌細胞形成MLC的能力。因此,巨噬細胞可能直接改變體內癌細胞表型,影響其肝轉移能力。

肝轉移瘤缺氧可增強巨噬細胞促轉移作用。HCC模型中,Zhang等[29]發現在缺氧和壞死環境中分別增加HIF1-α和TLR4表達,導致巨噬細胞產生的IL1-β增加。這反過來又誘導ECM并增加了HCC細胞轉移,表明之前存在肝病變可改變MLC生長。在肝硬化小鼠中,實驗性MLC顯著增加,接種量更大,NO水平降低。Ohashi等[30]發現在喂食高脂飲食的小鼠中,肝轉移也增加,導致非酒精性脂肪肝(NAFLD)。NAFLD小鼠肝臟巨噬細胞浸潤增加,且這些巨噬細胞具有M2特征。NLRC4缺失小鼠對脂肪飲食無反應,且轉移能力增加。如上所述,NAFLD患者肝臟高表達IL1-β,這也促進了HCC模型中的肝轉移[28,29]。

如何有效部署靶向巨噬細胞的藥物,在轉移級聯過程中區分常駐巨噬細胞和源自循環單核細胞的巨噬細胞是非常重要的。腫瘤分泌組可能會改變巨噬細胞群,使其更加均一、廣泛地促腫瘤。van de Laar 等[31]的一項研究表明,卵黃囊、肝和骨髓來源的單核細胞在肺定植后在轉錄和功能上變得相同。相反,Pyonteck等[32]對腦小膠質細胞中的CSF1R阻斷表現出不同的反應,表明巨噬細胞起源會影響其功能。

募集到轉移部位的MDSC通過抑制先天免疫細胞和阻礙適應性T細胞介導的免疫,導致免疫抑制。MDSC構成粒細胞和單核細胞前體的異質群體,并被LSEC、KC和(或)HSC衍生的趨化因子募集到肝臟中。在雌小鼠中,它們在肝臟TME中的積累被證明受雌激素的調節,且需要TNFR2表達[33],表明它們的募集在雄性和雌性中可能受到不同的調節。Wang等[34]使用免疫抑制小鼠進行人類癌細胞的實驗轉移,腫瘤源性VEGF刺激巨噬細胞分泌CXCL1,從而誘導促腫瘤MDSC募集到轉移前生態位。Lin等[35]還發現MDSC募集到轉移前生態位導致肝轉移增強。在該模型中,與1-磷酸鞘氨醇受體1激活相關的STAT3信號導致 IL6分泌和MDSC募集。然而,在TME內阻止MDSC分化為成熟中性粒細胞或巨噬細胞的因素仍有待闡明[36]。此外,這些骨髓來源的細胞通常根據細胞表面標志物CD11b的表達以及粒細胞和單核細胞標志物Ly6G和Ly6C之間的差異來鑒定。由于缺乏特異性標記阻礙了它們的充分表達,因為TAM和TAN很可能與MDSC具有重疊的特征和功能[36]。

3 臨床試驗:靶向腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和骨髓源性抑制細胞(MDSC)

TAM和MDSC有助于MLC的免疫耐受,因此成為了越來越多治療的主要靶點。集落刺激因子1(CSF1)及受體(CSF1R)是巨噬細胞分化、募集和存活的關鍵。CSF1R抑制劑能減少CD68+和CD163+巨噬細胞向正常肝臟募集。此外,CRC小鼠模型中,CSF1R抑制增加了細胞毒性T細胞數量并減少了TME中FoxP3+Treg[37]。當單獨使用時,CSF1R定向療法的臨床活性有限[38]。但改變了免疫微環境的能力,為PD-1、PD-L1抑制劑或化療中添加CSF1R抑制劑提供了依據。臨床I期研究(NCT02777710),PD-L1抑制劑德瓦魯單抗與CSF1R TKI培西達替尼聯合治療晚期結直腸癌或胰腺癌患者,結果顯示,雖沒有患者達到臨床療效,但21% 患者病情穩定至少2個月[39]。

在晚期癌癥中靶向TAM和MDSC的第二種方法是阻斷它們被招募到TME。CCL2、CXCL12和CCL5等趨化因子可促進TAM或MDSC侵襲至肝臟。CCL2在初級CRC實驗模型中表達預測了MLC的發展。在CRLM小鼠模型中,與野生型小鼠相比,CCR2缺失減少了TAM向肝臟的侵襲,增加了CD8+、CD4+腫瘤浸潤淋巴細胞,并提高了存活率[40]。這一陽性結果激發了對轉移性患者CCL2和CCR2抑制劑的研發。一項單臂試驗將CCR2拮抗劑CCX872與FOLFIRINOX聯合用于局部晚期或轉移性胰腺癌患者。約1/3患者在18個月內存活,這與單用FOLFIRINOX方案相比具有優勢[41]。另一項多臂試驗將CCR2/CCR5雙重拮抗劑BMS-813160添加到轉移性胰腺癌或CRC患者的化療、免疫或兩者聯合組中(NCT03184870),目前仍在進行中。CXCL12及其受體CXCR4也在促進免疫抑制性骨髓細胞向肝臟TME遷移方面發揮作用[42]。在種植CRC細胞的小鼠中,CXCR4抑制減少了轉移灶處MLC和MDSC積累的數量和大小[43]。阻斷PD-1可能會增強CXCR4抑制劑的抗腫瘤療效。在MC-38鼠結腸癌模型中,該組合增加了TME中CD8+ T細胞相對于Treg和MDSC的比例,并導致腫瘤更顯著的縮小[44]。一項多中心試驗評估了BL-8040(一種CXCR4 抑制劑)聯合FOLFIRI和帕博麗珠單抗在基于吉西他濱的化療進展后的轉移性胰腺癌患者中的安全性和有效性;15例患者中有4例達到部分緩解,另外8例患者病情穩定[45]。其他聯合試驗(NCT02907099)將提供關于采用針對先天性和適應性免疫方法治療MLC患者策略的臨床療效的進一步數據。

CCL5/CCR5軸也是轉移性生長的重要因素,不僅可將MDSC從骨髓募集到血液循環中,還可刺激TME中的M2巨噬細胞極化[46]。CRLM中CCR5的免疫組化染色與不利的免疫環境相關,包括較高的Treg:CTL比率和增加的PD-1和CTLA-4表達[47]。CRLM的臨床前數據表明,TME中的CCL5分泌增加了TAM產生的MMP,并促進腫瘤生長。此外,CCR5抑制劑maraviroc通過將TAM導向產生IFN的抗腫瘤表型來消除該作用。基于此,啟動了使用馬拉韋羅治療CCR5+和難治性mCRC MLC患者的I期試驗(MARACON)。雖沒有初始臨床反應,但接受后續化療的11名患者中有3例表現出部分緩解[46]。為了增強CCR5抑制劑的抗腫瘤效果,目前已有2項研究(NCT03274804、NCT03631407)正評估微衛星穩定(MSS)mCRC患者中CCR5阻斷與PD-1抑制劑的聯合。

其他幾種藥物能將TAM導向抗腫瘤表型,以防止肝臟和其他遠處轉移。CD47是一種普遍表達的細胞表面標志物,可作為“不被吞噬”的信號[47],向存在于巨噬細胞上的同源受體SIRPα發出信號。許多實體瘤表達CD47,從而可逃避吞噬作用和有效的腫瘤免疫監視[48]。實驗模型中,前列腺癌細胞中CD47的外源表達增加了MLC,在小鼠胰腺癌模型中,CD47抑制劑減少MLC[49]。許多研究(NCT04257617、NCT03763149、NCT03834948)CD47抑制劑單獨治療晚期實體瘤或聯合治療的I期研究(NCT02953782、NCT02890368)正在進行中。

CD40激動劑還可激活巨噬細胞以抑制腫瘤生長。樹突狀細胞和巨噬細胞上CD40受體的表達和激活通過T細胞依賴性和獨立機制促進免疫反應[50]。重要的是,這類藥物可刺激巨噬細胞產生IFN和重塑ECM,將CD40激動劑添加到化療或免疫療法中的聯合策略很有希望[50]。一項Ib期試驗評估了吉西他濱、白蛋白結合型紫杉醇和CD40激動劑聯合或不聯合納武利尤單抗在轉移性胰腺癌患者中的應用,總體緩解率為58%[51]。其他具有刺激M1巨噬細胞極化能力的臨床前數據藥物包括Toll樣受體激動劑、PI3Kγ抑制劑和Ⅱa類組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑[52,53]。STAT-3和I類HDAC抑制劑可改變MDSC的免疫抑制活性,也可能在克服MLC的免疫耐受背景方面發揮作用[54,55]。這些藥物單獨或聯合使用對Ⅳ期癌癥和MLC患者的活性還有待確定。

肝臟微環境對轉移性癌細胞的反應是高度復雜和多因素的。肝臟免疫系統被編程為低反應性,且這種免疫無反應狀態被MLC募集的骨髓和淋巴細胞進一步增強,這些細胞在TME內獲得免疫抑制和促轉移特性。這種普遍的耐受狀態可導致局部轉移的進一步擴大,也可導致全身性后果,表現為MLC患者對免疫療法反應不佳。為了對抗這種腫瘤允許的免疫微環境,多管齊下的治療方法將是不可缺少的。目前正努力擴大免疫療法在包括MLC在內的耐藥環境中的療效。其中一些方法顯示出光明的前景,特別是將幾種基于免疫的方法或免疫聯合化療或靶向藥物的方案。此外,即使使用VEGF和PD-1抑制劑等有效的新方案來治療晚期癌癥,仍有一部分患者無反應,而基于免疫的全方位方法確定預測性生物標志物是一項長期的挑戰。在某些癌癥中,單藥PD-1/PDL-1阻斷不會產生有效的免疫反應。隨著對免疫系統在TME中的作用的不斷了解,特別是在肝臟中,聯合策略必是未來治療的方向。針對先天性和適應性免疫系統的免疫抑制細胞、肝臟獨特的免疫微環境和血管生成抑制劑的療法,特別是與檢查點抑制劑聯合使用時,可能被證明對治療MLC患者非常有效。